Meio de cultura

 

O meio de cultura consiste em um material nutritivo, preparado em laboratório, que se destina ao cultivo artificial dos microrganismos, devendo, portanto, fornecer os nutrientes indispensáveis a seu crescimento. Pode ser líquido, sólido ou semissólido.

Os meios líquidos são preparados com seus ingredientes em água purificada (destilada, deionizada ou osmolizada) e podem ser

acondicionados em balões, Erlenmeyers (ver Figura 2.1A), ou tubos de

vidro (ver Figura 2.1D). Os meios sólidos são acrescidos de um agente solidificante, o ágar, normalmente na concentração de 1 a 2%. Este consiste em um polímero, o ácido poligalacturônico, extraído de algas marinhas, que é capaz de se fundir a cerca de 100°C e, ao se resfriar, solidificar a cerca de 40 a 45°C. Geralmente são acondicionados em tubos de vidro na forma de

ágar inclinado (ver Figura 2.1B, ou em placas de Petri (ver Figura 2.1C). No preparo do meio sólido, após adição do ágar a seus componentes, faz-se a esterilização normal, em autoclave, durante a qual o ágar é fundido, sendo então o meio vertido nas placas previamente esterilizadas, e sua solidificação então aguardada, o que ocorre quando a temperatura ambiente é alcançada. Já os meios semissólidos contêm ágar em concentrações menores, em torno de 0,3 a 0,5%, e normalmente são distribuídos em tubos de vidro na posição vertical.

 

Meios sintéticos e meios complexos

 

Dependendo do tipo de microrganismo que será cultivado, o meio de cultura poderá ser sintético, também chamado de quimicamente definido. Neste caso, todos os ingredientes são conhecidos, possuindo composição química exata. São bastante úteis em trabalhos experimentais de laboratório. Um exemplo deste tipo de meio é o de caldo de glicose-sais

minerais, descrito no Quadro 5.1. Esse meio contém uma fonte de C orgânica, a glicose, uma fonte de N inorgânica, o NaNO 3, uma fonte de P inorgânica, o K 2HPO4, uma fonte de S inorgânica, o MgSO4.7 H2O, NaCl e água. É considerado um meio pobre em nutrientes, já que contém apenas o mínimo de ingredientes necessários ao desenvolvimento do microrganismo. Várias espécies microbianas do grupo dos quimioeterotróficos prototróficos são capazes de crescer neste tipo de meio. Os microrganismos quimioeterotróficos são aqueles que necessitam de uma fonte de carbono orgânica e uma fonte de energia química, e no caso do meio de cultura

descrito do Quadro 5.1 a glicose desempenha esse duplo papel. Já os seres prototróficos são aqueles capazes de crescer sem nenhuma exigência nutritiva em termos de vitaminas, ou qualquer outra molécula orgânica que não sejam capazes de sintetizar a partir da fonte de C orgânica simples, como é o caso de alguns aminoácidos. Essas substâncias essenciais ao desenvolvimento do microrganismo são chamadas de fatores de crescimento.

Diferentemente do exemplo do Quadro 5.1, no qual o meio de cultura é composto de apenas seis substâncias, alguns meios quimicamente definidos podem conter um número bastante grande de ingredientes. Este é o caso do

meio descrito no Quadro 5.2, que possui ao todo 48 ingredientes, incluindo aí duas fontes de C, uma fonte de N, duas fontes de P, uma fonte de S, água, além de aminoácidos, purinas e pirimidinas, vitaminas e elementos-traço. O microrganismo que exige esse tipo de meio de cultura para crescer também é quimioeterotrófico, sendo auxotrófico para vários fatores de crescimentos (os aminoácidos, as purinas e pirimidinas e as vitaminas), ou seja, dependente desses vários fatores de crescimento para sobreviver. Esse tipo de microrganismo, nutricionalmente mais exigente, é comumente conhecido como fastidioso.

 

Quadro 5.1 Meio sintético simples, de caldo de glicose-sais minerais, para crescimento de diversas bactérias quimioeterotróficas.

 

Ingredientes Quantidade

 

Glicose 5,0 g

 

NaNO 3 1,0 g

 

K 2HPO4 2,0 g

 

MgSO 4.7 H2O 1,0 g

 

NaCl 0,5 g

 

Água puri cada destilada, q.s.p. 1.000 mℓ

 

Quadro 5.2 Meio sintético mais elaborado, típico para crescimento de microrganismos nutricionalmente mais exigentes, chamados fastidiosos.

