2 Biologia do Câncer

Introdução

O termo neoplasia significa “novo crescimento”, definido pelo oncologista britânico Sir Rupert Willis como “uma massa de tecido anormal que cresce incoordenado e excedente em relação ao tecido normal e persiste em crescer da mesma maneira após cessar o estímulo que causou sua mudança”. Câncer é um termo comum utilizado para todas as neoplasias malignas, ou seja, para as neoplasias que apresentam potencial de invasão e metástase.

O câncer é uma doença multifatorial; seu desenvolvimento depende de fatores genéticos (mutações hereditárias ou esporádicas) e ambientais (agentes carcinogênicos). A carcinogênese inicia-se com danos no DNA de uma célula somática, potencializados por estes agentes carcinogênicos.

Inicialmente, esses danos levam à perda da homeostase e ao desequilíbrio dos processos de proliferação e morte celular, resultando em crescimento descontrolado. Esses processos são regulados por uma grande quantidade de genes, que, ao sofrerem mutações, podem ter seus produtos expressos de maneira alterada, o que inicia a formação do tumor e, em consequência, induz processos de progressão da neoplasia, como invasão dos tecidos adjacentes, angiogênese e desenvolvimento de metástases.

Dessa forma, de acordo com o modelo de Hanahan e Weinberg1, uma célula maligna precisa adquirir seis alterações biológicas para levar à patogênese, como autossuficiência em sinais de crescimento proliferativo, insensibilidade aos sinais inibidores de crescimento, evasão da apoptose, potencial de replicação ilimitado, capacidade de angiogênese e indução de invasão e metástase. Subjacentes a estas alterações estão a instabilidade genômica, que gera a diversidade genética tumoral e a inflamação, que promove outras alterações. O progresso conceitual na última década adicionou duas características a essa lista, que são o metabolismo energético e a evasão do sistema imune. Além das células neoplásicas, os tumores exibem outra dimensão de complexidade: eles contêm um repertório de células recrutadas, aparentemente normais, que contribuem para a aquisição de traços característicos, criando o “microambiente tumoral”.

Esse conjunto de alterações que levam ao fenótipo maligno ficou conhecido como The hallmarks of cancer e o seu reconhecimento contribuirá para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento do

câncer (Figura 2.1).

Figura 2.1 1 The hallmarks of cancer . Adaptada de Hanahan e Weinberg, 2011.

 

 

Ciclo celular

Como o câncer caracteriza-se por um descontrole da proliferação celular, é de fundamental importância o conhecimento dos aspectos moleculares que regulam o ciclo celular, o que contribui para o entendimento dos mecanismos envolvidos na carcinogênese e para o desenvolvimento de fármacos antineoplásicos que tenham como alvo essas alterações.

A organização básica do ciclo celular é essencialmente a mesma em todas as células eucarióticas. Todos os eucariotos parecem usar maquinarias similares para controlar os eventos do ciclo celular, dividido nas seguintes fases: G1, S, G2, M e G0. Embora essa divisão seja meramente didática, sabe-se que certas atividades são características de determinadas fases e fundamentais para a transição de uma fase para outra.

 

• G1: a célula produz proteínas essenciais à síntese de DNA, caracterizando-se por desenvolvimento citoplasmático. Essa fase é muito variável entre os tecidos, podendo durar horas ou anos • S: a célula duplica seu DNA para que as células-filhas tenham a mesma constituição genética da célula progenitora e possam desempenhar as mesmas funções

• G2: representa um tempo adicional para o crescimento celular. Nesse período, ocorre síntese de RNA e de proteínas essenciais para o processo de divisão celular

• M: corresponde à divisão celular, constituída por quatro fases – prófase, metáfase, anáfase e telófase, seguidas pela divisão celular (citocinese) • G0: estágio de quiescência celular.

 

A progressão de uma fase para outra é controlada por uma maquinaria bioquímica que não apenas coordena esse processo, mas também está ligada a sinais extracelulares de controle de crescimento e proliferação. Essa progressão coordenada durante o ciclo celular é de fundamental importância para a manutenção da estabilidade genômica.

A progressão ordenada do ciclo celular é dependente da atuação de várias proteínas pertencentes à família das ciclinas e à família das quinases dependentes de ciclinas (Cdk), as quais formam um grupo de serina/treonina quinases citoplasmáticas. As ciclinas são assim chamadas porque, diferentemente das Cdks, têm variações cíclicas de concentração no ciclo celular.

