Contagem de microrganismos

Figura 5.3 Técnica do esgotamento para a obtenção de cultura pura. A. Modo de espalhamento do inóculo. B. Aspecto da placa estriada após incubação. Notar a presença de crescimento confluente na região correspondente ao início do procedimento e de colônias isoladas no final do processo.

Existem algumas variantes desta técnica, porém o princípio básico é sempre o mesmo: tentar esgotar o material ao longo das estrias, de modo a depositar células isoladas no meio sólido, que darão origem a colônias isoladas. Cada colônia isolada obtida poderá ser então passada para um meio de cultura novo, de modo a se obter uma cultura pura, contendo células idênticas que, por exemplo, quando coradas ao Gram, deverão

apresentar a mesma morfologia celular e tintorial (ver Figura 5.11, adiante).

Contagem de microrganismos

Os diversos métodos existentes para a contagem de microrganismos podem ser divididos em dois grupos principais: aqueles que quantificam o número de células e aqueles que quantificam a massa celular. Além disso, alguns métodos determinam as células viáveis (somente as vivas), enquanto outros determinam as células totais (vivas e mortas). Alguns dos principais métodos serão descritos a seguir.

Contagem em placas

Este é o principal método de contagem de células viáveis, ou seja, células capazes de se dividir, originando células-filhas e formando uma colônia. É um método demorado, visto que é necessário aguardar a multiplicação de uma célula isolada no meio sólido, de modo que esta forme uma colônia macroscopicamente visível, a ser contada. Pode ser utilizado tanto para materiais com alta concentração microbiana, neste caso sendo utilizado o método das diluições seriadas, como também para materiais líquidos com pouca concentração microbiana, nos quais o método da filtração é o mais apropriado.

▶ Método das diluições em placas

Também conhecido como método das diluições seriadas, serve tanto para o isolamento quanto para a contagem de microrganismos. Pode-se partir de uma determinada amostra, como solo, alimento, urina ou outro material qualquer. Inicialmente, no caso de amostras sólidas, em pó ou muito viscosas, é feita uma homogeneização inicial, e a partir desta são

preparadas diluições sucessivas em tubos (Figura 5.4). Essas diluições são feitas geralmente em salina ou soluções tamponadas, e são diluições sequenciais, na razão de 1 para 10, de modo a se obterem diluições 1/10 ou 10–1, 1/100 ou 10–2, 1/1.000 ou 10–3 ou superiores. A cada diluição obtida, procede-se à homogeneização do líquido contido no tubo, em vórtex (aparelho agitador de tubos), antes de proceder-se à diluição seguinte. Em seguida procede-se ao plaqueamento, ou seja, distribuição homogênea de uma alíquota da referida diluição em meio sólido adequado, de modo que, após incubação, por tempo e temperatura adequados, as células, ou pedaços de hifas, ou pequenos agrupamentos de células idênticas espalhadas, cresçam isoladamente dando origem a colônias que serão contadas na diluição apropriada e, portanto, chamadas de unidades formadoras de colônias (UFC). Evidentemente, nos tubos muito diluídos não teremos células suficientes, ao mesmo tempo que nos tubos muito concentrados teremos excesso de células, de modo que não será possível se fazer uma contagem adequada nas respectivas placas. O ideal é que cada placa escolhida para a contagem contenha um número considerado significativo no método em questão, o que para bactérias, em geral, é de no mínimo 20 a 30 colônias e no máximo 200 a 300 colônias. Para que os resultados obtidos sejam estatisticamente válidos, sugere-se que sejam preparadas pelo menos três placas-réplica para cada diluição. Após os cálculos adequados, levando-se em conta os volumes utilizados, e as diluições empregadas, determina-se o número de microrganismos presentes em um determinado peso ou volume

do material inicial (Figura 5.4).

O método das diluições em placas permite duas variantes: inoculação em superfície, também chamado método do espalhamento, e inoculação em profundidade. No método do espalhamento em superfície, o inóculo, geralmente de 0,1 mℓ, é espalhado uniformemente na superfície do meio já solidificado, com o auxílio da alça de Drigalsky, de modo a separar ao máximo as células microbianas presentes. Neste caso só crescerão colônias

na superfície do meio sólido (Figura 5.5A). A superfície do meio de cultura não deve estar muito úmida, para que o inóculo seja absorvido e as células não se desloquem. Volumes de inóculo de líquido não absorvido promovem a junção de colônias, à medida que se formam.