 

Ingredientes Quantidade

 

Glicose 25 g

 

Acetato de sódio 20 g

 

K 2HPO4 0,6 g

KH2PO4 0,6 g

 

NH4Cl 3 g

 

MgSO 4.7 H2O 0,1 g

 

Aminoácidos: alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteína, 100 a 200 mg cada

glutamato, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina,

lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina,

triptofano, tirosina, valina

 

Purinas e pirimidinas: adenina, guanina, uracila, xantina 10 mg cada

 

Vitaminas: biotina, folato, ácido nicotínico, piridoxal, piridoxamina, 10 a 20 mg cada

piridoxina, ribo avina, tiamina, pantotenato, ácido p-

aminobenzoico

 

Elementos-traço: Fe, Co, Mn, Cu, Ni, Mo 2 a 10 mg cada

 

Água puri cada destilada, q.s.p. 1.000 mℓ

 

No entanto, o meio de cultura também poderá ser complexo e conter ingredientes complexos, como extrato de carne, rico em vitaminas e outros fatores de crescimento orgânicos, e cuja composição química exata não seja conhecida. Além do extrato de carne, que compreende um pó, obtido da digestão de carne bovina, vários outros extratos também são muito utilizados nos meios de cultura complexos: os extratos de levedura e de malte, fabricados da mesma maneira, bem como as peptonas e outros hidrolisados parciais de proteínas, como a caseína, que é a proteína encontrada no leite. Todos esses ingredientes são encontrados comercialmente no mercado e podem ser utilizados facilmente para o preparo de meios. Em geral os meios complexos são adequados ao crescimento de microrganismos heterotróficos auxotróficos, como algumas bactérias comensais e patogênicas para homens e animais. A grande vantagem dos meios complexos é que a adição de um único ingrediente já garante a presença de uma ampla gama de substâncias necessárias ao crescimento do microrganismo.

No Quadro 5.3 encontramos a composição do meio de caldo simples, ou caldo nutriente, bastante utilizado no cultivo de bactérias heterotróficas, por exemplo, as enterobactérias. Neste caso, são utilizados apenas quatro ingredientes que vão suprir adequadamente as exigências nutritivas da maioria dos microrganismos fastidiosos.

 

Quadro 5.3 Meio complexo de caldo simples, para o cultivo de bactérias heterotróficas.

 

Ingredientes Quantidade

 

Peptona 5,0 g

 

Extrato de carne 3,0 g

 

Cloreto de sódio 8,0 g

 

Água destilada, q.s.p. 1.000 mℓ

 

Meios seletivos e diferenciais

 

Os meios seletivos são utilizados para o isolamento de um grupo particular de microrganismos, ou seja, são meios de cultura adicionados de substâncias químicas que vão propiciar o desenvolvimento dos microrganismos de interesse e inibirão o desenvolvimento dos microrganismos acompanhantes (“microbiota de acompanhamento”). Essa inibição pode ser obtida por diferentes substâncias, tais como os antibióticos, os corantes, a bile ou os sais biliares. Um meio adicionado do antibacteriano estreptomicina possibilitará o isolamento de fungos, da mesma forma que a adição do antifúngico ciclo-heximida ao meio permitirá o isolamento de bactérias. Em outros meios, o sistema de seleção do microrganismo de interesse é mais complexo, por exemplo o meio de Thayer-Martin, utilizado no isolamento de bactérias patogênicas do gênero Neisseria, que pode ser adicionado de uma mistura de inibidores, composta por vancomicina para inibição de bactérias gram-positivas, colistina para inibição de bactérias gram-negativas e nistatina para inibição de fungos. Muitas vezes, para a seleção do microrganismo de interesse, pode-se lançar mão de outros recursos, por exemplo, a utilização de um meio cuja única fonte de carbono seja a celulose ou o amido, de modo a isolar somente os microrganismos celulolíticos ou amidolíticos, respectivamente.

Já os meios diferenciais são formulados para evidenciar uma característica bioquímica ou fisiológica do microrganismo de interesse, possibilitando diferenciar suas colônias das de outros microrganismos que se desenvolvam na mesma placa. A adição de um carboidrato e um indicador de pH ao meio de cultura permite evidenciar as colônias de microrganismos que produzam ácidos a partir da utilização daquele carboidrato, pois a cor do indicador vai se modificar em função da acidificação do meio ao redor da colônia.

