Seção 2 | Prática

Figura 6.4 Esquematização do transporte de elétrons na cadeia respiratória e geração da molécula de ATP. Na membrana mitocondrial interna, após a passagem dos elétrons pelos complexos da cadeia respiratória, os prótons são bombeados para fora da matriz mitocondrial e retornam a ela através de canais nas ATP-sintases (F F ), gerando energia para que ocorra a fosforilação do ADP, produzindo 1 0

ATP (teoria quimiosmótica).

 

SEÇÃO 2 | PRÁTICA

 

Testes bioquímicos e atividade enzimática

 

Após analisarmos processos metabólicos para obtenção de energia nos microrganismos, passaremos a analisar os testes capazes de classificar esses microrganismos quanto às suas capacidades de utilização de substratos (o que inclui também a presença de enzimas específicas para utilização de determinados substratos) como fonte doadora de energia, bem como quanto ao tipo de mecanismo utilizado para sua obtenção.

 

Fermentação de carboidratos (glicose, lactose e manitol)

▶ Objetivo

Estes testes são utilizados para avaliar a habilidade de um microrganismo em fermentar vários carboidratos. São particularmente úteis na identificação de bactérias entéricas gram-negativas.

 

▶ Material

Tubos de ensaio contendo meio de cultura simples com diferentes fontes de açúcares; tubo de Durham; indicador vermelho de fenol; alça e agulha de platina.

 

▶ Princípio

Como visto anteriormente, a fermentação é um processo metabólico no qual o aceptor final do elétron é uma molécula orgânica. A fermentação da glicose começa tipicamente com a produção de ácido pirúvico pela via glicolítica. Algumas bactérias podem usar a via alternativa da via das pentoses ou a via de Entner-Doudoroff; entretanto, em ambas as vias também ocorre a produção de ácido pirúvico. Vários produtos finais da fermentação podem ser produzidos a partir do ácido pirúvico, incluindo uma variedade de ácidos, gases como H 2 ou CO2 e alcoóis, sendo que os produtos finais dependem exatamente do organismo e do substrato fermentado, como

podemos observar na Figura 6.5.

Os carboidratos frequentemente testados incluem adonitol, arabinose, glicose, inositol, lactose, melibiose, raminose, sorbitol e sacarose. Utilizaremos como exemplo prático a capacidade de utilização da glicose, da lactose e do manitol.

Figura 6.5 Fermentação de alguns dissacarídeos. Observar que, apesar de os dissacarídeos possuírem composições diferentes, todos geram intermediários da via glicolítica que, após passagem por ela, geram um composto em comum – o ácido pirúvico –, o qual, através da fermentação, poderá gerar ácidos, álcool ou gases.

 

▶ Procedimentos

Para realização deste teste, o meio mais empregado é o meio líquido ou caldo vermelho de fenol. Este meio consiste em uma composição básica que inclui peptona, um indicador de pH (sendo que o mais comumente empregado é o vermelho de fenol, o qual se apresenta na cor amarela em pH abaixo de 6,8 ou na cor vermelha em pH acima de 7,4) e a presença de um único carboidrato fermentável. Além desses componentes básicos, um pequeno tubo de vidro, chamado de tubo de Durham, é colocado em posição invertida no fundo do tubo contendo o meio de fermentação de carboidratos. A função desse pequeno tubo é coletar o gás que é frequentemente um dos produtos do processo fermentativo.

Com o auxílio de uma alça ou agulha, o material isolado a ser analisado é inoculado no meio, sendo este colocado para incubação a 37°C por 24 a 48 horas e, posteriormente, analisado quanto a mudança de cor do meio e produção de gás.

A utilização deste meio com diferentes carboidratos permite a determinação de produtos finais da fermentação e também a capacidade de converter outros açúcares (p. ex., dissacarídeos como a lactose) em glicose.

 

▶ Interpretação dos resultados

A bactéria que fermenta um carboidrato produz ácido ou ácido e gás como produtos finais da reação. Os ácidos promovem diminuição do pH do meio, levando à viragem do indicador para amarelo, enquanto os gases (se produzidos) serão coletados sob a forma de bolhas no tubo de Durham.

Se a bactéria não fermentar o carboidrato, o meio permanecerá vermelho e não será observada a presença de bolhas no tubo de Durham. Isso ocorre porque os aminoácidos, fornecidos pela peptona, podem ser degradados por desaminação, liberando amônia (NH 3) dentro do meio. O acúmulo de NH3 aumenta o pH do meio, deixando a sua coloração na cor inicial ou de um vermelho mais intenso. Esta reação alcalina pode ser produzida não só pela bactéria que não fermenta o carboidrato, mas também por aquelas que, após a exaustão do carboidrato no meio, mudam o seu metabolismo para utilizar outra fonte disponível no meio. Sendo assim, é importante que a leitura do teste não seja feita após 48 horas de inoculação, para evitar perda de observação da sua capacidade em produzir ácido. Os resultados podem ser vistos na

Figura 6.6.

Esse teste é frequentemente utilizado para distinguir bactérias fermentadoras de lactose, como Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae, de bactérias não fermentadoras de lactose, como Proteus vulgaris, Shigella flexneri e Salmonella typhimurium.

 

Teste do vermelho de metila (VM) e teste de Voges-Proskauer (VP)

▶ Objetivo

O teste do VM visa identificar se a bactéria é capaz de produzir ácidos estáveis como produtos finais da fermentação mista da glicose, enquanto o teste de VP identifica organismos capazes de produzir acetoína a partir da degradação da glicose através da via butilenoglicólica.

 

Figura 6.6 Resultados do teste de utilização de carboidrato. O indicador utilizado no meio foi o vermelho de fenol e a glicose como fonte de açúcar. Tubo A: tubo controle não inoculado; tubo B: açúcar negativo/gás positivo (a seta mostra a presença de bolha dentro do tubo de Durham); tubo C: açúcar negativo/gás negativo; tubo D: açúcar positivo/gás negativo (observar a turbidez do tubo, o que indica crescimento, com mudança de cor para o amarelo, embora não exista e/ou formação de gás).

 

▶ Material

Tubos de ensaio contendo meio de cultura simples (à base de peptona, glicose e tampão fosfato); indicador vermelho de metila; solução de α-naftol; solução de KOH; alça e agulha de platina.

▶ Princípio

Conforme mencionado anteriormente, todas as bactérias produzem inicialmente ácido pirúvico a partir da metabolização da glicose. Entretanto, algumas bactérias

entéricas usam subsequentemente a via de fermentação ácida mista (Figura 6.7) para metabolizar o ácido pirúvico, produzindo outros ácidos como o láctico, o acético e o fórmico, sendo que outras bactérias entéricas utilizam também a via butilenoglicólica para produzir compostos neutros ao final da metabolização do piruvato.

