Tipos de microscópios ópticos e sua aplicação na observação de microrganismos

Figura 4.9 Especificações encontradas no corpo de uma objetiva do microscópio óptico.

 

Tipos de microscópios ópticos e sua aplicação na observação de

microrganismos

 

Microscópio óptico composto de campo claro

 

O microscópio óptico composto de campo claro é o mais utilizado para a observação de microrganismos. No entanto, a observação de material biológico nele exige a utilização de métodos de coloração (simples ou diferencial). É claro que a qualidade da imagem, mesmo corada, visualizada ao microscópio de campo claro vai depender muito do tipo de lentes que foram adaptadas a esse aparelho. Para a observação de microrganismos indica-se o uso de lentes de 10×, 40×, 63× e 100× e lentes oculares de 10× de aumento. De preferência, as lentes devem ter NA de valores altos, por exemplo, 0,95 para objetivas secas e 1,4 para objetivas de imersão em óleo. Figura 4.10 Tipos de colorações utilizadas em microscopia óptica.

A observação de amostras biológicas ao microscópio de campo claro, conforme citado anteriormente, deve ser feita após algum tipo de coloração da amostra utilizando diversos tipos de corantes. Basicamente, existem corantes simples e corantes específicos que são utilizados para distinguir diferentes tipos de material (lipídios, carboidratos ou proteínas) ou

associação de diferentes materiais (Figura 4.10).

Precedendo à coloração propriamente dita, é necessária a confecção de lâminas com os microrganismos a serem analisados. Os microrganismos são, na maioria das vezes, colocados sobre as lâminas de maneira concentrada, formando um esfregaço. Os cuidados com a preparação do esfregaço serão descritos a seguir.

 

▶ Preparo para as colorações

 

Embora seja um método simples e de rápido preparo, é necessário o conhecimento de algumas regras básicas para que as amostras tenham boa qualidade, permitindo boa coloração, observação ou mesmo a obtenção de imagens ou fotomicrografias.

 

▶ Preparo das lâminas de vidro. A limpeza das lâminas histológicas é imprescindível para a confecção de um bom esfregaço. Elas devem estar completamente livres de gordura, e para isso são normalmente lavadas com água e sabão, enxaguadas exaustivamente em água e deixadas em um recipiente com etanol a 95%. Antes da utilização, as lâminas devem ser retiradas do recipiente com uma pinça e secas com papel-toalha ou pano bem macio que não solte fiapos (p. ex., tecido de algodão do tipo fralda).

▶ Preparo do esfregaço. Microrganismos podem ser cultivados em meio líquido ou sólido, e para isso as amostras que serão utilizadas para fazer o esfregaço devem ser manipuladas de forma diferente. Se os microrganismos estiverem sendo cultivados em meio líquido e apresentarem uma boa taxa de crescimento, deve-se retirar do tubo de cultura, com o auxílio de uma alça de platina, 1 a 3 gotas de meio e colocar sobre uma lâmina previamente limpa. Se a cultura não tiver uma grande quantidade de células, pode-se separar, em um tubo de ensaio, alguns mililitros da cultura, centrifugar e ressuspender em menor quantidade de meio. Caso os microrganismos estejam em meio sólido, deve-se colocar previamente 1 a 2 gotas de solução salina estéril sobre a lâmina de vidro previamente limpa, recolher com a alça de platina uma pequena porção do crescimento de microrganismos e diluir na gota de salina, espalhando as células com movimentos circulares. A concentração de células não deve ser excessiva em nenhum desses casos descritos. O esfregaço deve secar completamente. Atenção: não se deve assoprar sobre o esfregaço ou balançar a lâmina ao ar, pois outros microrganismos podem contaminar a amostra.

▶ Fixação pelo calor. Para fixar perfeitamente as células sobre a lâmina de vidro, é necessário aquecê-la, fazendo, então, a fixação do esfregaço pelo calor e evitando que os microrganismos sejam perdidos durante as colorações e sucessivas lavagens. A fixação pelo calor pode ser feita passando-se a lâmina de vidro contendo o esfregaço seco ao ar 3 vezes

sobre a chama do bico de Bunsen (Figura 4.11).

 

▶ Coloração simples

 

Pode ser positiva ou negativa, conforme descrito a seguir.

 

■ Coloração simples positiva

 

Este tipo de coloração utiliza apenas um único corante para constatação

da presença de microrganismos em alguma amostra ou substrato (Figura

4.12). É baseada na utilização de corantes carregados positivamente que se ligam às cargas negativas da superfície de células e de material nucleico.

No Quadro 4.1 encontram-se descritos os corantes simples mais utilizados.

Para protozoários utiliza-se muito a coloração de Giemsa. O corante é comprado concentrado e deve ser diluído em água para uma concentração

de 20%. Deve-se aplicá-lo como descrito na Figura 4.12. Esse tipo de coloração permite apenas a visualização da forma do protozoário, o que em alguns tipos de estudo já é suficiente para determinar a forma evolutiva que

se está observando ou mesmo separar diferentes gêneros (Figura 4.13).

