Microscópio óptico ou de luz

 

O microscópio de luz utiliza a luz visível ou a luz ultravioleta para gerar a imagem de um objeto que normalmente está colocado sobre uma lâmina de vidro. A luz visível é formada pela associação de um conjunto de radiações eletromagnéticas que possuem comprimento de onda entre 380 e

750 nm (Figura 4.2). Como uma dada radiação não pode exibir detalhes estruturais menores que o seu comprimento de onda, o limite de resolução de um microscópio de luz é de aproximadamente 0,5 μm, o que permite a observação de células e até de organelas como núcleo, cloroplasto e mitocôndria. Organelas ou detalhes de estruturas menores do que 0,5 μm são impossíveis de serem resolvidos (distinguidos) ao microscópio de luz, devido à interação da luz branca com o objeto, como será descrito mais adiante.

A maioria dos microscópios atuais é capaz de fornecer um aumento final de até 1.200 vezes, dependendo da sua configuração (tipo de lentes e

de condensadores) (Figura 4.3). No entanto, não é suficiente apenas ampliar uma imagem, é necessário também poder resolver (distinguir) pequenos detalhes de uma estrutura. A resolução é a capacidade que um sistema óptico tem de distinguir objetos separados por pequenas distâncias. Define-se como limite de resolução a distância mínima entre dois objetos a partir da qual estes podem ser vistos como entidades individualizadas. O limite de resolução de um microscópio depende do comprimento de onda da radiação eletromagnética utilizada na iluminação do objeto e da abertura numérica do sistema de lentes, que, em termos mais simples, é a capacidade da lente objetiva de captar a luz que passa pelo objeto.

O limite de resolução do microscópio de luz é de aproximadamente 0,2 μm e é conseguido pela seguinte fórmula:

Nela, D é o limite de resolução, ou seja, a menor distância entre dois detalhes separáveis; λ, o comprimento de onda da luz visível cujo valor

mais comumente utilizado é 0,5 μm; e NA, a abertura numérica (Figura

4.4).

A abertura numérica é definida pela fórmula:

 

NA = η sen α

 

Nela, α corresponde à metade do ângulo de abertura, que é aquele que possui seu vértice no ponto em que o eixo óptico do microscópio encontra o objeto e é formado pelos raios extremos que ainda podem penetrar a objetiva. O maior valor de α é 90°, quando o seno de α é igual a 1. Define-se η como o índice de refração (razão entre a velocidade da luz em um determinado meio e a velocidade da luz no vácuo) do meio intercalante, que é o espaço que a luz tem de percorrer depois que deixa o objeto até alcançar a lente objetiva. Quando se utiliza uma lente seca, ou seja, o ar é o meio intercalante, η = 1, mas, quando são utilizadas lentes de imersão, como as que usam óleo, η = 1,4, pois o índice de refração do óleo é mais elevado

que o do ar (Figura 4.5). Na verdade, o índice de refração do óleo de imersão é próximo ao do vidro utilizado na confecção das lâminas histológicas que servem de suporte aos diversos tipos de objetos a serem analisados.

Figura 4.2 Espectro das radiações eletromagnéticas. Dentro do espectro eletromagnético, existem diversas categorias de radiações com diferentes comprimentos de onda e níveis de energia. A luz visível é formada por comprimentos de onda que vão de 380 nm (luz azul) até 750 nm (luz vermelha). A luz visível e a ultravioleta são utilizadas em microscopia óptica.

Figura 4.3 Esquema simplificado de um microscópio óptico de campo claro. As principais partes do equipamento são indicadas diretamente na figura.

Figura 4.4 Abertura numérica. A luz é focada sob o objeto pela lente condensadora. Após atravessar o objeto, a luz é então coletada pela lente objetiva. A abertura numérica é determinada pelo ângulo do cone de luz que entra na lente objetiva (α) e pelo índice de refração do meio intercalante, que pode ser ar ou óleo.