Para testarmos a presença dessas vias, utilizamos um meio combinado – meio VM/VP (vermelho de metila/Voges-Proskauer), também conhecido como meio de Clarky Lubs – que inclui peptona, glicose e tampão fosfato. Os organismos capazes de produzir grande quantidade de ácidos estáveis após a metabolização da glicose levam a uma diminuição drástica do pH do meio.

Em razão de muitos microrganismos produzirem ácidos em um período de 18 a 24 horas, mas continuarem a catabolizá-los até compostos mais neutros, este teste deve ser lido após um tempo de incubação de cerca de 2 a 5 dias para que se assegure a presença de ácidos estáveis.

 

Figura 6.7 Fermentação ácido-mista. Como produtos desse tipo de fermentação, estão listados os originados em maior quantidade, lembrando que a maior parte do ácido fórmico é convertida nos gases H e CO . 2 2

 

▶ Procedimentos

Com auxílio de uma agulha estéril, inocula-se o material isolado em dois tubos (para realização das duas provas, ou então a inoculação poderá ser feita em um único tubo, sendo que, após a incubação, separa-se o conteúdo em dois tubos estéreis) contendo o meio de Clarks Lubs. Os tubos são incubados a 37°C por 48 horas.

 

▶ Interpretação dos resultados

Após o período de incubação, para o teste do VM, adicionam-se 2 a 5 gotas do indicador vermelho de metila a um dos tubos, o qual ficará vermelho em pH menores que 4,4, sendo, portanto, uma demonstração de positividade do teste. Em valores de pH superiores a 6,0 a solução irá se tornar amarela, sendo indicativo de um resultado

negativo (Figura 6.8). Uma coloração alaranjada não é considerada resultado positivo, indicando que uma incubação por tempos mais prolongados pode ser necessária.

 

Figura 6.8 Resultados do teste do vermelho de metila (VM). Após o período de incubação, os tubos inoculados receberam cinco gotas da solução de vermelho de metila. Tubo A: resultado negativo; tubo B: resultado positivo.

 

Para o teste de VP, ao segundo tubo adicionam-se 2 a 5 gotas do reagente de Barritt “A” (que contém α-naftol) e 2 a 5 gotas do reagente de Barritt “B” (contendo KOH). O tubo é suavemente agitado e deixado em repouso, por 10 a 15 minutos, para desenvolvimento da cor. Se a acetoína for produzida a partir do ácido pirúvico oriundo do metabolismo da glicose, ela reagirá com α-naftol e KOH e produzirá uma coloração

vermelha no meio (as reações mais detalhadas estão ilustradas na Figura 6.9). A cor

vermelha representa um teste de Voges-Proskauer positivo (Figura 6.10). Se a acetoína não for produzida, a reação fornecerá uma coloração amarelada ou cor de cobre ao meio, indicando um teste negativo.

Figura 6.9 Reações químicas do teste de Voges-Proskauer.

 

 

Figura 6.10 Resultados do teste de Voges-Proskauer. Depois da incubação, os tubos inoculados receberam cinco gotas do reagente de Barritt A (A) e duas gotas do reagente de Barritt B (B) e, após 15 minutos, foi realizada a leitura. Tubo A: resultado negativo; tubo B: resultado positivo. Uma coloração esverdeada pode ocorrer, mas pode ser devida à reação do KOH e do α-naftol e não deve ser considerada como um resultado positivo.

 

Teste de oxidação/fermentação (O/F)

▶ Objetivo

Diferenciar bactérias de acordo com a capacidade de oxidar ou fermentar açúcares específicos.

▶ Material

Tubos de ensaio contendo meio de cultura simples com baixa concentração de peptona e altas concentrações de açúcar; indicador azul de bromotimol; vaselina líquida; alça e agulha de platina.

 

▶ Princípio

A conversão de carboidratos em produtos ácidos pode ocorrer tanto aerobicamente, pela oxidação, como anaerobicamente, pela fermentação. Desta forma, os microrganismos que oxidam os carboidratos são denominados aeróbicos, enquanto outros podem crescer, realizar seu metabolismo e se reproduzir em condições aeróbicas ou anaeróbicas, e por isso são chamados de anaeróbicos facultativos. De uma forma geral, a maior parte das bactérias de interesse médico é anaeróbica facultativa.

O teste de oxidação/fermentação (O/F) é utilizado para diferenciar microrganismos de acordo com a sua habilidade em oxidar ou fermentar açúcares específicos e, portanto, determinar se uma bactéria é aeróbica ou anaeróbica facultativa. Este teste é capaz de distinguir bastonetes gram-negativos, que são aeróbicos, como a Pseudomonas aeruginosa, daqueles que são anaeróbicos facultativos, como a Escherichia coli. O teste também distingue cocos gram-positivos aeróbicos, como as espécies de Micrococcus, dos que são anaeróbicos facultativos, como as espécies de Staphylococcus.

O meio usado para este teste é um meio semissólido (em virtude da baixa concentração de ágar) denominado meio de oxidação/fermentação, o qual contém uma baixa concentração de peptona, suficiente para permitir o crescimento. Esta baixa concentração de peptona é essencial para limitar a formação de produtos alcalinos que poderiam neutralizar o efeito da produção de ácidos. Um carboidrato, como a glicose, a lactose, a maltose, a sacarose, o manitol ou mesmo a xilose, é adicionado em altas concentrações, o que promove a utilização do carboidrato, resultando na formação de produtos ácidos. Neste meio, utiliza-se o indicador de pH azul de bromotimol, que possui uma coloração inicial verde a pH 7,1 e se torna amarelo em pH 6,0 e azul em pH 7,6.

 

▶ Procedimentos

Para realização do teste, dois tubos contendo o meio com o açúcar específico são inoculados com o microrganismo a ser testado, com auxílio de uma agulha estéril. Após a inoculação, um dos tubos é então selado com 2,0 a 3,0 mℓ de óleo mineral (p. ex., vaselina líquida), criando assim um ambiente anaeróbico, visto que o óleo mineral retarda a difusão do oxigênio dentro do meio. O outro tubo é deixado aberto em contato com o ar, permitindo assim um crescimento aeróbico. Os dois tubos são então incubados a 37°C por 48 horas, para posterior análise da mudança de cor.

 

▶ Interpretação dos resultados

Uma coloração azulada ou uma não alteração da cor inicial verde, em ambos os

tubos, indica que o organismo não é capaz de utilizar o carboidrato testado (Figura

6.11). Os organismos capazes de fermentar ou fermentar e oxidar o açúcar provocarão mudança de cor do indicador para amarelo, tanto no tubo selado com o óleo como no

tubo não selado (ver Figura 6.11). Organismos capazes de metabolizar somente pelo processo de oxidação promoverão mudança de cor para amarelo somente no tubo não selado, deixando o tubo selado com uma coloração verde ou azul.

Um sumário dos resultados pode ser observado na Figura 6.12.