Essas proteínas funcionam apenas quando em complexo, ou seja, a porção catalítica, Cdk, só exercerá seu papel em associação ao seu par regulatório, a ciclina, além de requererem fosforilação e desfosforilação de diferentes resíduos. A interação com as ciclinas induz mudanças conformacionais nas Cdk, que resultam no deslocamento de um segmento de sua molécula, denominado alça T, e traz para o sítio ativo um resíduo essencial para a função enzimática. A ativação do complexo depende ainda da fosforilação da treonina 160/161 da alça T e da desfosforilação dos resíduos de treonina 14 e tirosina próximos ao terminal amino. A fosforilação da treonina 160/161 é catalisada pela enzima Cdk-activating kinase, formada pela Cdk7 e pela ciclina H. A desfosforilação dos resíduos de treonina 14 e tirosina 15, por sua vez, ocorre por meio das fosfatases da família CDC25 (A, B e C).

Esses complexos Cdks/ciclinas fosforilam substratos específicos, levando a sua ativação ou inativação em estágios específicos do ciclo celular. As ciclinas são divididas em quatro tipos: A, B, D e E. Entre as Cdk, têm-se Cdk1 (Cdc2), Cdk2, Cdk4 e Cdk6.

A ciclina D1 responde a mitógenos extracelulares e é um controlador da progressão da fase G1 no ciclo celular. O complexo Cdk4/6-ciclina D1 comanda a passagem pelo chamado ponto de restrição (R), o primeiro momento crítico após a progressão da célula para uma nova etapa do ciclo celular. A existência de R evita que a célula evolua no ciclo até que o restante da maquinaria celular esteja pronta.

O complexo Cdk4/6/ciclina D1 estimula a progressão do ciclo celular por fosforilar a proteína pRB. A fosforilação de pRB em G1 libera fatores de transcrição, como E2F, que induz a expressão gênica e mudanças metabólicas levando à replicação do DNA. O complexo Cdk4/6-ciclina D1 é essencial até a metade da fase G1. O complexo Cdk2-ciclina E, por sua vez, é responsável pela transição G1/S, pois leva à fosforilação de outros locais de pRB. A desfosforilação de pRB ao fim da fase M é realizada pela fosfatase 1 (PP1), a qual compete com as Cdk pelo mesmo sítio de ligação na proteína pRB. A progressão da fase S é coordenada pela Cdk2-ciclina A, enquanto a Cdk1/ciclina B é responsável pela transição G2/M. Tanto os complexos Cdk1/ciclina A como o Cdk1/ciclina B estão ativos na fase M

(Figura 2.2).

Além dos mecanismos de fosforilação e desfosforilação, a atividade das Cdks é controlada por proteínas inibitórias (CKI), que atuam sobre uma variedade de complexos CDK-ciclina. As duas classes de CKI são CIP/KIP e INK4. A família INK4 corresponde a p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c, p19INK4d, e age exclusivamente sobre os complexos Cdk4/6-ciclina D. A família CIP/KIP, à qual pertencem as proteínas p21, p27 e p57, não é específica de um único complexo.

A proteína p16 liga-se às CDK 4 e 6, inibindo sua associação com a ciclina D1. A inibição do complexo Cdk4/6-ciclina D1 previne a fosforilação da pRB, levando consequentemente à inibição da transição

G1/S do ciclo celular (Figura 2.3).

A proteína p21 atua como um dos principais efetores downstream da proteína p53. Em resposta a danos no DNA, a proteína p53 selvagem (não mutada) se acumula e se liga à região promotora do gene WAF1/CIP1 (p21) e induz a expressão da proteína p21, que inibe a atividade dos complexos Cdk, levando à parada do ciclo celular. A expressão da proteína p21 também pode ser induzida por mecanismos independentes de p53, como medicamentos genotóxicos e fatores de crescimento. Essa proteína também tem sido relacionada com os mecanismos de apoptose e senescência celular

(Figura 2.4).