Figura 4.11 Etapas do preparo do esfregaço para coloração em microbiologia.

Figura 4.12 Coloração simples positiva.

 

Quadro 4.1 Corantes utilizados em coloração simples positiva.

 

Tipo de corante básico Incubação

 

Azul de metileno 1 a 2 min

 

Cristal violeta 20 a 60 s

 

Carbolfucsina 15 a 30 s

 

■ Coloração simples negativa

 

Neste caso, o corante é acídico e repelido pela carga negativa da superfície de células. A lâmina de vidro sobre a qual está o material ficará corada enquanto o microrganismo aparecerá mais claro, dando a ideia de

um negativo fotográfico (Figura 4.14). Esse tipo de coloração tem sido muito utilizado para a demonstração de cápsulas mucoides que envolvem algumas espécies de bactérias. Para esse tipo de coloração podem ser utilizadas tanto a tinta nanquim quanto a nigrosina. Como elas não penetram no microrganismo, a coloração deve ser feita misturando-se o microrganismo diretamente ao corante sem aquecimento, o que poderia danificar o material capsular que é extremamente hidratado. É interessante notar que a aplicação dessa técnica a qualquer tipo fornece a melhor qualidade de preservação estrutural, uma vez que o material não é seco ao ar nem fixado à lâmina pelo calor, o que causa comprovadamente alterações conformacionais. No caso da detecção de cápsulas, a coloração negativa é importante, pois evita a solubilização do material capsular, que é solúvel em água, durante os processamentos rotineiros de coloração com outros corantes. A presença de cápsula em bactérias está normalmente associada à virulência, pois a protege contra adesão, fagocitose e destruição por células do sistema imune, como macrófagos.

Figura 4.13 Coloração simples positiva. A. Esfregaço da forma tripomastigota do Trypanosoma cruzi corada pelo corante de Giemsa. A coloração mostra estruturas do parasito, como o cinetoplasto (C), o núcleo (N) e o flagelo (F), cujas forma e localização servem para a diferenciação entre as diferentes formas evolutivas do parasito. B. Esfregaço de sangue humano corado pelo corante de Giemsa para identificação de trofozoítos jovens de Plasmodium falciparum no interior de hemácias (setas).

 

Figura 4.14 Coloração negativa do fungo Cryptococcus neoformans utilizando a tinta nanquim. Nota-se que o fundo da lâmina se apresenta mais escuro que o microrganismo. (Foto: Leonardo Nimrichter.)

 

A tinta nanquim deve ser utilizada na concentração em que é comprada, enquanto a nigrosina deve ser preparada segundo este protocolo:

■ Dissolva 10 g de nigrosina em 100 mℓ de água destilada

■ Ferva durante 10 minutos; deixe esfriar

■ Adicione 0,5 mℓ de formaldeído a 37% (formalina).

■ O material poderá ser analisado entre lâmina e lamínula ou seco ao ar,

utilizando a objetiva de imersão (Figura 4.15).

 

▶ Coloração diferencial

 

Neste tipo de coloração são empregados dois corantes contrastantes que vão gerar colorações diferentes em grupos distintos de bactérias. As colorações diferenciais são utilizadas para: (a) separação de diferentes grupos de bactérias; (b) visualização de estruturas particulares de alguns grupos de bactérias. No primeiro caso, as duas colorações diferenciais mais utilizadas para classificação de bactérias são o método de Gram e a coloração de resistência ao álcool-ácido (Ziehl-Neelsen). No segundo caso, podemos citar a coloração de endósporos, também conhecida como técnica de Schaeffer-Fulton, o método de Leifson para coloração de flagelos e a coloração de cápsulas. Nesse tipo de coloração os corantes se ligam somente a determinadas porções de uma célula, facilitando sua identificação.

 

■ Coloração de Gram

 

Desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista Hans Christian Gram, é a coloração diferencial mais utilizada em bacteriologia. Ela separa as bactérias em dois grandes grupos: as gram-positivas (Gram+) e as gram-negativas (Gram–). Apesar de ser o método de escolha para a identificação de bactérias, somente deve ser utilizado em bactérias em fase de crescimento. A observação de material corado pela técnica de Gram é importante não só para acompanhar o isolamento de amostras como também para determinar o tipo de antibiótico que deve ser utilizado em

diferentes infecções (Figura 4.16).

 

Figura 4.15 Sequência de procedimentos utilizados na coloração negativa para bactérias. A. Coloque uma gota de nigrosina ou tinta nanquim em uma das extremidades da lâmina. B. Recolha do meio de cultura um inóculo com a alça de platina e misture à gota de corante. C. Coloque uma outra lâmina sobre a mistura das células e corante e deixe que o material se espalhe na extremidade da lâmina inclinada. D. Deslize a lâmina inclinada sobre a outra lâmina, espalhando as células e o corante de maneira uniforme.