 

Figura 6.11 Resultados do teste de oxidação-fermentação (O/F) de carboidratos. I (inerte): o microrganismo não foi capaz de hidrolisar o carboidrato utilizado em nenhuma das condições (aeróbica ou anaeróbica); A (aeróbico) e AF (anaeróbico) facultativo. *Óleo mineral colocado na superfície no meio, para impedir contato com o oxigênio, simulando condição de anaerobiose.

 

Figura 6.12 Sumário de possíveis resultados do teste de O/F. Observar que neste exemplo o açúcar utilizado foi a glicose, mas lembre-se de que o teste poderá ser feito utilizando outro carboidrato como única fonte de açúcar, como aqueles citados no texto.

 

Teste de utilização do citrato

▶ Objetivo

Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono para o seu desenvolvimento.

 

▶ Material

Tubos de ensaio contendo meio de cultura simples; meio de citrato (citrato de Simmon); indicador azul de bromotimol; alça e agulha de platina.

 

▶ Princípio

Em algumas bactérias a energia pode ser gerada pela utilização do citrato como única fonte de carbono. Se nos reportarmos ao ciclo dos ácidos tricarboxílicos, observamos que o citrato é uma molécula orgânica produzida pela combinação de acetil-CoA e oxaloacetato, fazendo com que, desta forma, a molécula de acetil-CoA possa entrar no ciclo. Sendo assim, o citrato pode e serve como uma molécula doadora de energia, que pode ser utilizada pelas bactérias produtoras da enzima citrase, por exemplo, Enterobacter aerogenes e Salmonella typhimurium. Vale ressaltar que a utilização do citrato como fonte de carbono ocorre se nenhum carboidrato fermentável

estiver presente. O processo catabólico do citrato pode ser observado na Figura 6.13.

Para realização deste teste, o meio mais comumente utilizado é o ágar citrato de Simmon, no qual o citrato de sódio é a única fonte de carbono e o íon amônio, a única fonte de nitrogênio. O azul de bromotimol é incluído como indicador de pH. O meio é preparado a um pH igual a 6,9 no qual a coloração do meio é verde. Em pH maiores que 7,6, o azul de bromotimol modifica a coloração do meio para um azul bem intenso.

Como a utilização do citrato é um processo aeróbico, devemos utilizar o meio inclinado em tubo (embora possa ser utilizado também em placas de Petri) no intuito de aumentarmos a área que ficará exposta em contato com o ar.

 

▶ Procedimentos

O material a ser analisado é inoculado, por meio de pequenas estrias, na superfície do ágar na placa ou no tubo invertido, utilizando-se uma alça de platina estéril. O meio é então incubado a 37°C, por 24 a 48 horas, antes da leitura do resultado.

Figura 6.13 Metabolismo do citrato em organismos citrato-positivos. Uma vez dentro da célula, o citrato é hidrolisado pela enzima citrase em ácido oxaloacético e ácido acético. O ácido oxaloacético é posteriormente hidrolisado em ácido pirúvico e CO , este responsável pela mudança de cor no meio 2 como descrito no texto.

 

Devemos observar que, se o inóculo for abundante, os compostos orgânicos pré-formados dentro das paredes celulares das bactérias que porventura morrerem durante o processo de incubação poderão liberar carbono e nitrogênio suficientes para produzir um resultado falso-positivo, e portanto, falsear a prova. Outro ponto a ser considerado é o fato de comumente esta prova ser feita em conjunto com outras (a utilização do citrato é a porção “C” dos quatro testes conhecidos como IMViC, em que, além da prova do citrato, temos a prova do indol (I), do vermelho de metila (M) e do Voges-Proskauer (V) e, portanto, deve-se inocular primeiro a prova do citrato para que possamos evitar o arraste de proteínas e/ou carboidratos de outros meios, consequentemente, propiciando outras fontes de carbono, que não o citrato, passíveis de utilização.

 

▶ Interpretação dos resultados

Como pode ser visto na Figura 6.13, a utilização do citrato como fonte de energia gera, nos passos finais da reação, uma grande quantidade de gás carbônico (CO2). Este gás em excesso pode reagir com o sódio (Na+) e a água (H O) do meio, produzindo 2 compostos alcalinos, como o carbonato de sódio (Na 2CO3). Isso faz com que o pH do meio se torne alcalino, ocasionando a viragem do indicador para azul, o que é

considerado um resultado positivo para a prova do citrato (Figura 6.14).

Em determinadas situações, poderemos ter apenas a parte inclinada do meio apresentando uma coloração azulada, o que também será considerado uma prova positiva. Isso pode acontecer nos casos de bactérias que utilizam o citrato muito lentamente, e, para termos certeza da viragem, poderemos incubar o meio inoculado por mais 24 horas, para uma nova leitura da prova.

Figura 6.14 Resultados da utilização do citrato (citrato de Simmon). Tubo A: controle não inoculado; tubo B: resultado negativo; tubo C: positivo (os organismos mostram crescimento e uma coloração azul no meio).

 

Teste de hidrólise do amido

▶ Objetivo

O teste é utilizado para diferenciar bactérias capazes de hidrolisar o amido por meio da ação da enzima amilase. Ele ajuda na diferenciação de espécies dos gêneros Corynebacterium, Clostridium, Bacillus, Bacteroides, Fusobacterium e membros do grupo estreptococos D.

 

▶ Material

Ágar simples contendo aproximadamente 0,2 g% de amido de milho; placa de Petri; solução de iodo; alça de platina.

 

▶ Princípio

O amido é um homopolissacarídeo, composto de repetidas subunidades de α-D-glicose. Ele se apresenta como uma mistura, em que temos a presença de duas formas principais: uma linear, conhecida como amilose, e uma outra ramificada, denominada amilopectina. Tanto na amilose quanto na amilopectina, as moléculas de glicose são

unidas por ligações do tipo acetal 1,4-α-glicosídica (Figura 6.15).

O amido possui uma estrutura muito grande para atravessar a membrana celular bacteriana e, por isso, para se tornar uma fonte de energia valiosa para a bactéria, ele precisa ser reduzido a pequenos fragmentos ou mesmo moléculas individuais de glicose para que possam funcionar como substratos energéticos. Organismos que produzem e secretam as enzimas celulares α-amilase e oligo-1,6-glicosidase são capazes de hidrolisar o amido através da quebra das ligações glicosídicas entre as subunidades de açúcar; embora este seja o passo inicial do processo, várias outras enzimas (p. ex., enzimas da via glicolítica) são necessárias para que todo o processo metabólico aconteça até a geração de ATP.

O meio utilizado para esse teste é um meio ágar simples que contém extrato de carne e peptona, para promover o crescimento, e amido solúvel, que deve ser disposto em placas de Petri, as quais, após a solidificação do meio, são utilizadas para a prova.