A proteína p27 regula negativamente a progressão do ciclo celular, pois é um inibidor de complexos Cdk-ciclinas, sobretudo Cdk2-ciclina E e Cdk4-ciclina D. Essa proteína é ativada em resposta a sinais extracelulares, como inibição por contato, fator de crescimento transformante beta (TGF-β), monofosfato cíclico de adenosina (c-AMP). Os níveis da proteína p27 estão aumentados em células quiescentes e diminuem rapidamente após a célula ser estimulada por mitógenos, sendo seus níveis celulares regulados pós-transcricionalmente pelo sistema ubiquitina-proteosomo.

A indução de p15, p21 e p27 em resposta a fatores antiproliferativos, como vitamina A, vitamina D e TGF-β, envolve proteínas citoplasmáticas chamadas Smads. Essas proteínas, quando ativadas por TGF-β, interagem com o promotor do gene c-myc e reprimem a transcrição desse gene,

liberando indiretamente a transcrição de p15, p21 e p27 (Figura 2.5).

Como exemplo de quimioterápico que atua em reguladores do ciclo celular, há o flavopiridol, que age sobre a Cdk. Espera-se que todo esse conhecimento a respeito dos reguladores do ciclo celular possa resultar no desenvolvimento de agentes terapêuticos alvo-específicos com menos efeitos colaterais e mais efetividade.

 

Biologia molecular do câncer

Para que uma célula normal transforme-se em uma célula tumoral, é necessário que vários genes sejam mutados, conferindo vantagens proliferativas a essa célula, o que inclui genes relacionados com o desenvolvimento do câncer, como os protooncogenes, os genes supressores tumorais e os genes de reparo. Os proto-oncogenes, quando mutados, denominam-se oncogenes, e a mutação é em geral dominante, ou seja, a mutação em apenas um alelo confere a manifestação do fenótipo mutado. Ao contrário, mutações em genes supressores tumorais são geralmente recessivas, sendo necessária a inativação dos dois alelos para a manifestação do fenótipo mutado.

Figura 2.2 Fases do ciclo celular e a relação com a atividade das Cdk/ciclinas. Adaptada

 

de Brentani 2 et al ., 2003.

Figura 2.3 A fosforilação de pRB pelo complexo Cdk4/6-ciclina D1, na fase em G1, libera fatores de transcrição, como E2F, que induz a expressão gênica e mudanças metabólicas e

leva à replicação do DNA. Adaptada de Cooper e Hausman, 2004. 3

Figura 2.4 Após danos no DNA, a proteína p53 selvagem se acumula e se liga à região promotora do gene p21 e induz a expressão da proteína p21, que inibe a atividade dos

complexos Cdk, levando à parada do ciclo celular. Adaptada de Cooper e Hausman, 2004. 3

Figura 2.5 2 Vias de inibição do ciclo celular. Adaptada de Brentani et al ., 2003.

 

■ Oncogenes

A descoberta dos oncogenes foi resultante de estudos de vírus que causam tumor em galinhas, mais precisamente o retrovírus Rous sarcoma vírus (RSV). Em 1911, Peyton Rous descobriu que um sarcoma de galinha era transmissível por inoculação de suspensão ou filtrado do tecido tumoral, configurando a presença de um vírus. Em 1970, foi detectado no vírus de Rous um gene, v-src, responsável pela capacidade de gerar tumor. Em 1975, verificou-se que células normais de galinhas e de outras espécies contêm um gene muito semelhante ao v-src de RSV. Esse gene celular normal, um proto-oncogene, é distinguido do gene viral pelo prefixo “c” (celular, c-src). O RSV e outros vírus, que transportam oncogenes, parecem ter surgido pela incorporação ou transdução de um proto-oncogene normal em seu genoma. Novas mutações no gene traduzido o converteram em oncogene dominante, que pode induzir a transformação celular na presença do proto-oncogene c-src normal.

Dessa forma, os oncogenes são derivados de alterações em proto-oncogenes celulares, os quais codificam proteínas que medeiam sinais positivos para o crescimento celular e/ou a sobrevivência celular. Quando um proto-oncogene está alterado e anormalmente ativado, torna-se um oncogene, podendo promover a proliferação celular anormal e levar à tumorigênese.