Figura 5.4 Método das diluições em placas – a partir de uma amostra líquida (água, leite, urina ou outra) ou da homogeneização inicial da amostra em um diluente apropriado (solo, talco, carne ou outro), são realizadas diluições sucessivas, nas quais 1 mℓ de cada diluição é adicionado a 9 m ℓ de salina, em sequência. Após plaqueamento e incubação, é feita a contagem na placa onde o número de colônias é mais apropriado. No exemplo da figura, a contagem foi na diluição de 10–4, onde foram contadas 36 colônias, o que corresponde a 36 ◊ 10 4 UFC/mℓ da suspensão original.

Figura 5.5 Técnicas de inoculação das suspensões microbianas para contagem e isolamento de microrganismos. A. Método de espalhamento em superfície. B. Método de espalhamento em profundidade (pour plate), apropriados para a contagem de

microrganismos viáveis em placa. O inóculo é obtido como descrito na Figura 5.4.

Já no método de inoculação em profundidade (pour plate), também chamado incorporação em placa, o inóculo, geralmente de 1,0 m ℓ , é adicionado ao fundo da placa estéril, vazia, e o meio de cultura contendo ágar, ainda líquido, mantido a cerca de 40 a 45°C, é vertido sobre ele. A homogeneização do inóculo com o meio é feita por intermédio de

movimentos rotacionais suaves (Figura 5.5B). É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique muito quente para não matar as células microbianas. As colônias crescerão não só na superfície como também no interior do meio de cultura.

▶ Método da filtração

É utilizado para materiais líquidos onde se espera uma pequena quantidade de microrganismos, como a água de abastecimento das cidades, que apresenta um baixo número de bactérias pois é previamente tratada com cloro. Nesse método, volumes de cerca de 100 m ℓ da amostra são filtrados em uma membrana porosa adequada, que deverá reter os microrganismos. Em seguida, ela é colocada na superfície de uma placa contendo meio de cultura. A difusão dos nutrientes pela membrana permite que os microrganismos retidos se multipliquem e formem colônias, que poderão então ser contadas. Nessa técnica, em virtude do tamanho da membrana filtrante, são consideradas significativas as contagens em placas que apresentem de 20 a 200 colônias. É um método bastante utilizado para detecção de bactérias coliformes, que são indicadoras de contaminação

fecal em alimentos e água (Figura 5.6). É importante lembrar que, também nesse caso, o método exige que se trabalhe com réplicas para que os resultados possam ser estatisticamente válidos.

▶ Contagem de microrganismos do ar

Diferentes metodologias são propostas para quantificação dos microrganismos no ar. Alguns métodos são bastante simples, como o “método da exposição de placas”. Nele, as placas, contendo o meio de cultura sólido, são expostas ao ar do ambiente por um determinado período de tempo, quando os microrganismos se depositam pela ação da gravidade sobre o meio de cultivo. As colônias que se desenvolverem poderão, então, ser contadas. Apesar da sua simplicidade, esse método, por todas as suas imprecisões técnicas e por não quantificar os microrganismos em relação ao volume de ar, não é muito recomendável. É possível também fazer a impactação, ou borbulhamento, de um volume definido de ar em um diluente, e depois quantificar os microrganismos capturados pelo líquido pelo método de contagem em placa. Embora apresente vantagens em relação ao anterior, o método é muito trabalhoso, sendo também, pouco utilizado. Outro método sugerido é a filtração de um volume definido de ar através de uma membrana, e a posterior quantificação dos microrganismos de forma semelhante ao método descrito no tópico “Método da filtração”. Contudo, esse método apresenta a desvantagem de expor os microrganismos capturados na membrana a um fluxo elevado de ar, que, por sua ação desidratante, pode determinar a morte de muitos deles.