 

Figura 6.15 Hidrólise do amido pela α-amilase e oligo-1,6-glicosidase.

 

▶ Procedimentos

O material a ser analisado é inoculado na placa, por intermédio de uma alça estéril, em pelo menos duas estrias equidistantes para melhor visualização da leitura da prova. A placa é incubada então a 37°C por pelo menos 48 horas. Passado o período de incubação, a superfície da placa é coberta com uma solução de iodo (podemos usar a mesma solução de lugol utilizada para a coloração de Gram), para a revelação da prova.

 

▶ Interpretação dos resultados

Quando organismos que produzem α-amilase e oligo-1,6-glicosidase crescem no meio rico em amido, eles hidrolisam o amido, aumentando assim o crescimento no meio devido ao alto teor energético fornecido por meio da liberação de grandes quantidades de glicose, que, juntamente com o extrato de carne e peptona, favorecem substancialmente o desenvolvimento do microrganismo. Como tanto o amido quanto as subunidades de açúcares são solúveis no meio, o iodo presente na solução é usado para detectar a presença ou a ausência de amido na periferia ao redor do crescimento bacteriano, na superfície do meio de cultura. Já que o iodo reage com o amido e produz uma coloração azul-violácea intensa, qualquer traço de hidrólise do amido realizada pela bactéria será revelado como uma zona clara ao redor do crescimento,

representando um resultado positivo para o teste (Figura 6.16).

 

Teste da catalase

▶ Objetivo

Este teste é utilizado para identificar organismos que produzem a enzima catalase, visto que algumas bactérias produzem peróxido de hidrogênio durante a respiração aeróbica. É muito útil para distinguir membros da família Micrococcaceae e da família Streptococcaceae, além de auxiliar a identificação das espécies de Mycobacterium.

Figura 6.16 Resultado para o teste do amido. Na placa contendo um meio enriquecido em amido e que, após o crescimento, sofreu a adição de uma solução de iodo em sua superfície, a presença de uma zona clara ao redor do crescimento indica a utilização do amido (teste positivo).

 

 

▶ Material

Ágar simples em tubo, placa de Petri ou, ainda, uma pequena quantidade da cultura em lâmina de vidro para microscopia; solução de água oxigenada/peróxido de hidrogênio a 3%; alça de platina.

 

▶ Princípio

A maioria das bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas produz peróxido de hidrogênio a partir de flavoproteínas reduzidas via uma reação de transferência de elétrons, gerando oxigênio livre ao final da reação. O peróxido de hidrogênio pode ser também produzido enzimaticamente em aeróbios e anaeróbios facultativos pela ação

da enzima superóxido dismutase, conforme a Figura 6.17.

Se o peróxido de hidrogênio se acumula na célula, ele se torna tóxico porque o peróxido é uma molécula altamente reativa que promove danos aos componentes celulares. Por essa razão, a maioria dos aeróbicos e anaeróbicos facultativos possui uma enzima denominada catalase, que promove a quebra deste peróxido em água e oxigênio.

 

Figura 6.17 Reações de formação do peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio pode ser formado através da transferência de hidrogênios de uma flavoproteína reduzida para o oxigênio ou pela ação da superóxido dismutase.

 

▶ Procedimentos

O teste da catalase pode ser feito tanto em uma lâmina de vidro comum (utilizada para microscopia) contendo uma porção do material fresco a ser analisado quanto diretamente em ágar contendo colônias viáveis do espécime em análise. Devem ser adicionadas algumas gotas de uma solução de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) no material após 18 a 24 horas de crescimento. O peróxido de hidrogênio é extremamente instável e, portanto, deve ser utilizada uma solução de preparo recente.

 

▶ Interpretação dos resultados

A enzima catalase promove a quebra do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. O oxigênio liberado leva à formação de bolhas, como uma efervescência, em apenas alguns segundos, o que indica positividade para o teste. A ausência de bolhas é considerada um teste negativo. O mesmo comportamento é observado tanto no teste

feito em lâmina como no teste usando o ágar inclinado (Figura 6.18). Devemos atentar para a realização do teste para microrganismos que apresentam dificuldades no crescimento in vitro, visto que estes são crescidos, na maioria das vezes, em ágar enriquecido com sangue. Como os eritrócitos contêm catalase e peroxidase, a presença deles poderá acarretar um resultado falsamente positivo. Uma alternativa para estes casos é utilizar o ágar chocolate, pois neste meio os eritrócitos são lisados pelo calor, possibilitando, desta forma, a realização do teste de forma confiável.

Figura 6.18 Resultados para o teste da catalase. Cada tubo contendo ágar simples inclinado recebeu aproximadamente 1 mℓ de peróxido de hidrogênio após a incubação. A presença de bolhas (tubo B) indica a presença da enzima catalase e positividade do teste.

 

 

Presença de descarboxilases ou teste de descarboxilações

▶ Objetivo

O teste é utilizado para detectar a habilidade de um organismo descarboxilar um aminoácido (em geral lisina, ornitina ou arginina) para formar uma amina, resultando em alcalinização do meio no qual o organismo se desenvolve. O teste de descarboxilação é muito útil para diferenciar organismos da família Enterobacteriaceae.

 

▶ Material

Meio de descarboxilação (meio Mueller) contendo peptona, glicose, púrpura de bromocresol e a coenzima piridoxal fosfato, juntamente com o aminoácido (substrato) específico para cada reação; alça ou agulha de platina.

 

▶ Princípio

Este processo, chamado de “descarboxilação”, é um passo na metabolização de aminoácidos. Descaborxilação é um nome geral dado ao processo de remoção do grupo carboxila (–COOH) de um aminoácido, produzindo uma amina e dióxido de carbono (CO2). Essa reação depende de enzimas específicas denominadas descarboxilases. Existe uma enzima descarboxilase específica para cada aminoácido, mas somente três são utilizadas para a distinção entre bactérias entéricas: lisina, ornitina e arginina descarboxilases. A reação do processo de forma geral e as reações

específicas para as enzimas do teste estão demonstradas na Figura 6.19.

 

▶ Procedimentos

Um isolado é inoculado nos tubos dos testes (cada um contendo o substrato específico para cada enzima), utilizando uma agulha ou alça de platina estéril. Após a inoculação, adicionam-se 2 a 3 m ℓ de óleo mineral estéril para cobrir a camada superficial do meio, excluindo assim o oxigênio externo e promovendo o processo de fermentação. A falta de oxigênio promove a produção de ácidos provenientes da fermentação da glicose e, portanto, leva à criação de um ambiente ácido necessário para a indução da produção de descarboxilases. Os tubos são então incubados a 37°C, por 24 a 48 horas.

Figura 6.19 Reações de descarboxilações de aminoácidos. Estão demonstradas a reação geral de descarboxilação dos aminoácidos (painel superior), bem como as reações específicas envolvendo a lisina descarboxilase, a ornitina descarboxilase e a arginina descarboxilase (três painéis inferiores, respectivamente), que podem ser usadas nos testes bioquímicos de identificação.