 

Se fizermos um ensaio rápido utilizando a fórmula do cálculo do limite de resolução, para ver a importância da abertura numérica na qualidade da imagem, poderemos observar que, utilizando uma mesma lente objetiva com valor de seno de α igual a 1, vemos que, para uma lente seca cujo índice de refração do ar é igual a 1, o limite de resolução será igual a 0,3 μm, enquanto para a lente de imersão em óleo, cujo índice de refração é 1.515, o limite de resolução será de 0,22 μm.

Desta maneira, a observação de microrganismos como fungos, protozoários e algas pode ser feita com objetivas secas. No entanto, para observação de detalhes da estrutura desses microrganismos ou para a observação de bactérias é necessário o uso de lentes objetivas de imersão.

Figura 4.5 Lentes de imersão e resolução. Nesta ilustração, vemos que a luz que atravessa a lâmina de vidro e o objeto a ser analisado sofre um desvio (refração) causado pela diferença no índice de refração do ar em relação ao do vidro. Alguns raios se perdem para fora da abertura da lente objetiva. Além disso, o ângulo α será menor, diminuindo o poder de resolução. Quando se utiliza uma lente de imersão em óleo, dois fenômenos ocorrem: (a) a distância focal da objetiva é menor (a lente praticamente encosta no objeto), o que aumenta sensivelmente o ângulo α; (b) com o uso do óleo de imersão como meio intercalante, os raios luminosos não sofrem desvios, aumentando a qualidade da imagem.

 

Outro termo muito utilizado em microscopia é o poder de resolução, que nada mais é que uma grandeza inversamente proporcional ao limite de resolução. Quanto menor o limite de resolução do seu microscópio, maior será seu poder de resolução, e vice-versa.

 

Trajetória da luz no microscópio óptico | Vantagens e desvantagens

A trajetória da luz em um microscópio óptico não corresponde exatamente ao modelo teórico fundamentado nos estudos de óptica geométrica. A luz cria diferentes rotas decorrentes da sua interação com tipos distintos de materiais que pertencem aos microscópios (lentes, aberturas, anéis de difração, espelhos) ou não (lâminas, o próprio objeto a ser examinado, o tipo de meio intercalante). As interações, elucidadas na

Figura 4.6, podem ser definidas como:

 

■ Transmissão: quando a luz pode ser transmitida através de um objeto

■ Reflexão: quando a luz branca incide sobre um objeto, alguns ou um

único comprimento de onda pode não penetrar o objeto sendo refletido,

determinando sua cor

■ Difração: quando a luz é quebrada em diferentes comprimentos de onda

após atravessar orifícios muito reduzidos denominados aberturas

■ Absorção: quando o objeto absorve a luz total ou parcialmente. Alguns

materiais podem absorver um determinado comprimento de onda

(excitação) para, então, emitir luz visível (emissão) com um

comprimento de onda maior e com menos energia que a energia de

excitação. Nesse caso, estamos diante do fenômeno de fluorescência

■ Refração: quando a luz sofre desvios ao passar através de meios com

densidades diferentes ou de diferentes formas de lentes de vidro.

 

As interações da luz com as lentes dos microscópios causam distorções na imagem formada do objeto que quase sempre são percebidas pelo observador como falta de foco ou definição final da imagem. As distorções mais clássicas da microscopia óptica são chamadas de “aberrações” e ocorrem por diferenças no plano de foco do feixe de luz paralela que entra

pelas lentes do microscópio (Figura 4.7). As aberrações cromáticas são derivadas dos diferentes planos de foco de cada um dos comprimentos de

onda que formam a luz branca (Figura 4.7A). As aberrações esféricas são causadas pelo formato das lentes que desviam certos componentes do feixe

luminoso, provocando diferentes planos de foco (Figura 4.7B). A curvatura de campo faz com que a imagem de um objeto plano seja curva, ou seja, um objeto terá foco apenas na região central. É necessário girar o botão micrométrico para ver as regiões periféricas em foco. Esse tipo de aberração não impede a observação direta, porém impossibilita a aquisição de imagens de boa qualidade.