Os proto-oncogenes podem transformar-se em oncogenes por meio de:

 

• Mutação na sequência codificadora do gene, levando à produção de proteína anormal. Isso pode resultar em sinais de proliferação contínuos e em falha na resposta a sinais negativos de proliferação. Mutações em K-ras têm sido identificadas em tumores de pulmão e de pâncreas caninos • Amplificação gênica com a produção aumentada da proteína normal. Como exemplo, há o proto-oncogene MDM2, amplificado em uma parcela de sarcomas de partes moles em cães

• Rearranjos cromossômicos em sequências proximais reguladoras de DNA, o que causa superprodução da proteína normal ou, ainda, rearranjos cromossômicos que levam à fusão de genes transcritos ativamente e à produção de uma proteína de fusão hiperativa. O exemplo clássico é a quebra cromossômica que produz o cromossomo Philadelphia, encontrado em humanos com leucemia mieloide crônica. Este rearranjo envolve a translocação do proto-oncogene ABL localizado no cromossomo 9 a um gene no cromossomo 22 (BRC). O gene híbrido BCR/ABL produz um novo transcrito cujo produto proteico tem elevada atividade tirosinoquinase, que contribui para proliferação celular descontrolada • Inserção viral. Em algumas circunstâncias, a função dos proto-oncogenes pode ser prejudicada pela inserção de elementos virais. Como exemplos, têm-se o RSV, citado anteriormente, e o FeLV (vírus da leucemia felina), um retrovírus oncogênico.

 

De acordo com seu modo de atuação, os oncogenes são classificados em quatro grupos:

 

Fatores de crescimento. São proteínas que estimulam a célula a se dividir. Na maioria das vezes, as mutações em genes para fatores de crescimento levam a um aumento da quantidade de proteína produzida. O fator de crescimento epidermal é um exemplo de proto-oncogene frequentemente mutado em neoplasias.

Receptores para fatores de crescimento. Estão presentes na superfície das células e são proteínas transmembranas com domínio externo, que se liga a um fator de crescimento, e domínio citoplasmático, responsável pela ativação de uma cascata de sinalização celular. O papel deles na carcinogênese pode se dar por alterações estruturais nessas proteínas ou, ainda, superprodução destas. Como exemplos, há o receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) e o receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR).

Transdutores de sinal. Localizam-se na porção interna da membrana citoplasmática e estão, portanto, envolvidos no processo de sinalização celular. Essas proteínas atuam em vias complexas como transdutoras ou amplificadoras do sinal desencadeado pela ligação do fator de crescimento ou ao receptor. Como exemplo, há um grupo de proto-oncogenes chamados RAS que codificam proteínas com atividade de GTPase e ligante de GTP que, nas células normais, auxiliam a modular a proliferação celular. Fatores de transcrição. Englobam as proteínas nucleares que têm em sua estrutura domínios proteicos capazes de interagir com regiões regulatórias de genes. Dessa forma, esse grupo de proteínas controla a expressão gênica. Na ausência de fatores de crescimento, esses genes encontram-se desligados e seus produtos são indetectáveis na célula; no entanto, na presença destes, os níveis dessas proteínas se acumulam rapidamente no núcleo e são capazes de ativar vários genes. Como exemplo, têm-se os fatores de transcrição das famílias myc, fos, jun, ets e rel.

 

■ Genes supressores de tumor Genes supressores tumorais regulam negativamente o crescimento celular e, quando mutados, perdem sua função, o que gera perda do controle do ciclo celular e resulta no crescimento celular descontrolado. Os genes supressores tumorais codificam proteínas que transmitem sinais negativos regulatórios do crescimento celular. Esses genes estão frequentemente envolvidos na regulação do ciclo celular, incluindo parada do ciclo celular e apoptose. Uma vez que esses genes estão inativados, as células escapam do controle do ciclo celular e levam à divisão celular descontrolada, contribuindo para o fenótipo maligno.