 

 

▶ Interpretação dos resultados

Os ácidos provenientes da fermentação da glicose acarretam diminuição do pH do meio, promovendo mudança da cor do indicador (púrpura de bromocresol) para amarelo. O ambiente ácido promove a formação de descarboxilases naquelas bactérias que são capazes de produzir estas enzimas. A descarboxilação promovida pelas enzimas geradas leva a um acúmulo de produtos finais da reação (aminas) de caráter alcalino que promovem aumento do pH do meio, causando a mudança de cor do indicador para violeta e indicando um resultado positivo para o teste. Se o organismo inoculado for somente capaz de fermentar a glicose, o meio permanecerá amarelo e, portanto, será considerado negativo para o teste. Os resultados podem ser observados

na Figura 6.20.

 

Figura 6.20 Resultados do teste de descarboxilação. Neste teste foi utilizada a lisina como único aminoácido no meio de cultura e, portanto, testada a presença da lisina descarboxilase. Tubo A: positivo; tubo B: controle não inoculado; tubo C: negativo. (Foto: Reproduzida, com permissão, de Leboffe; Pierce, 1999.)

 

Teste da urease

▶ Objetivo

Usado para determinar se um microrganismo é capaz de hidrolisar ureia em duas

moléculas de amônia (NH 3) por ação da enzima urease (Figura 6.21), este teste pode ser útil na distinção entre patógenos do gênero Proteus e outras bactérias entéricas.

 

▶ Material

Meio ou caldo de ureia contendo extrato de levedura, ureia e o indicador de pH (vermelho fenol); alça ou agulha de platina.

 

▶ Princípio

A urease é uma enzima microbiana muito importante relacionada com a decomposição dos componentes orgânicos. Esta enzima é considerada constitutiva porque é sintetizada por certas bactérias, independentemente da presença ou ausência do seu substrato (ureia).

O meio para o teste da urease (que pode ser sólido ou líquido) contém ureia, fatores essenciais para crescimento e o indicador de pH vermelho fenol. O indicador possui uma coloração amarela ou amarelo/laranja em pH abaixo de 8,4 e vermelho em pH acima de 8,4. O meio para o teste foi desenvolvido para determinar a habilidade microbiana em converter ureia em amônia (que é utilizada pela bactéria como fonte de carbono para produção de aminoácidos e nucleotídeos), que aumenta o pH do meio com consequente mudança de cor do indicador.

 

Figura 6.21 Reação de hidrólise da ureia.

 

▶ Procedimentos

Inocular o material a ser testado no meio teste com auxílio de uma agulha ou alça estéril. O meio é então incubado a 37°C, por 24 horas, para posterior análise da mudança de cor.

 

▶ Interpretação dos resultados

A enzima urease hidrolisa a ureia em produtos finais alcalinos que promovem aumento no pH do meio, causando mudança de cor no indicador, que passa a ter uma coloração rosa, representando um resultado positivo para o teste. Nenhuma mudança de cor, ou uma coloração levemente alaranjada, representa um teste de urease negativo

(Figura 6.22).

Teste da β-galactosidase (ONPG)

▶ Objetivo

O teste ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo) é utilizado para identificar bactérias capazes de produzir a enzima β-galactosidase.

 

▶ Material

Meio de cultura enriquecido com lactose; composto o-nitrofenil-β-galactopiranosídeo; alça ou agulha de platina.

 

Figura 6.22 Resultados do teste de utilização da ureia. O teste visa detectar a capacidade de o microrganismo degradar a ureia no meio de cultivo e, por consequência, a presença ou não da enzima urease. Tubo A: controle não inoculado; tubo B: resultado positivo.

 

▶ Princípio

A β-galactosidase é uma enzima induzida por ser sintetizada apenas quando o organismo está na presença do substrato, sendo sua síntese controlada geneticamente. A β-galactosidase também é conhecida como lactase por degradar a lactose, embora também possa hidrolisar outros tipos de galactosídeos. Para que as bactérias fermentem a lactose, elas devem possuir duas enzimas específicas: a β-galactosidase permease (uma enzima-proteína de transporte ligada à membrana) e a β-galactosidase propriamente dita, que está localizada intracelularmente e é capaz de degradar a β-D-

lactose (um dissacarídeo) em β-glicose e β-galactose (Figura 6.23). Algumas bactérias que possuem a β-galactosidase mas não a β-galactosidase permease podem sofrer mutações e, após um período de dias ou semanas em presença do açúcar, podem passar a produzir a permease. Estas bactérias, denominadas fermentadores tardios para lactose, podem, desta forma, também utilizar o açúcar como fonte de energia. As bactérias que utilizam a lactose podem ser diferenciadas daquelas que não fermentam o açúcar, utilizando-se um composto denominado o-nitrofenil-β-galactopiranosídeo (ONPG). Este composto pode penetrar o interior da célula sem a ajuda da permease e, assim, reagir com a β-galactosidase, se esta estiver presente, gerando um produto de

cor amarela (Figura 6.24).

 

▶ Procedimentos

Inocular o material no meio contendo lactose e ONPG com auxílio de uma alça ou agulha estéril. O meio é então incubado a 37°C por 24 horas.

 

▶ Interpretação dos resultados

Os microrganismos capazes de utilizar a lactose possuem a enzima β-galactosidase e, desta forma, são capazes de hidrolisar o ONPG presente no meio, que inicialmente é incolor e, após sofrer hidrólise, libera o composto o-nitrofenol que possui uma cor

amarela em pH alcalino, dando um resultado positivo para o teste (Figura 6.25). Uma outra alternativa para o teste seria a utilização da lactose como única fonte de carbono no meio de crescimento. Desta forma, poderia ser utilizado o mesmo princípio do teste para fermentação de carboidratos descrito anteriormente, visto que apenas as bactérias que utilizam o açúcar seriam capazes de crescer no meio de cultura.

 

Figura 6.23 Hidrólise da lactose pela β-galactosidase.

Figura 6.24 Conversão do ONPG a β-galactose e o-nitrofenol pela β-galactosidase.

 

 

Figura 6.25 Resultados do teste ONPG. Tubo A: positivo; tubo B: controle não inoculado; tubo C: negativo. (Foto: Reproduzida, com permissão, de Leboffe; Pierce, 1999.)

 

Produção de H S (gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio) 2

▶ Objetivo

 

Este teste visa determinar se ocorre a liberação de ácido sulfídrico (H 2S) gasoso, promovida pela metabolização bacteriana de aminoácidos que contêm enxofre em sua estrutura. É muito utilizado para diferenciar membros positivos da família Enterobacteriaceae, especificamente dos gêneros Salmonella, Francisella e Proteus, dos membros negativos como Morganella morganii e Providencia rettgeri, além de outras bactérias como Escherichia coli e Shigella flexneri.