 

Neste tipo de coloração são utilizados quatro reagentes diferentes, como

está descrito nas Figuras 4.17 e 4.18. O preparo das amostras é rápido e se inicia com a coloração de um esfregaço de células fixado a uma lâmina histológica pelo calor, com o corante cristal violeta que cora as células com cor púrpura. Este corante se impregna em todas as células, e essa primeira coloração é denominada coloração primária. Logo depois, as células são recobertas por uma solução de iodo que age como um mordente, que é qualquer substância que forma um complexo insolúvel quando se liga ao corante primário.

Figura 4.16 Coloração de Gram. A. Bacillus subtilis gram-positivos, em forma de bastão. B. Escherichia coli gram-negativa, em forma de bastonete.

Figura 4.17 Preparo das substâncias utilizadas na coloração de Gram.

 

Figura 4.18 Sequência de procedimentos utilizados na coloração de Gram. A. Core o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto. B. Remova o corante com água destilada. C. Coloque a solução de lugol sobre o esfregaço durante 1 minuto. D. Remova a solução de lugol com água destilada. E. Lave o esfregaço com etanol 95% até que o etanol que escorre da lâmina fique transparente. F. Remova o etanol com água destilada. G. Adicione a safranina durante 45 segundos. H. Remova a safranina com água destilada. I. Seque com papel-filtro.

A seguir, as lâminas contendo o esfregaço de células são lavadas com etanol 95% (agente descolorante), que descora seletivamente alguns tipos de células. O álcool é então removido por lavagem em água, e as células são coradas por um segundo corante, a safranina, um contracorante, sendo sua coloração bem diferente daquela dada pelo cristal violeta. As bactérias denominadas gram-positivas adquirem cor púrpura (roxo), enquanto as

gram-negativas apresentam coloração cor-de-rosa (ver Figura 4.16).

O princípio da técnica está baseado na diferença de composição da parede de diferentes bactérias e na capacidade de essas paredes reterem os corantes utilizados. Sabemos hoje que as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular mais espessa e diferente da parede das bactérias gram-negativas. A princípio, os dois tipos de células se coram pelo cristal violeta associado ao iodo. O complexo formado pelo cristal violeta e pelo iodo se liga a componentes presentes na parede das bactérias positivas, que possuem na sua composição magnésio e ácidos ribonucleicos. Essa ligação forma um complexo (Mg-RNA-CV-I) de difícil remoção. Durante a utilização do álcool é que a diferença na composição da parede celular das bactérias será de extrema importância para definir os dois grupos de bactérias. O álcool terá duas funções: dissolver lipídios e desidratar as células. O corante associado à parede das bactérias gram-positivas e que possui alto peso molecular não consegue se difundir de volta para o meio externo durante a lavagem com o álcool – a célula permanece corada na cor roxa. No caso das gram-negativas, sabemos que a camada de parede é extremamente mais delgada e que sobre a parede encontramos outra membrana, a externa, de natureza lipídica. Ao utilizar o álcool, a membrana externa das bactérias gram-negativas é solubilizada e, como a camada de parede celular é mais fina, de composição diferente da parede das bactérias gram-positivas, o complexo cristal violeta/iodo é capaz de se difundir, deixando a célula descorada. Quando se aplica o contracorante safranina, as células gram-negativas adquirem a cor rosada do novo corante. ■ Coloração de resistência ao álcool-ácido (método de Ziehl-Neelsen)

 

Esta é a coloração de escolha para a identificação de bactérias do gênero Mycobacterium, por exemplo, as espécies Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, bem como para identificar cepas patogênicas de bactérias do gênero Nocardia. A parede de micobactérias possui uma espessa camada de lipídios (ácido micólico) que evita a penetração de diversos corantes. Por outro lado, quando o corante penetra alcançando o citoplasma da célula, ele não pode ser removido com facilidade, nem mesmo com o uso de agentes descolorantes (mistura álcool-ácido). A célula que permanece corada após a mistura álcool-ácido ter sido aplicada é denominada álcool-acidorresistente, enquanto aquelas que se descoram por não possuírem a mesma composição de parede celular são denominadas

álcool-acidossensíveis (Figuras 4.19 e 4.20).

Uma vez que as espécies M. tuberculosis e M. leprae são patogênicas para humanos, essa coloração é de alto valor diagnóstico.

Algumas modificações e cuidados que devem ser observados durante a

confecção de lâminas com micobactérias estão na Figura 4.20 e descritas a seguir.

No caso do esfregaço, nota-se que é difícil espalhar as micobactérias na gota de água sobre a lâmina, o que se deve à característica hidrofóbica de sua parede. O esfregaço deve ser seco ao ar por 15 a 30 minutos e fixado pelo calor da chama, sobre a qual se deve passar a lâmina de 3 a 5 vezes, por 3 a 4 segundos por vez.

O esfregaço deverá ser recoberto com o corante (carbolfucsina) e colocado sobre uma placa aquecedora morna ou sobre um recipiente com água quente. Atenção para não deixar o corante evaporar. Se necessário, colocar mais corante. A alta temperatura facilita a penetração deste pela parede da bactéria.