 

Figura 4.6 Interação da luz com objetos de composição diferente. A. A luz pode ser transmitida através de um objeto. B. A luz pode ser refletida por um objeto (neste exemplo, a luz branca é totalmente refletida, e o objeto aparece em branco). C. A luz pode ser absorvida pelo objeto, criando a cor negra.D. A luz pode ser absorvida e reemitida em um comprimento de luz maior que o incidente, gerando a fluorescência. E. A luz, ao passar por determinados tipos de objetos, pode sofrer refração, ou seja, pequenos desvios de rota. Esse tipo de interferência é utilizado nos microscópios para gerar o aumento das suas lentes.

Figura 4.7 Refração da luz nas lentes do microscópio óptico. Em virtude do formato e da composição das lentes de um microscópio, a luz do feixe luminoso pode sofrer diferentes desvios, criando o aumento ou corrigindo as aberrações geradas durante a interação da luz com os objetos a serem observados. Em A, observamos o comportamento de dois comprimentos de onda diferentes quando atravessam uma lente convexa-convexa. O plano de foco da luz de maior comprimento de onda (vermelho) é mais distante que o plano de foco da luz de menor comprimento de onda (azul), o que gera a aberração cromática. Em B, vemos o comportamento do feixe luminoso criando a aberração esférica e a utilização de lentes especiais para sua correção. A luz que passa pela periferia da lente (raios marginais) possui um plano focal mais próximo à lente que os raios que passam pelo centro da lente (raios axiais). Diferentes tipos de lentes são então utilizados para efetuar a correção necessária para que os diferentes raios se encontrem no mesmo plano focal. O tipo de correção oferecido pelas lentes acromáticas e apocromáticas pode ser facilmente observado.

 

Aberrações são corrigidas com o uso de lentes compostas formadas por até 10 lentes inseridas no corpo de uma lente objetiva, onde são combinados formatos e materiais diferentes para que se façam as correções necessárias

(Figura 4.8). A correção das aberrações reflete-se no preço final de uma lente objetiva, e para isso existem diferentes tipos que podem ser utilizados de acordo com a necessidade de cada tipo de trabalho. Os seguintes tipos de lentes objetivas podem ser encontrados:

 

■ Acromática: apresenta a melhor correção da aberração cromática para a

região central do espectro de luz visível. São satisfatórias para a

observação direta, pois nosso olho é mais sensível exatamente ao

comprimento de onda verde

■ Semiacromática: é também chamada de fluorita, pois tem esse m-

seaterial em sua composição

■ Apocromática: faz a correção da aberração cromática sobre todo o

espectro visível

■ Planacromática: apresenta correção equivalente à das acromáticas e

correção de curvatura de campo

■ Planapocromática: apresenta correção equivalente à das apocromáticas

e correção de curvatura de campo.

 

As objetivas são identificadas por uma série de códigos impressos no corpo de cada uma delas, os quais fornecem todas as informações necessárias para se escolher a melhor para observação de diferentes

amostras (Figura 4.9).

A observação de amostras biológicas ao microscópio óptico necessita, na maioria dos casos, de algum método que aumente o contraste do material, que é normalmente muito translúcido. Isso pode ser feito utilizando-se colorações ou alguns tipos especiais de microscópios ópticos com maneiras diferentes de tratar o feixe luminoso, que gerem contrastes em diferentes áreas do material biológico. Os microscópios ópticos com sistemas de contraste possibilitam a observação de células vivas, o que normalmente não pode ser feito após a coloração, pois os métodos de coloração exigem a fixação química das amostras, causando morte celular.

Figura 4.8 Constituição das lentes objetivas. Em um microscópio óptico, elas são compostas por números diferentes de pequenas lentes inseridas no seu interior. É importante notar também que, além do número de lentes, sua composição, o formato de cada uma delas e o espaço entre cada grupo de lentes variam para gerar desvios do feixe luminoso (refração), corrigindo os diferentes tipos de aberrações.