 

▶ Material

Meio contendo peptona (rica em aminoácido cisteína – fonte de enxofre), tiossulfato de sódio, além de sulfato ferroso; agulha de platina.

 

▶ Princípio

O catabolismo do aminoácido cisteína pela enzima cisteína dessulfurase durante o processo de putrefação, ou ainda pela redução do tiossulfato no processo de

anaerobiose, leva a uma redução do enxofre, produzindo gás sulfídrico (Figura 6.26). Nos processos de putrefação, aminoácidos contendo enxofre (por exemplo, a cisteína) sofrem degradação pela ação da enzima dessulfurase gerando ácido pirúvico, amônia e H2S como produtos finais de reação. A amônia e o sulfeto de hidrogênio são excretados, pois são produtos tóxicos para a célula, e o ácido pirúvico é mantido no interior da célula para a produção de energia, visto que ele é um intermediário do ciclo de Krebs. Nos processos de respiração anaeróbica, o enxofre inorgânico (neste caso, proveniente do tiossulfato adicionado ao meio) torna-se o aceptor final do elétron na cadeia transportadora de elétrons. Assim, as bactérias capazes de utilizar compostos que contêm enxofre em sua estrutura podem ser identificadas por este teste pela detecção do gás sulfídrico liberado no meio de reação.

 

Figura 6.26 Reação de putrefação envolvendo a cisteína dessulfurase produzindo H S. 2

 

▶ Procedimentos

Inocular o material a ser analisado com auxílio de uma agulha estéril de maneira perpendicular, da superfície até o fundo do tubo contendo o meio. Deve-se ter cuidado para não inocular em zigue-zague, pois o mesmo meio pode servir para testar a mobilidade ou não do microrganismo. Após a inoculação, o material é incubado por 24 a 48 horas, a 37°C.

*Observação: Uma alternativa para se realizar este teste seria a colocação de uma fita de papel de filtro embebida em uma solução de acetato de chumbo, na borda do

tubo-teste, tendo o cuidado para que ela não toque o meio de cultura (Figura 6.27). Este acetato de chumbo impregnado na fita é capaz de reagir com o H2S, caso este seja produzido pelo microrganismo a ser analisado.

 

Figura 6.27 Teste da fita impregnada com acetato de chumbo para detecção de H2S.

 

▶ Interpretação dos resultados

Se a cisteína, presente no meio, for hidrolisada pela dessulfurase, ou se o tiossulfato presente no meio for reduzido, então o sulfeto de hidrogênio será produzido. O sulfeto formado é capaz de se combinar com o sulfato ferroso para formar sulfeto de ferro (FeS), ou ainda, no caso do teste com a fita de papel, reagir com o acetato de chumbo, formando sulfeto de chumbo. Em ambos os casos,

observaremos um enegrecimento do meio (Figura 6.28) ou na extremidade da fita

(Figura 6.29), pois tanto o sulfeto de ferro como sulfeto de chumbo possuem uma coloração negra dando, portanto, positividade do teste. Nenhum enegrecimento pode ser considerado como um teste negativo. Um sumário dos resultados pode ser

observado na Figura 6.30.

Conforme o item Procedimento deste teste, o meio pode ser utilizado para verificarmos se o microrganismo em questão é móvel ou não. Sendo assim, caso ocorra uma turvação por completo do meio após o período de incubação, o microrganismo será considerado móvel porque ele cresceu além dos limites da

inoculação que foi feita de forma perpendicular e central no meio de cultura (Figura

6.31). Crescimento apenas no local da inoculação é prova de que o microrganismo testado é imóvel, ou seja, não é capaz de se mover além do ponto de inoculação (ver

Figura 6.31). No caso de microrganismos móveis e produtores de H2S, veremos a formação de uma mancha negra que se espalha por todo o meio de cultura (como

podemos observar na Figura 6.28).

 

Figura 6.28 Resultados para a redução de enxofre no meio SIM. No tubo A temos o controle não inoculado; no tubo B, um teste negativo para H2S; no tubo C, um teste positivo para H2S.

Figura 6.29 Teste de redução do enxofre com auxílio da fita com acetato de chumbo. No tubo A temos um teste negativo (fita de papel branca) e, no tubo B, um teste positivo (fita de papel enegrecida na extremidade).

 

Figura 6.30 Sumário dos resultados para a prova do H2S.

 

Teste do indol

▶ Objetivo

O teste do indol é a porção “I” dos quatro testes conhecidos como IMViC (Indol, vermelho de Metila, Voges-Proskauer e Citrato), e é utilizado para caracterizar e/ou identificar bactérias entéricas, que são capazes de produzir indol a partir do aminoácido triptofano por meio da ação da enzima triptofanase.

 

▶ Material

Meio SIM (também utilizado para detectar motilidade e produção de sulfeto de hidrogênio, como visto anteriormente, no item Produção de H S), contendo peptona 2 (que contém o aminoácido triptofano) e extrato de carne para promover o crescimento; reagente de Kovacs (composto de p-dimetilaminobenzaldeído, butanol e ácido clorídrico); agulha ou alça de platina.

Figura 6.31 Resultados do teste de motilidade no meio SIM. O teste é realizado fazendo-se a inoculação da amostra de forma perpendicular no centro do tubo contendo o meio semissólido. No tubo A temos o controle não inoculado; no tubo B temos um resultado de motilidade negativo (observar o crescimento apenas na região do inóculo) e, no tubo C, um teste de motilidade positivo (observar a turvação completa do meio, indicando crescimento além da região do inóculo).

 

▶ Princípio

O triptofano pode ser convertido, pelas bactérias possuidoras da enzima triptofanase, a indol, amônia (por desaminação) e ácido pirúvico como produtos finais

da reação (Figura 6.32). O ácido pirúvico pode então gerar energia através do ciclo de Krebs ou, então, entrar na via glicolítica e ser usado para sintetizar outros componentes importantes e necessários para a célula. A amônia gerada pode ser utilizada na síntese de aminoácidos, e o outro metabólito final gerado, o indol, pode ser identificado por este teste. Desta forma, a triptofanase diferencia as bactérias entéricas que são indol-positivas, como Escherichia coli e Proteus vulgaris, das bactérias entéricas indol-negativas, como Serratia marcescens e Enterobacter aerogenes.

Figura 6.32 Catabolismo do triptofano em organismos indol-positivos.

 

▶ Procedimentos

Um isolado é inoculado em um tubo contendo o meio SIM (que poderá ser sólido ou líquido) com uma agulha de inoculação estéril. O tubo é então incubado a 37°C por 24 a 48 horas. Após a incubação, 3 a 5 gotas do reagente de Kovacs são adicionadas à superfície do ágar para a revelação do teste. Uma alternativa para a prova, assim como foi demonstrado para o teste da produção do sulfeto de hidrogênio, é a utilização de uma fita embebida com o reagente de Kovacs colocada na borda do tubo-teste.