Após lavar a lâmina com água, deve-se resfriá-la rapidamente na geladeira ou passá-la sob jatos de água gelada. O resfriamento deixa a camada de lipídios das bactérias álcool-acidorresistentes mais consistente, evitando que o corante saia do citoplasma.

A lâmina é tratada com álcool-ácido que age como um agente descolorante, descorando um grupo de células. As células descoradas são então coradas em azul pelo azul de metileno. Duas populações de cores diferentes surgem após esse tipo de coloração: células vermelhas (álcool-acidorresistentes, como as bactérias do gênero Mycobacterium) e células

azuis (álcool-acidossensíveis) (ver Figura 4.19).

 

Figura 4.19 Mycobacterium tuberculosis corado em vermelho pelo método de Ziehl-Neelsen.

Figura 4.20 Sequência de procedimentos utilizados na coloração de Ziehl-Neelsen. A. Aplique carbolfucsina e aqueça por 5 minutos. Não deixe o corante ferver. B. O corante também pode ser colocado à temperatura ambiente; neste caso, deixe-o em contato com o esfregaço por 10 minutos. C. Resfrie e remova o corante com água destilada. D. Vá adicionando a solução de álcool-ácido gota a gota. A princípio ela removerá o corante. Pare de adicioná-la quando o líquido que escorre da lâmina se tornar transparente. E. Remova a solução de álcool-ácido com água destilada. F. Contracore com azul de metileno por 2 minutos à temperatura ambiente. G. Remova o azul de metileno com água destilada. H. Seque com papel-filtro.

Da mesma maneira como acontece na coloração de Gram, a composição da superfície das células é o fator preponderante na obtenção da coloração. O corante após a lavagem com o agente descolorante apenas continua impregnado em células em cuja composição da parede podem ser encontrados tipos especiais de lipídios.

As soluções utilizadas na coloração de Ziehl-Neelsen podem ser

observadas na Figura 4.21.

 

■ Coloração de endósporos (técnica de Schaeffer-Fulton)

 

Bactérias anaeróbicas dos gêneros Clostridium e Desulfotomaculum e aeróbicas do gênero Bacillus são exemplos de microrganismos que desenvolvem formas de resistência, denominadas endósporos, que se formam no interior da célula vegetativa, sendo liberados com seu rompimento. Uma das características mais importantes do endósporo é a resistência a altas temperaturas (resiste à água fervente por duas horas), congelamento, radiação, dessecação e agentes químicos. Tal resistência se deve à presença de peptideoglicanos no seu envelope externo, que é multilaminar, e de dipicolinato de cálcio no seu interior. Endósporos não se coram facilmente, e os métodos de coloração normalmente utilizam o calor como forma de facilitar a penetração do corante. Uma vez corado, o endósporo retém o corante, enquanto a lavagem remove a coloração das células vegetativas. A identificação de endósporos é muito importante para a indústria alimentícia, na qual normalmente o calor é utilizado como forma

de esterilização (Figura 4.22).

Figura 4.21 Preparo das substâncias utilizadas na coloração de Ziehl-Neelsen.

 

Alguns cuidados que devem ser tomados para a confecção de lâminas

para esta coloração estão descritos na Figura 4.23 e a seguir.

O esfregaço deverá ser feito da maneira usual, primeiramente seco ao ar e posteriormente fixado pelo calor. A lâmina contendo o esfregaço deverá ser recoberta com o corante verde malaquita e colocada sobre uma placa aquecedora morna ou sobre um recipiente com água fervente. Atenção para não deixar o corante evaporar ou ferver. Se necessário, adicionar mais corante. A alta temperatura facilita a penetração do corante através da parede do endósporo.

Figura 4.22 Bacillus megaterium. Coloração de Schaeffer-Fulton para evidenciação de endósporos.

 

Após a coloração com o verde malaquita, tanto o endósporo quanto a célula vegetativa apresentarão cor verde. A água servirá como agente descolorante.

A safranina colorará somente a célula vegetativa de vermelho.

As soluções utilizadas na coloração de Schaeffer-Fulton podem ser

observadas na Figura 4.24.

 

■ Coloração de cápsulas

 

Para corar a cápsula das bactérias, é necessário usar um corante, o cristal violeta, e um agente descolorante, que também age como contracorante, o sulfato de cobre. Por sua grande quantidade de polissacarídeos, a cápsula apresenta solubilidade em água um pouco elevada, o que exige alguns cuidados durante a fixação e a coloração desse material.

Na Figura 4.25 se encontram as principais recomendações para a coloração de cápsulas.

O esfregaço deve apenas ser seco ao ar, pois a fixação pelo calor causa encolhimento da cápsula, dificultando sua observação.

Após a coloração com o cristal violeta, tanto a célula quanto a cápsula apresentam a mesma coloração.