Figura 5.6 Método da filtração para a contagem de bactérias. Neste exemplo, uma amostra de 100 m ℓ de água foi filtrada, e a membrana utilizada colocada na superfície de um meio sólido diferencial apropriado. As bactérias retidas na membrana se desenvolveram e formaram colônias vermelho-escuras com brilho metálico, sugestivas de coliformes. (Foto: Baktron Microbiologia Ltda.)

O método considerado mais adequado para contagem de microrganismos no ar é o de impactação em um meio sólido, que emprega

um equipamento chamado de amostrador de Andersen (ver Capítulo 3, Métodos Físicos e Químicos de Controle do Crescimento Microbiano). Neste, uma corrente de ar de alta velocidade incide sobre a superfície de um meio de cultura sólido que capturará as partículas de ar contendo os microrganismos. A placa que contém o meio é incubada, e o número de colônias que se desenvolvem poderá ser quantificado e correlacionado ao volume analisado. O modelo mais completo desse equipamento faz a passagem sucessiva da corrente de ar por seis placas de meio de cultura, e, como em cada um desses estágios são capturadas partículas com tamanhos diferentes, é possível correlacioná-las com a sua penetração no trato respiratório, ou seja, partículas “grandes” ficariam retidas nas fossas nasais, enquanto partículas muito pequenas chegariam até os alvéolos pulmonares. Com isso, é possível avaliar o risco à saúde dos indivíduos expostos ao ar desses ambientes, sendo esse método muito utilizado na investigação e no controle de doenças relacionadas à baixa qualidade do ar, como a “síndrome dos edifícios doentes”.

Contagem direta em câmara de contagem

Neste método, utilizado para a contagem de células totais, a suspensão microbiana em questão, que deverá ser bastante densa para garantir resultados significativos, é colocada em uma lâmina especial, dentro de um poço com dimensões conhecidas, cujo fundo é quadriculado. Após a adição de uma lamínula, ela é levada ao microscópio para a realização da contagem direta das células em vários campos visuais. O número de células totais será a média das contagens obtidas nos diversos campos, multiplicada por um fator que correlaciona a contagem obtida ao volume de suspensão analisado. Esse método fornecerá a contagem total de células vivas e mortas, e não se aplica a qualquer microrganismo. Assim sendo, não será possível utilizá-lo para a contagem de fungos ou bactérias filamentosas. Há também dificuldade em realizar contagem de seres móveis, como certas bactérias e protozoários, porém a grande vantagem é a rapidez do resultado, que é imediato, dispensando incubações. Um dos exemplos mais comuns de câmaras de contagem é a câmara de Petroff-Hausser, exemplificada na

Figura 5.7.

A contagem direta também pode ser realizada utilizando-se contadores eletrônicos de partículas, do tipo Coulter, muito conhecidos em laboratórios clínicos, por serem utilizados para contagem de células do sangue. Esse equipamento pode registrar a magnitude e a duração de mudanças de condutividade de uma suspensão de células bacterianas à medida que elas passam através de um pequeno orifício. Dessa maneira podem ser registrados o número e a distribuição do tamanho de uma população de células. É um método rápido, porém apresenta como inconveniente a possibilidade de partículas inanimadas poderem ser tratadas erroneamente como células.

Método do número mais provável

O método do número mais provável (NMP) trata-se de uma técnica estatística, baseada no princípio de que, quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior o número de diluições necessárias para reduzir a densidade bacteriana a zero. Volumes da amostra original, em geral 10 e 1 mℓ, ou volumes correspondentes às suas diluições decimais, em geral 0,1 e 0,01 m ℓ , são inoculados em séries de tubos contendo um meio de cultura líquido apropriado. Comumente são empregadas três ou cinco séries, de cinco tubos cada, nas quais são inoculadas réplicas correspondentes de cada volume ou diluição da amostra original. Após incubação pelo tempo apropriado, conta-se o número de tubos nos quais é observado crescimento ou uma reação diferencial típica, como a mudança da cor do indicador de pH ou a produção de gás, em cada um dos tubos de cada série. Com o número obtido pela combinação do número de tubos positivos de cada série pode-se determinar o número mais provável de microrganismos na amostra, a partir da consulta de tabelas específicas. Este método é bastante útil para contagem de microrganismos que apresentam uma determinada característica metabólica. A atividade nitrificante ou celulolítica pode ser empregada para quantificação desses grupos de microrganismos em amostras de solo, ou a produção de gás a partir da fermentação da lactose pode ser utilizada na contagem de coliformes fecais e totais em água e alimentos. Sendo um método estatístico, os resultados obtidos garantem apenas 95% de probabilidade de que o número de microrganismos determinados na análise corresponda ao número real de microrganismos

presentes na amostra (Figura 5.8).