 

▶ Interpretação dos resultados

Em ambos os testes, seja ele feito diretamente no meio de cultivo ou utilizando a fita, o reagente de Kovacs contendo HCl e o dimetilaminobenzaldeído dissolvido no amil álcool reagem com o indol produzido pelos microrganismos indol-positivos, produzindo uma coloração róseo-avermelhada. Caso não ocorra mudança de cor, ou

seja, caso se verifique uma cor amarelada, o teste é considerado negativo (Figura

6.33).

 

Redução de nitrato

▶ Objetivo

Este teste é utilizado para detectar a habilidade de um microrganismo para reduzir nitrato (NO 3) a nitrito (NO2) ou outro composto nitrogenado, como o nitrogênio molecular (N 2), usando a enzima nitrogênio redutase.

Figura 6.33 Resultados para o teste do indol. O teste foi feito utilizando-se uma fita de papel impregnada com o reagente de Kovacs. No tubo A, negativo; no tubo B, positivo (observar a coloração róseo-avermelhada da fita).

 

▶ Material

Meio teste contendo extrato de carne, peptona e nitrato de potássio; reveladores: reagente I (solução acética de ácido sulfanílico), reagente II (solução acética de α-naftilamina); agulha ou alça de platina.

 

▶ Princípio

 

O nitrato (NO3) pode ser reduzido a diferentes compostos através de dois processos

metabólicos: respiração anaeróbica e denitrificação (Figura 6.34). Na respiração anaeróbica, o organismo usa o nitrato com o aceptor final de elétrons na cadeia respiratória, produzindo nitrito, amônia, nitrogênio molecular, óxido nítrico ou outro composto nitrogenado reduzido, dependendo da espécie. O teste se baseia exatamente na capacidade do microrganismo de reduzir o nitrato que é adicionado em excesso no meio de cultura.

▶ Procedimentos

Um isolado do microrganismo é inoculado no meio teste, contendo nitrato em excesso, com o auxílio de uma alça de platina estéril. O meio é então incubado por 24 a 48 horas, a 37°C.

 

▶ Interpretação dos resultados

Se o microrganismo possuir a enzima nitrato redutase, esta irá reduzir o nitrato a nitrito. Se a redução ocorrer, há também a formação de ácido nitroso, que, então, reage com o ácido sufanílico (reagente I), formando o ácido sulfanílico diazotado, o qual reage com a α-naftilamina (reagente II) para formar o composto p-sulfobenzeno-azo-α-

naftilamina, que possui uma cor vermelho-intensa (Figura 6.35), o que seria um resultado positivo para o teste.

A ausência de coloração no meio, após a adição dos reagentes reveladores, indica

negatividade para o teste (Figura 6.36).

 

Liquefação de gelatina (gelatinase)

▶ Objetivo

Este teste é utilizado para determinar a capacidade de um microrganismo produzir exoenzimas hidrolíticas, chamadas de gelatinases, que digerem e liquefazem a gelatina. Os produtos desta reação são aminoácidos que podem, evidentemente, ser transportados para o interior da célula onde podem ser facilmente utilizados para o fornecimento de energia como formação de material constitutivo do microrganismo. O teste pode ser utilizado para distinguir Staphylococcus aureus, patogênico e positivo para o teste, de S. epidermidis, que não é patogênico e positiva o teste mais tardiamente. No caso das enterobactérias, Serratia e Proteus são espécies tipicamente positivas, enquanto os outros representantes do grupo são geralmente negativos. Bacillus anthracis, B. cereus e vários outros membros do gênero são gelatinase-positivos, bem como Clostridium tetani e C. perfringens.

Figura 6.34 Produtos finais possíveis após a redução do nitrato. O estado de oxidação do nitrogênio em cada composto é mostrado em parênteses.

 

Figura 6.35 Reação para detecção de redução do nitrato.

 

Figura 6.36 Resultados para o teste de redução do nitrato. Após a adição dos reagentes I e II para revelação da prova, uma alteração de cor para o vermelho (tubo C) é considerada resultado positivo, enquanto a inalteração da cor do meio (tubo B) é considerada um resultado negativo para o teste. O tubo A representa o tubo-controle não inoculado.

 

▶ Material

Tubo contendo o meio para o teste, constituído basicamente de extrato de carne e peptona para promover o crescimento, e uma grande quantidade de gelatina (aproximadamente 120 g/ℓ), o que leva à gelificação do meio; alça de platina.

 

▶ Princípio

Muitas das fontes de nutrientes, disponíveis para os microrganismos no meio exterior, possuem uma grande estrutura que dificulta a sua penetração no interior da célula. Por isso, algumas bactérias são capazes de produzir e secretar enzimas que hidrolisam essas moléculas em subunidades menores, as quais a célula poderá usar sem maiores problemas. A gelatina é um derivado do colágeno, e sua hidrólise pela ação da enzima gelatinase é feita em duas etapas: na primeira etapa, a gelatina é hidrolisada, gerando polipeptídeos que, em uma segunda etapa, também por ação das gelatinases, são hidrolisados, liberando, então, os aminoácidos.

 

▶ Procedimentos

Um isolado é inoculado em um tubo contendo o meio com gelatina com o auxílio de uma agulha estéril, sendo que a inoculação deve ser feita no centro do meio de cultura, indo até o fundo do tubo. O meio é mantido então por 24 a 48 horas, a 37°C.

 

▶ Interpretação dos resultados

Os microrganismos gelatinase-positivos promovem liquefação do meio contendo a gelatina, o que pode ser facilmente observado por uma leve inclinação do tubo-teste, ao passo que, no caso de o teste ser negativo, o meio permanecerá sólido. Deve-se ter bastante cuidado com resultados falsamente positivos, visto que a gelatina se liquefaz facilmente a temperaturas superiores a 28°C. Por isso, deve-se sempre fazer um tubo-controle, não inoculado com o material, mantido junto dos outros tubos durante todo o tempo de incubação. Após a incubação, este tubo é resfriado em geladeira e deve voltar ao estado gelificado (assim como o tubo-teste negativo), enquanto o tubo que sofre ação das gelatinases (teste positivo) não voltará a se solidificar, porque a gelatina

foi hidrolisada a aminoácidos e não pode sofrer novamente gelificação (Figura 6.37).

Figura 6.37 Resultados do teste de liquefação da gelatina (gelatinase). No tubo A temos um teste positivo para a prova. Observar que o tubo B permanece solidificado, sendo considerado um teste negativo para a prova de liquefação da gelatina.