 

Figura 4.23 Sequência de procedimentos utilizados na coloração de Schaeffer-Fulton. A. Aplique a solução de verde malaquita e aqueça por 5 minutos. Não deixe o corante ferver. B. O corante também pode ser utilizado à temperatura ambiente; neste caso, deixe-o em contato com o esfregaço por 10 minutos. C. Resfrie e remova o corante com água destilada. D. Contracore com safranina por 30 segundos à temperatura ambiente. E. Remova a safranina com água destilada. F. Seque com papel-filtro.

Figura 4.24 Preparo das substâncias utilizadas na coloração de Schaeffer-Fulton.

 

Figura 4.25 Sequência de procedimentos utilizados na coloração de cápsulas. A. Coloque a solução de cristal violeta sobre o esfregaço durante 5 a 7 minutos. B. Lave a preparação com a solução de sulfato de cobre. C. Seque com o papel-filtro.

 

Após a coloração em cristal violeta, não lavar em água destilada.

O sulfato de cobre é utilizado como agente descolorante e contracorante. Durante a lavagem o excesso do corante é removido juntamente com o corante que se encontra adsorvido à cápsula. Ao mesmo tempo, o sulfato de cobre se liga à cápsula, gerando uma coloração diferencial. A cápsula aparecerá na cor azul-clara, enquanto o restante das células e o meio a sua volta apresentarão cor púrpura dada pelo cristal violeta.

As soluções utilizadas na coloração para cápsulas estão discriminadas

na Figura 4.26.

 

■ Método de Leifson para coloração de flagelos

A coloração de flagelos se baseia na deposição do corante na estrutura do flagelo. Isto é conseguido com o auxílio de um mordente que nesta técnica é o ácido tânico.

Para que a coloração surta o efeito desejado é necessário que o esfregaço não seja fixado pelo calor.

 

Figura 4.26 Preparo das substâncias utilizadas na coloração de cápsulas.

 

Figura 4.27 Preparo das substâncias utilizadas na coloração de flagelos.

 

O corpo da célula e o flagelo aparecerão corados igualmente apresentando cor vermelho-escura ou azul muito escuro (quase negro). A deposição continuada do corante sobre a estrutura flagelar com o auxílio do mordente aumenta o seu diâmetro, tornando-o visível ao microscópio óptico.

As soluções utilizadas na coloração de Leifson estão ilustradas na

Figura 4.27.

 

Microscopias de contraste

 

Existem diferentes tipos de microscopia óptica que utilizam os fenômenos de reflexão e de difração da luz para gerar imagens visíveis. As técnicas de contraste mais utilizadas em microbiologia são a de campo escuro, a de contraste de fase e a de contraste interferencial diferencial de Nomarsky. As técnicas de contraste são particularmente importantes para o estudo de células vivas. Para esses tipos de microscopias são necessárias alterações nos microscópios de luz convencionais, como lentes objetivas especiais, condensadores e prismas.

 

▶ Microscopia de campo escuro

 

Neste tipo de microscopia, a luz incidente direta é impedida de passar através do espécime. Isso se faz com o uso de um anel especial denominado

anel de campo escuro que é colocado sob o condensador (Figura 4.28). A luz que passa por fora do anel é focada no objeto em um ângulo bastante oblíquo, e somente a luz que é refletida pelo objeto é capaz de alcançar a lente objetiva. A luz não refletida sai juntamente com o cone de iluminação e não alcança a objetiva. Temos assim uma imagem em que o fundo é negro

e os detalhes aparecem brilhantes (Figura 4.29B).

A microscopia de campo escuro é indicada apenas para a observação da movimentação de microrganismos ou de objetos muito pequenos, uma vez que o próprio brilho gerado pelo sistema não permite a observação de detalhes da estrutura.

▶ Microscopia de contraste de fase

 

A microscopia de contraste de fase foi desenvolvida a partir da observação de que o material biológico era capaz de alterar a luz incidente sobre ele, provocando difração. A luz difratada pelo material biológico pode apresentar uma leve alteração do seu comprimento de onda, que gera um retardo de fase de aproximadamente um quarto de comprimento de onda em comparação com a luz que passa através do meio à volta do material

biológico e que não sofre desvio (Figura 4.30). Esse pequeno desvio, no entanto, não pode ser percebido pelos nossos olhos nem mesmo por câmeras fotográficas e filmadoras. A imagem é pálida e sem contraste.

 

Figura 4.28 Diagrama do microscópio de campo escuro. O anel de campo escuro impede a passagem da luz direta através do objeto, criando raios oblíquos que são concentrados pela lente condensadora sob o material a ser observado. Somente os raios refletidos alcançam a lente objetiva.

Figura 4.29 Comparação da imagem obtida de Paramecium aurelia em campo claro (A) e campo escuro (B). A utilização do campo escuro facilita a observação de detalhes da estrutura do microrganismo. (Foto: Inácio Domingos da Silva Neto.)