O primeiro gene supressor a ser identificado e caracterizado foi o gene de suscetibilidade ao retinoblastoma, RB1. O retinoblastoma é um tumor ocular, raro em crianças, que pode ser tanto esporádico como familial. Usando a análise de Poisson, Alfred Knudson estabeleceu que a distribuição dos casos de retinoblastoma unilateral e bilateral poderia ser causada por dois eventos mutacionais. Esta teoria tornou-se conhecida como a hipótese de “two hits” e sugere que a tumorigênese requer dois eventos mutacionais para inativar as duas cópias funcionais dos genes supressores tumorais. Em retinoblastoma familial, a primeira inativação supressora é herdada, enquanto o segundo evento mutacional ocorre espontaneamente no segundo alelo da mesma célula. Na forma esporádica, ambos os alelos são espontaneamente mutados. Para crianças que herdam um “hit” mutacional de seus pais, a chance de ocorrer outra mutação espontânea na mesma célula da retina e desenvolver retinoblastoma é muito maior do que ter duas mutações espontâneas no mesmo locus. Consequentemente, o retinoblastoma familial é geralmente bilateral, enquanto a forma esporádica é unilateral. Posteriormente, David Vindas postulou a teoria do papel dos supressores tumorais em todos os tipos de tumores malignos, sugerindo que as neoplasias herdadas podem resultar da perda ou inativação de ambos os alelos de genes supressores, que, quando ativados, impedem a transformação de proto-oncogenes em oncogenes.

O gene RB1 é conhecido como um regulador universal do ciclo celular com um papel central em regular a passagem da fase G1 do ciclo celular e particularmente o ponto de restrição (R), controle do qual é perdido na maioria das células de câncer. Como descrito anteriormente, a fosforilação da proteína pRB pelos complexos Cdk4/6-ciclina D e Cdk2-ciclina E leva à liberação do fator de transcrição E2F, causando a progressão do ciclo

celular (ver Figura 2.3). Além disso, essa proteína apresenta outras importantes funções na correta segregação cromossômica, na apoptose, na senescência e na diferenciação celular. Estudos moleculares demonstram que essas funções podem ser mediadas pelas modificações pós-transcricionais no domínio C-terminal de pRB com acetilação e metilação em resposta a sinais externos. Dessa forma, a proteína pRB suprime a formação de tumor em virtude de suas múltiplas atividades biológicas.

O gene p53 é o gene supressor tumoral mais frequentemente mutado em neoplasias humanas e está envolvido em muitas funções relacionadas com a manutenção da integridade celular após danos ao DNA e controle do ciclo celular, sendo considerado o “guardião do genoma”. Análise bioquímica da proteína p53 mostra que esta é capaz de formar tetrâmeros, permitindo que a proteína mutante interfira ativamente na proteína normal (selvagem), modelo chamado dominante negativo. A presença dos alelos mutados em geral resulta no acúmulo da proteína anormal nas células tumorais, dessa forma, se o gene p53 estiver mutado, o seu produto proteico está frequentemente presente em altas concentrações. Em células normais, a concentração da proteína p53 é baixa e sua meia-vida é curta, por volta de 20 min. No entanto, após danos no DNA, a degradação da p53 é bloqueada e a proteína é estabilizada para exercer suas funções. Em resposta ao dano, a proteína p53 pode funcionar como um fator de transcrição e induzir a expressão do gene p21 para bloquear o ciclo celular em G1, o que permitirá à célula ativar genes relacionados com o reparo de DNA. Além disso, p53 contribui diretamente para o reparo de DNA, por ativar genes que facilitam o reparo por excisão de nucleotídios e o reparo por excisão de bases. Se o dano no DNA for muito grave para reparar, a proteína p53 pode redirecionar a célula para a parada do ciclo celular, a senescência ou a apoptose, pela ativação de genes como PUMA. Dessa forma, o gene p53 tem um papel essencial na resposta a vários sinais de estresse celular.

Os genes p16, p21 e p27 descritos anteriormente são também exemplos de genes supressores tumorais, uma vez que inibem a progressão do ciclo celular e, consequentemente, a divisão celular anormal.

Diversos tipos de alterações genéticas foram descritos para genes supressores tumorais, incluindo mutações pontuais e cromossômicas (duplicações, translocações, amplificações e deleções). Diferentes genes supressores tumorais são inativados por mecanismos específicos. Por exemplo, o gene p53 é inativado preferencialmente por mutações pontuais, enquanto o gene p16 é inativado por deleção ou mutação.