 

 

Outros métodos de identificação

Além das provas bioquímicas isoladas, descritas anteriormente, podemos utilizar métodos de identificação rápida em que teríamos várias provas bioquímicas realizadas em um mesmo conjunto ou suporte, sendo que eles poderão ser realizados manualmente ou com a utilização de aparelhos de leitura (automatização). Hoje em dia, uma grande variedade de sistemas de identificação chamados de “sistemas multitestes” está disponível comercialmente. Esses sistemas contêm vários testes bioquímicos em uma única unidade e permitem uma rápida identificação bacteriana sem grande consumo de tempo e custos na preparação de vários meios, além do período de espera.

Como exemplo deste tipo de metodologia podemos citar os sistemas de identificação API® (bio-Mérieux), bem conhecidos e amplamente utilizados.

O API®, utilizado para a identificação de bactérias por meio de um complexo de provas bioquímicas, consiste em uma cartela com vários meios que podem acomodar até 20 testes bioquímicos. Ele contém vários poços com os meios específicos para as provas bioquímicas, as quais, em vez de serem feitas de forma separada, como descrevemos anteriormente neste capítulo, são realizadas todas em conjunto na mesma cartela. A inoculação da colônia do microrganismo a ser testado, que deve estar devidamente isolada, é feita por meio de sua suspensão em um líquido de dispersão, que pode ser salina estéril, por exemplo, que funcionará também como forma de

hidratar os meios que se apresentam originalmente desidratados (Figura 6.38).

A inoculação da amostra é feita ao se adicionarem gotas da suspensão bacteriana em cada poço, sendo que, posteriormente, a cartela é incubada a 37°C, por 18 a 24 horas. Os compartimentos são examinados, e os testes, anotados como positivo ou

negativo, com base nas mudanças de cor (Figura 6.39).

Os testes são ordenados geralmente em grupos de três, e cada teste positivo dentro de um grupo é especificado com um número. A soma final dos números dentro de cada grupo vai gerar um número de até 9 dígitos, denominado número de identificação (ID). Portanto, a combinação dos resultados dos testes fornece um único número ID para

cada microrganismo (Figura 6.40). O número final é comparado a uma tabela ou inserido em um banco de dados, que fornecerá a identidade do microrganismo desconhecido. Os sistemas API® disponíveis no mercado servem para a identificação de Enterobacteriaceae (API® 20E), para estafilococos (API® STAPH) e para estreptococos (API® 20 STREP).

 

Figura 6.38 API® (bioMérieux). O sistema de multitestes, no formato de pequenos poços chamados de microtubos, possui vários compartimentos contendo meios para identificação bioquímica. (Foto: Banco de imagens oficial bioMérieux.)

Figura 6.39 API® 20E* (bioMérieux) não inoculado (A) e inoculados (B). A ilustração mostra as provas que são realizadas no sistema multitestes, em que os resultados positivos e negativos para os testes podem ser observados pela mudança de cor da prova, após inoculação da amostra líquida nos poços e incubação da fita a 37 oC. Um tubo não inoculado é mostrado na parte superior. *Essa tira, ideal para a identificação de enterobactérias, oferece os seguintes testes (da esquerda para a direita): ONPG: β-galactosidase; ADH: arginina deidrolase; LDC: lisina descarboxilase; ODC: ornitina descarboxilase; CIT: utilização do citrato; H 2S: produção de H2S; URE: urease; TDA: triptofano desaminase; IND: produção de indol; VP: Voges-Proskauer; GEL: gelatinase; GLU: glicose; MAN: manitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: ramnose; SAC: sacarose; MEL: melibiose; AMY: amigdalina; ARA: arabinose.

 

Atualmente, a identificação do microrganismo, por meio da leitura manual dos resultados, pode ser feita também com auxílio de um banco de dados disponibilizado gratuitamente no site do fabricante (ApiWeb™), o que faz com que a identificação seja feita de forma simples e esteja acessível a todos em qualquer momento e em qualquer lugar pela internet.

Raramente ocorre de mais de um microrganismo apresentar o mesmo ID, mas, caso isso ocorra, outro teste diferente dos utilizados no sistema multiteste deverá ser

usado para a diferenciação. Na Figura 6.41 encontram-se exemplos de provas bioquímicas que identificam cinco espécies de bactérias diferentes, através do sistema multitestes, em que podemos observar resultados positivos (+) e negativos (–).

Mais recentemente, a linha de produtos API® (bioMérieux) lançou um novo

equipamento, o Vitek®2 (Figura 6.42) que auxilia na identificação de espécies bacterianas, de forma rápida e segura, pois o mesmo é capaz de ler e interpretar as cartelas de testes bioquímicos automaticamente. Após a leitura, e com auxílio de um software integrado, o equipamento informa o gênero e a espécie do microrganismo identificado.

Atualmente as identificações das espécies bacterianas (bem como fungos filamentosos e leveduras) podem ser feitas por meio do método de ionização de dessorção por laser assistido por matriz do tempo do espectrômetro de massa de voo, que é a metodologia conhecida como MALDI-TOF MS (nome formado pelas iniciais em inglês matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry), que fornece mais rapidez (pode-se ter a análise em poucos minutos) e precisão, com altíssimo grau de confiabilidade. A grande vantagem dessa metodologia é o fato de que a análise do material ocorre diretamente de culturas clínicas microbianas, para fornecer identificação precisa do microrganismo, baseada no princípio de que microrganismos apresentam moléculas diferentes e também em quantidades diferentes entre si, literalmente como uma impressão digital das moléculas, o que acaba funcionando como uma identidade para cada microrganismo. Embora a análise em si não apresente um alto custo financeiro, pois os reagentes necessários não são caros, infelizmente, o alto custo do espectrômetro de massa

(Figura 6.43), equipamento necessário para a metodologia, inviabiliza o uso da técnica na maioria dos laboratórios clínicos, ficando praticamente restrito a laboratórios de pesquisas ou institutos de referência na identificação de espécies.

Figura 6.40 Exemplo de identificação por meio do API® 20E (bioMérieux). O exemplo mostrado na figura é o resultado do sistema API® 20E para identificação de enterobactérias. Por meio da observação de provas positivas e negativas, chega-se ao número final 5144572, que, na tabela de identificação do fabricante, corresponde à bactéria E. coli.

 

Figura 6.41 Sistema de multitestes API® (bioMérieux). O exemplo mostrado na figura é o sistema API® 20E, utilizado para identificação das enterobactérias: Klebsiella pneumoniae (A), Enterobacter cloacae (B), Proteus mirabilis (C), Stenotrophomonas maltophilia (D) e Escherichia coli (E). (Foto: Erica Nogueira, ALN Soluções e Sistemas.)

Figura 6.42 Vitek®2, em versão compacta. Equipamento para leitura das fitas multitestes API® (bioMérieux). (Foto: Banco de imagens oficial bioMérieux.)

 

Figura 6.43 Vitek MS™, espectrômetro de massa utilizado para a técnica de MALDI-TOF. (Foto: Banco de imagens oficial bioMérieux.)