Figura 5.7 Contagem microscópica direta, em câmara de Petroff-Hausser.

São montadas três séries de cinco tubos cada, contendo o meio líquido apropriado; cada série é inoculada com quantidades ou diluições decrescentes da amostra (1a série com 1 mℓ da amostra; 2a série com 1 × 10– 1 a –2 m ℓ da amostra; 3 série com 1 × 10 mℓ da amostra). Após incubação, faz-se a contagem do número de tubos nos quais foi observado crescimento microbiano (“tubos positivos”) em cada grupo, e, com o número obtido pela combinação de tubos positivos das séries, observa-se, em uma tabela estatística, o número mais provável de microrganismos na amostra analisada. No exemplo da figura observou-se o crescimento em 4, 2 e 1 tubo de cada série, respectivamente, o que correspondeu, na tabela, ao número mais provável de 26 microrganismos por 100 m ℓ da amostra analisada.

Turbidimetria

Este é um método indireto no qual são contadas células totais, a partir da turvação observada no meio líquido onde ocorre o crescimento microbiano. Dentro de certos limites, quanto maior o número de células presentes, maior a turvação do meio. Aplica-se apenas a microrganismos capazes de crescer em células isoladas, não se prestando, pois, para fungos ou bactérias filamentosas. Para essa contagem é preciso que seja obtida uma curva-padrão para cada microrganismo estudado, onde será relacionado o número de células conhecido com a turvação correspondente. O aparelho mais comumente utilizado para esse tipo de procedimento é o espectrofotômetro, ou colorímetro. Este emite um feixe de luz que atravessa a suspensão microbiana, atingindo uma célula fotelétrica. Quanto menos células o feixe encontra no caminho, maior a quantidade de luz que atinge a célula fotelétrica. A unidade de medida da turvação é chamada de absorbância, ou também de densidade óptica. Este método também não é muito sensível, exigindo um número mínimo de células bastante alto para ser significativo. Entretanto, por outro lado, é rápido, fácil e não destrói a

amostra (Figura 5.9).

Figura 5.8 Método do número mais provável (NMP).

A escala de McFarland também é considerada um método turbidimétrico e utiliza uma escala de turvação baseada em uma suspensão de sulfato de bário, um sal insolúvel. Neste caso adquire-se um conjunto de tubos lacrados contendo suspensões do referido sal em quantidades crescentes, em que, quanto maior a quantidade do sal, maior a turvação da

suspensão (Figura 5.10). A medida é feita por uma comparação visual entre as turvações da escala de McFarland e a turvação da suspensão microbiana. Existe uma equivalência, descrita pelo fabricante, entre a densidade óptica de cada tubo da escala e a concentração de bactérias ou leveduras presentes na suspensão.

Peso seco

Pode ser utilizado para qualquer microrganismo, mas é especialmente útil para microrganismos filamentosos, incluindo bactérias e fungos, cuja contagem não pode ser determinada por outros métodos. Neste caso, a massa de células é obtida por filtração ou centrifugação e em seguida lavada e seca em forno ou dessecador, até peso constante.

Figura 5.9 Método turbidimétrico para a medida do crescimento bacteriano. Os raios luminosos que incidem nas células bacterianas são dispersos, enquanto os outros, não dispersos, são detectados em uma célula fotelétrica e registrados em termos de porcentagem de luz transmitida. O ensaio em branco consiste na medida da luz que atravessa o meio sem bactérias. Quanto maior o número de células bacterianas, menor a quantidade de luz que alcança o detector.