 

Com base na constatação de que alguns materiais que retardam a onda de luz incidente em meio comprimento de onda podem ser facilmente observados ao microscópio óptico, pois apresentam um excelente contraste em relação ao meio que os envolve, o físico holandês Frits Zernike desenvolveu um método no qual a luz da fonte de iluminação do microscópio que não é difratada poderia ser acelerada ou atrasada em um quarto de comprimento de onda, gerando, desta maneira, uma diferença de meio comprimento de onda em relação à luz naturalmente refratada pelo material biológico. Com uma diferença de meio comprimento de onda, o

material biológico passa a ser observável mesmo sem coloração (Figura

4.31).

Para se acelerar a fase da luz direta, são utilizados discos de fase feitos de materiais especiais. Para se fazer o contraste, é necessária a presença de dois discos de fase, também chamados de anéis de fase. O primeiro é colocado no plano focal anterior do condensador e é denominado anulus. A luz que passa por esse anel chega ao objeto, interage com ele e a luz que não sofre difração chega ao plano focal posterior da objetiva na forma de um anel de luz. A luz que interage com a amostra e é difratada se espalha pelo plano da objetiva e não passa pelo anel. O anel de luz não difratado é então direcionado para o segundo anel, denominado anel de fase, que é formado por regiões mais finas e mais espessas e se encontra no plano focal

posterior da objetiva. (Figuras 4.32 e 4.33).

 

Figura 4.30 A interação da luz direta com o material biológico gera um retardo de fase de um quarto de comprimento de onda. A soma das duas ondas, no entanto, não é capaz de gerar um contraste visível.

Figura 4.31 Observação de microrganismos (Saccharomyces cerevisiae) em um microscópio de campo claro (A) e em um microscópio dotado de um sistema de contraste de fase (B).

 

As lentes objetivas utilizadas para o contraste de fase possuem gravadas em seu corpo as iniciais Ph (phase) e um número ao seu lado que pode ser 1, 2 ou 3. Para cada objetiva de fase é necessário girar o anel que fica no condensador do microscópio para o número correspondente ao indicado na

lente objetiva (Figura 4.32).

A grande vantagem da utilização do contraste de fase em relação à microscopia de campo claro é a facilidade na observação de material vivo ou mesmo fixado sem nenhuma coloração. No entanto, a formação de um halo branco à volta da amostra pode dificultar a observação de detalhes da superfície das células.

Figura 4.32 Caminho óptico da luz em um microscópio de contraste de fase. Os dois anéis colocados no caminho da luz separam e modificam a luz direta e a difratada, provocando um aumento de contraste na imagem final.

 

Figura 4.33 Alinhamento dos anéis de fase no microscópio de contraste de fase. Por meio de dois pequenos parafusos no condensador ajusta-se o anel brilhante em relação ao anel escuro que fica inserido na objetiva. A imagem mostrará o melhor contraste quando os anéis estiverem coincidentes.

 

▶ Microscopia de contraste interferencial diferencial

 

O contraste interferencial diferencial (DIC) une os conhecimentos sobre o poder de difração da luz pelo material biológico com os da polarização da luz. Juntos, fornecem um ótimo resultado que reverte em uma imagem aparentemente tridimensional e com excelente contraste.

Para obter uma imagem em DIC é preciso, primeiro, organizar o feixe luminoso que incide sobre a amostra. A fonte luminosa do microscópio emite luz com vários comprimentos de onda, em várias direções e diferentes planos de vibração. Para se formar a imagem em DIC utiliza-se apenas um plano de vibração da luz que é selecionado no microscópio com o uso de uma peça denominada polarizador que é colocada antes do

condensador (Figura 4.34).

Ao sair do polarizador a luz encontra um prisma, também no condensador do microscópio, que funciona como um material birrefringente, ou seja, separa a luz polarizada em dois feixes perpendiculares entre si (planos) e que viajam em direções ligeiramente

diferentes (Figura 4.35). São estes feixes de luz, trafegando com uma pequena defasagem entre si, que vão encontrar o material biológico cuja característica de difração já é bem conhecida. No espécime, a luz incidente é alterada de acordo com a sua espessura e o índice de difração, causando alterações em ambos os planos da luz incidente. A luz que sai do material apresentando diversas alterações alcança o plano posterior da objetiva, onde outro prisma remove a distância e as diferenças entre os comprimentos de onda que existiam originalmente entre os dois feixes incidentes. As diferenças que restam são aquelas inerentes ao material biológico. Acima do segundo prisma encontramos ainda um analisador que torna os planos de vibração da luz novamente paralelos.

Figura 4.34 A luz polarizada é aquela na qual a vibração das ondas ocorre em um único plano. Para se transformar luz não polarizada em polarizada, utilizam-se filtros de um material plástico especial capaz de bloquear um dos dois planos de vibração das ondas eletromagnéticas. Os filtros são confeccionados com moléculas de cadeias grandes alinhadas dentro no seu interior, na mesma direção vertical. Assim que a luz não polarizada alcança o componente da luz que vibra verticalmente, ele é absorvido pelo filtro, deixando passar o componente perpendicular.