Alguns meios de cultura podem ter um objetivo combinado: o de serem seletivo-diferenciais. Um bom exemplo seria o ágar MacConkey, um meio bastante utilizado para o isolamento de enterobactérias e outros bastonetes gram-negativos relacionados. Este meio contém como agentes seletivos sais biliares e cristal violeta, com o objetivo de inibir o crescimento das bactérias gram-positivas e algumas gram-negativas fastidiosas, e lactose e vermelho neutro, com o objetivo de diferenciar colônias de bactérias que utilizem esse carboidrato. Quando as bactérias chamadas de lactose-positivas utilizam a lactose, suas colônias apresentam tons variados de vermelho em função da mudança da cor do indicador de pH. Já as bactérias

lactose-negativas formam colônias incolores ou transparentes (Figura

5.1A). Um outro meio interessante, para a mesma finalidade, é o meio CLED (cisteína, lactato, eletrólito deficiente), que contém o indicador azul de bromo timol. Neste caso, as bactérias lactose-positivas conseguem virar o indicador, originalmente verde em pH neutro, para amarelo em

decorrência da produção de ácidos (Figura 5.1B).

Outro meio seletivo-diferencial é o ágar Salmonella-Shigella, ou ágar-SS, que, em virtude da presença de altas concentrações de sais biliares e citrato de sódio, é altamente seletivo para esses dois gêneros de bactérias enteropatogênicas e permite a diferenciação das suas colônias das de outras bactérias gram-negativas intestinais que eventualmente se desenvolvam. Isso porque esse meio contém lactose e um indicador de pH (vermelho neutro) que permite identificar presuntivamente as colônias de bactérias desses gêneros, pois eles tipicamente não utilizam esse carboidrato. Além disso, é possível a diferenciação das colônias desses dois gêneros, pois as salmonelas formam colônias que apresentam um centro negro, em função da reação do sulfeto de hidrogênio (H2S) produzido pelas bactérias a partir da utilização do tiossulfato de sódio como fonte de enxofre (S), com íons ferro, do citrato férrico, um outro componente desse meio de cultura.

Figura 5.1 A. No meio de MacConkey, as colônias de E. coli, lactose (+), se apresentam vermelhas, consequência da produção de ácidos e da mudança do indicador para vermelho, enquanto colônias da espécie lactose (–), como Proteus mirabilis, mantêm sua cor original. B. Já no meio CLED, os ácidos produzidos pelas colônias de E. coli, lactose (+), viram o indicador azul de bromo timol para amarelo, enquanto as de Proteus mirabilis, lactose (–), não são capazes de modificar a cor original verde do meio. (Foto: Rubem Clayton da Silva Dias.)

O ágar-sangue é um ágar nutriente acrescido de sangue desfibrinado de carneiro, com o objetivo de enriquecer sua composição e propiciar o desenvolvimento da maioria das bactérias patogênicas de importância médica. O sangue, além de conter nutrientes considerados fatores de crescimento para muitos microrganismos fastidiosos, confere uma característica diferencial ao meio, que é a de identificar bactérias produtoras de hemolisinas, ou seja, substâncias extracelulares capazes de lisar as hemácias do meio de cultura, provocando o aparecimento de um anel claro

ao redor da colônia (Figura 5.2).

 

Meios de enriquecimento

 

São meios preparados para favorecer a multiplicação dos microrganismos de interesse, quando estes estão presentes em pequeno número em relação à microbiota de acompanhamento que se encontra em maior número. Alguns desses meios são chamados de meios de enriquecimento seletivo, pois, além de propiciarem o desenvolvimento do microrganismo de interesse, inibem total ou parcialmente a microbiota de acompanhamento. Esses meios de cultura são amplamente utilizados em microbiologia médica e de alimentos, como o caldo tetrationato empregado no isolamento de importantes enteropatógenos a partir de amostras de fezes ou de alimentos. O caldo tetrationato possui bile, que estimula o crescimento das salmonelas, e vários agentes seletivos com diferentes funções, como o verde-brilhante, que inibe as bactérias gram-positivas, e o tetrationato, que inibe os coliformes e outras bactérias entéricas. Após a incubação da amostra nesse meio de enriquecimento seletivo, pequenas porções deste são repicadas em meios seletivos ou seletivo-indicadores, como o ágar-SS citado anteriormente, sendo observado que esse enriquecimento prévio aumenta consideravelmente a possibilidade de achado de colônias sugestivas de serem salmonelas.