Seção 2 | Prática

 

Observação de microrganismos por microscopia óptica

 

Objetivos

 

■ Manusear adequadamente um microscópio óptico

■ Conhecer os principais métodos de observação microscópica de

microrganismos

■ Distinguir, morfologicamente, bactérias, leveduras, bolores e

protozoários

■ Identificar os principais tipos morfológicos das bactérias

■ Discutir a importância do método de Gram na identificação de

microrganismos.

 

Material

 

■ Lâminas prontas com coloração de esporos de Bacillus megaterium

■ Lâminas prontas com bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis) e gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa)

■ Cultura de E. coli em caldo simples

■ Cultura de Saccharomyces cerevisiae em ágar Sabouraud

■ Cultura de Aspergillus versicolor em ágar Sabouraud

■ Cultura de Herpetomonas sp. em meio líquido de BHI (brain heart

infusion)

■ Cultura de E. coli em ágar simples

■ Cultura de S. aureus em ágar simples

■ Cultura de B. subtilis em ágar simples ■ Lâminas limpas

■ Lamínulas limpas

■ Baterias para Gram (solução de cristal violeta, lugol, álcool a 95%,

solução de safranina ou fucsina)

■ Óleo de imersão

■ Solução salina estéril

■ Microscópios ópticos

■ Placas com microrganismos do ambiente (ver Capítulo 1, Mundo dos

Microrganismos)

■ Alças e agulhas de inoculação.

 

Procedimentos

 

▶ 1a etapa. Observação microscópica de lâminas prontas:

■ Esporos de B. megaterium (cultura com mais de 48 horas de

crescimento), corados pelo método de Schaeffer-Fulton

■ Bactérias coradas pelo método de Gram: B. subtilis (gram-positiva), S.

aureus (gram-positiva) e E. coli (gram-negativa)

■ Observar ao microscópio óptico com objetiva de 10×, focalizando a

amostra. Adicionar sobre o esfregaço das lâminas prontas uma pequena

gota de óleo de imersão e examinar ao microscópio óptico com objetiva

de imersão (100×).

▶ 2a etapa. Preparação de lâminas para observações microscópicas. (O aluno deverá escolher um microrganismo para preparação a fresco e um microrganismo para coloração de Gram.)

■ Preparação a fresco de E. coli: após flambar a alça de inoculação,

colocar uma gota de suspensão bacteriana em uma lâmina e cobrir com

uma lamínula. Adicionar uma pequena gota de óleo de imersão e

observar em microscópio óptico com objetiva de imersão (100×)

Preparação a fresco de S. cerevisiae: retirar, com uma alça de ■ inoculação flambada, uma porção do crescimento da levedura e

suspender em uma gota de solução salina em uma lâmina. Cobrir com

lamínula e observar ao microscópio óptico com objetiva de 40×

■ Preparação a fresco de A. versicolor: cuidadosamente, para não alterar

as estruturas fúngicas, retirar com alça flambada uma porção do

crescimento do fungo e suspender em uma gota de solução salina em

uma lâmina. Observar ao microscópio óptico, entre lâmina e lamínula,

com objetiva de 40×

■ Preparação a fresco de Herpetomonas: Retirar, com uma alça flambada,

uma porção do crescimento em meio líquido do protozoário e colocar

sobre uma lâmina. Cobrir cuidadosamente com uma lamínula. Observar

ao microscópio óptico com objetiva de 40×.

▶ 3a etapa. Coloração de Gram:

■ Colocar uma pequena gota de solução salina sobre uma lâmina de

microscópio. Flambar uma alça e com ela retirar uma pequena porção

do crescimento bacteriano (E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa ou S.

aureus). Colocar a porção sobre a gota de salina e espalhar, obtendo

assim o esfregaço. Deixar secar espontaneamente.

■ Fixar o esfregaço à lâmina, segurando-a com um pregador de madeira e

passando-a três vezes sobre a chama do bico de Bunsen com a parte do

esfregaço para cima. A Figura 4.11 ilustra o procedimento da obtenção

de um esfregaço.

■ Proceder à coloração de Gram:

∘ Tratar o esfregaço com uma solução de cristal violeta durante 1 a 2

minutos

∘ Lavar ligeiramente com água. Escorrer

∘ Cobrir o esfregaço com lugol durante 1 a 2 minutos

∘ Descorar rapidamente pelo álcool a 95%

∘ Lavar ligeiramente com água. Escorrer

∘ Cobrir com uma solução de safranina ou de fucsina, durante 30

segundos, para contracorar

∘ Lavar e enxugar entre dois papéis-filtro, com cuidado, sem esfregar

∘ Adicionar sobre o esfregaço corado uma pequena gota de óleo de

imersão e examinar ao microscópio óptico com objetiva de imersão (100×).

▶ 4a etapa. Observação de microrganismos do ambiente. A partir das placas expostas ao ar, bem como de outras placas contendo microrganismos

de diversas origens (bancada, dedo, cabelo etc.), mencionadas no Capítulo 1 Mundo dos Microrganismos, observar os diversos tipos de colônias crescidas. Com auxílio do professor, escolher uma colônia de bactéria e outra de fungo para estudo.

■ Colônia bacteriana: realizar a coloração de Gram, como descrito na 3a

etapa. Observar:

■ Colônia fúngica: preparar lâmina a fresco com solução salina, como

descrito na 2a etapa. Observar.

 

Interpretação dos resultados

 

▶ 1a etapa. Observação de lâminas prontas:

■ Observar lâminas de B. megaterium (Figura 4.48 G). Distinguir os

esporos, corados em verde, das células vegetativas, coradas em

vermelho. Observar esporos dentro e fora da célula

■ Observar lâminas de bactérias coradas pelo método de Gram (Figura

4.48D a F). Distinguir o tamanho, a forma (coco ou bastonete) e a

reação ao Gram: roxas, gram-positivas; vermelhas ou rosadas, gram-

negativas. Observar alguns arranjos característicos.

▶ 2a etapa. Observação de lâminas preparadas pelo aluno: ■ Observar, na preparação a fresco de E. coli, seu tamanho relativo, sua

forma e sua locomoção

■ Observar S. cerevisiae (Figura 4.48A) quanto a forma, tamanho relativo

e presença ou ausência de brotamento

 

Figura 4.48 Exemplos de preparações em lâminas. A. Preparação a fresco em microscopia óptica de campo claro da levedura S. cerevisiae 1.000×. B. Microscopia óptica de contraste diferencial interferencial do fungo F. pedrosoi 400×. (Foto: Daniela Sales Alviano.) C. Microscopia óptica de contraste de fase do protozoário Herpetomonas samuelpessoai 100× mostrando o flagelo (seta) e o corpo da célula (ponta da seta). (Foto: André Luiz de Souza Santos.) D. Microscopia de campo claro de amostras coradas pelo método de Gram; bastonete gram-positivo B. subtilis 1.000×. E. Microscopia de campo claro de amostras coradas pelo método de Gram; bastonete gram-negativo E. coli 1.000×. F. Microscopia de campo claro de amostras coradas pelo método de Gram; cocos gram-positivos S. aureus 1.000×. G. Microscopia óptica de campo claro, coloração de esporos de B. megaterium, esporos em verde e células em vermelho 1.000×.