 

Figura 4.35 Esquema de um microscópio óptico equipado com o sistema de contraste interferencial diferencial. As partes do microscópio indicadas na figura interferem diretamente na luz incidente, provocando mudanças no feixe de luz conforme descrito no texto. Observe as linhas pontilhadas no esquema à esquerda. O polarizador seleciona um único plano de vibração da luz. O primeiro prisma separa os dois planos de vibração da luz, formando um ângulo entre si. O condensador condensa os dois planos sobre a amostra. Note que os dois feixes são separados por uma pequena distância. Após passar pela objetiva, os raios ainda em planos diferentes alcançam o segundo prisma, que remove a distância entre os dois feixes e as diferenças de comprimento de onda que originalmente existem no feixe incidente. As alterações que restam são causadas pela amostra. Ao sair do prisma, a luz ainda vibrando em dois eixos entra no analisador que as coloca no mesmo plano, tornando visível a interferência entre eles.

A imagem aparentemente tridimensional obtida pelo método de DIC é provocada por um efeito estereoscópico produzido pela proximidade dos dois raios de luz selecionados. O grau de tridimensionalidade depende do índice de refração das diferentes regiões do espécime e principalmente do limite do espécime com o meio à sua volta. O efeito de borda é bastante notado, o que torna este tipo de microscopia especialmente interessante para

a observação de compartimentos intracelulares (Figura 4.36).

Existem algumas vantagens do DIC em relação ao contraste de fase:

 

■ Pode ser utilizado em material espesso

■ Não há a formação do halo branco à volta da preparação que

impossibilita a análise das extremidades

■ A observação da amostra pode ser feita em diferentes planos de foco

(cortes ópticos). A imagem em foco não sofre interferência dos planos

acima ou abaixo

■ O prisma colocado logo acima das objetivas pode ser regulado para

variar o contraste, a profundidade de campo, o brilho e a cor do fundo

da lâmina.

Figura 4.36 Microscopia óptica de contraste interferencial diferencial (DIC) Nomarski de

leveduras de Saccharomyces cerevisiae. Ao se comparar esta imagem com as da Figura

4.31, percebe-se que aquelas obtidas em DIC mostram com facilidade os limites das células, assim como os seus compartimentos internos.

 

Microscopia de fluorescência

 

A microscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizada na observação de microrganismos. Ela está baseada na utilização de corantes fluorescentes. Tais corantes são capazes de absorver luz de um determinado comprimento de onda, emitindo ao mesmo tempo luz em um comprimento

de onda maior (Figura 4.37). Se a iluminação cessar, cessará também a emissão pelo corante fluorescente. Os corantes fluorescentes podem ser ligados a diversos tipos de moléculas, fazendo com que este complexo molécula–fluorocromo sirva de marcador para algum tipo particular de experimento. Como exemplo de moléculas ligadas a fluorocromos temos anticorpos com os quais são feitos os testes de imunofluorescência; moléculas como albumina e dextrana, que servem para marcar a via endocítica de diferentes tipos celulares; moléculas de natureza lipídica e marcadores de ácidos nucleicos. O uso de marcadores fluorescentes tem como vantagem a grande sensibilidade de marcação, visto que o material marcado pelo fluorocromo emite luz, o que permite pequenas quantidades do marcador serem observadas. Este é o mesmo princípio que explica como vemos partículas de poeira à luz do sol (o chamado efeito Tyndal) – a luz incidindo sobre o grão de poeira, que está abaixo do limite de resolução do nosso olho, é refletida pelo mesmo fazendo com que ele brilhe. O que vemos não é a poeira, mas o brilho da luz. É assim que também vemos as estrelas.

O microscópio capaz de detectar a luz emitida pelos corantes fluorescentes é denominado microscópio de fluorescência. Este microscópio é semelhante ao microscópio óptico convencional. Na verdade, na grande maioria dos casos, o sistema de fluorescência é adaptado a um microscópio óptico que contenha pelo menos o sistema de contraste de fase.

As diferenças básicas entre o microscópio de fluorescência e o de luz

(convencional ou de contraste) estão na fonte de iluminação (Figura 4.38) e nos sistemas de filtros que selecionam tanto a luz que incide sobre o espécime quanto aquela que dele é emitida.

 

Figura 4.37 Microscopia de fluorescência. A. Modo como uma molécula emite fluorescência. Um fóton de uma radiação ultravioleta colide com um elétron do átomo de uma substância fluorescente, excitando-o e colocando-o em um nível de energia mais elevado. Quando o elétron perde a energia adquirida, ele volta à sua órbita original. A energia é perdida na forma de luz, que possui uma energia menor do que aquela que gerou a excitação do átomo. O intervalo de tempo entre a excitação e a emissão da fluorescência é extremamente pequeno, podendo ser menor que um milionésimo de segundo. B. Comprimentos de onda de excitação de diferentes fluorocromos. DAPI: marcador para DNA; GFP: proteína fluorescente verde; FITC, Cy3, Cy5 e Alexa Fluor: série de diferentes flourocromos que podem ser associados a diferentes tipos de moléculas.

Figura 4.38 Fonte de iluminação em microscópios de fluorescência. Um dos tipos mais comuns de lâmpadas utilizadas em microscópios de fluorescência é a lâmpada de arco de mercúrio, também conhecida como HBO (A). Essa lâmpada emite luz com diferentes comprimentos de onda, e os principais picos de emissão são 313, 334, 365, 406, 435, 546 e 578 nm (B).

 

 

Os filtros que agem sobre a luz incidente sobre o espécime são

denominados filtro de excitação e de emissão (Figura 4.39). O filtro de excitação seleciona dentre os vários espectros emitidos pela lâmpada do microscópio de fluorescência o comprimento de onda mais específico para a excitação de um determinado fluorocromo. O filtro de emissão que está localizado após a amostra bloqueia a luz incidente, deixando passar apenas o comprimento de onda emitido pelo fluorocromo. A presença de diferentes filtros em um mesmo microscópio permite que marcações de diferentes cores possam ser feitas sobre a mesma amostra. Os fluorocromos mais utilizados são a fluoresceína (que emite luz verde após excitação por luz azul) e a rodamina (que emite luz vermelha após excitação por luz verde)

(ver Figura 4.37). Famílias de fluorocromos, por exemplo Alexa Fluor, foram desenvolvidas de forma a obter maior brilho e fotoestabilidade.

A modalidade de microscopia de fluorescência mais utilizada em laboratórios de diagnóstico é a imunofluorescência, na qual a marcação de uma determinada molécula é feita com o uso de anticorpos específicos conjugados a fluorocromos. Existem dois tipos de imunofluorescência: a direta e a indireta. Na imunofluorescência direta o fluorocromo é ligado diretamente ao anticorpo específico (anticorpo primário) que reconhece a molécula que se quer detectar. Na imunofluorescência indireta o anticorpo marcado é o anticorpo secundário, ou seja, é o anticorpo que reconhece o

anticorpo primário (Figura 4.40).

 

Microscopia confocal

 

Durante a observação de uma amostra por microscopia de fluorescência podemos ter alguns problemas quanto à nitidez das imagens que obtemos. Muitas vezes, posicionamos o foco em um determinado aspecto do material, mas a fluorescência emitida de outras regiões da amostra acaba por interferir na resolução da imagem que mais interessa. Esta interferência é tão maior quanto mais espessa é a amostra observada (corte de tecido ou espessura da célula). Para evitar esses problemas foi desenvolvido o microscópio confocal a laser. As vantagens sobre o microscópio de fluorescência convencional seriam a pequena profundidade de campo, que elimina a fluorescência das regiões fora de foco, a capacidade de colocalizar secções ópticas de amostras espessas e o aumento de resolução uma vez que a luz incidente sobre a amostra é um feixe de laser monocromático. A microscopia confocal tem ainda a vantagem de poder ser aplicada a amostras vivas ou fixadas e que podem ter sido marcadas com mais de um corante fluorescente.

 

Figura 4.39 Esquema simplificado de um microscópio de fluorescência. Note que a luz que chega à amostra vem lateralmente, atinge o espelho dicroico e é, então, lançada sobre a amostra através da lente objetiva. Esse tipo de iluminação é denominado epi-iluminação. A luz gerada pela excitação do fluorocromo na amostra é projetada para cima, passando também por dentro da lente objetiva para alcançar o espelho dicroico e depois o filtro de emissão, chegando à ocular.

Figura 4.40 Na imunofluorescência direta, o anticorpo que reconhece o antígeno é diretamente ligado ao fluorocromo. A reação de marcação se faz com uma única incubação da amostra na presença do anticorpo primário. Na imunofluorescência indireta faz-se a incubação da amostra com o primeiro anticorpo e, em seguida, uma segunda incubação na presença de um anticorpo secundário previamente conjugado a um fluorocromo (que reconhece o anticorpo primário). Na maioria das vezes, as imunofluorescências são do tipo indireto, pois normalmente a quantidade de anticorpo primário é pequena e um pouco da sua atividade pode ser perdida durante o processo de marcação com o anticorpo. As marcações indiretas têm como vantagem o uso de um mesmo anticorpo secundário para revelar diferentes antígenos e a amplificação da reação (note que sobre um anticorpo primário existem pelo menos dois anticorpos secundários), o que facilita a observação das marcações em imunofluorescência.

 

O microscópio confocal tem como base para seu funcionamento um microscópio de fluorescência convencional. As amostras podem ser selecionadas da maneira convencional com o uso de lâmpada HBO. Após a seleção da região a ser analisada, acionam-se por um computador, acoplado ao microscópio, diversos tipos de função como seleção de objetiva, seleção do módulo confocal, correção de brilho e contraste, seleção das aberturas do microscópio (pinhole), seleção de cores, sistemas de filtros, velocidade de varredura, gravação das imagens etc.