 

■ Genes de reparo

Alterações em genes de reparo estão relacionadas com instabilidade genômica e predisposição ao câncer. Os organismos desenvolveram uma série de mecanismos capazes de remover lesões e, com isso, manter maior estabilidade do material genético. O estudo do reparo de DNA no homem sempre esteve muito associado a doenças humanas. Um dos primeiros avanços nesta área de pesquisa foi feito por James Cleaver em 1968, quando ele demonstrou que as células de pacientes com a síndrome do xeroderma pigmentoso (XP) são deficientes no reparo por excisão de nucleotídios. Nesses pacientes, após a exposição à luz ultravioleta (UV), são formados dímeros de pirimidinas, que causam lesões na pele e, consequentemente, câncer.

Há diferentes mecanismos de reparo de DNA que envolvem a atuação complexa de várias enzimas:

 

• Mismatch repair (reparo de erros de mau pareamento). Este sistema repara os maus pareamentos das bases do DNA gerados por erros de replicação

• Reparo por excisão de bases. Este processo é conduzido pelas enzimas DNA glicosilases, que reconhecem os produtos de citosina e adenina deaminadas, um tipo de lesão frequente no DNA, que gera uracila e hipotanina

• Reparo por excisão de nucleotídios. Este sistema repara vários tipos de lesão, incluindo dímeros de ciclobutil pirimidina e dímeros 6 a 4 de piridimidina induzidos pela radiação UV. As enzimas-chave formam um complexo chamado endonuclease de excisão ABC. Ao se ligar ao DNA no sítio da lesão causada pelo agente mutagênico, o complexo ABC cliva a fita duas vezes, antes e depois da lesão. A lesão é removida do DNA como parte de um resíduo de 12 a 13 oligonucleotídios • Reparo direto. Dímeros de ciclobutano pirimidina podem ser reparados diretamente sem a excisão por uma enzima chamada DNA fotoliase, que usa a energia derivada da luz absorvida por ela para regenerar as duas pirimidinas que foram dimerizadas pela luz UV • Reparo por recombinação homóloga. No processo de reparo por recombinação homóloga, a fita complementar não danificada é utilizada como molde na substituição do fragmento lesado.

 

Os genes BRCA1 e BRCA2 são genes de reparo por recombinação homóloga, cujas mutações estão associadas à instabilidade cromossômica e ao câncer de mama humano. Mutações nesses genes, principalmente no BRCA2, também têm sido observadas em câncer de mama em cadelas.

 

Epigenética e câncer

Alterações epigenéticas são todas aquelas que modificam a estrutura físico-espacial do DNA, sem alterar a sequência de nucleotídios. A metilação do DNA e as modificações das histonas são componentes-chave na regulação epigenética da expressão gênica em mamíferos. A metilação do DNA, uma modificação química covalente resultante da adição de um grupo metil no carbono 5 da citosina em dinocleotídeos CpG, geralmente resulta na repressão da expressão gênica, ou seja, em silenciamento de genes, e está envolvida em vários processos biológicos normais, como controle de desenvolvimento, proteção do genoma contra elementos transponíveis, imprinting genômico e inativação do cromossomo X. As sequências ricas em CpG (ilhas CpG) são geralmente localizadas no promotor gênico e no primeiro éxon, mas também estão presentes em regiões internas do gene. A metilação dessas sequências é introduzida enzimaticamente por DNA metiltransferases que exibem uma interação sequência-específica com o DNA e utilizam a S-adenosil L-metionina (AdoMet) como doadora de

grupos metil (Figura 2.6).

A metilação anormal do DNA é um evento epigenético frequente em tumores e representa uma fonte importante de marcadores moleculares. Dessa forma, a metilação anormal do DNA é fortemente implicada no desenvolvimento do câncer e afeta a expressão de mais de uma centena de genes supressores de tumor ou relacionados com a regulação da proliferação e da apoptose e com o reparo do DNA. Vários estudos têm revelado que tais alterações são eventos precoces no processo tumorigênico e contribuem diretamente para a transformação maligna. Nas células tumorais, a regulação normal da maquinaria de metilação do DNA está gravemente comprometida, de tal forma que a especificidade regional dos padrões de metilação é revertida, resultando em metilação de novo das ilhas CpG e hipometilação do DNA repetitivo.

Figura 2.6 A metilação do DNA leva à atividade gênica alterada. Para que a maioria dos genes seja ativamente transcrita, fatores de transcrição reconhecem e ligam-se a sequências específicas do DNA, na região promotora. Sua interação com o DNA e com os fatores de transcrição gerais no complexo de iniciação da RNA polimerase II (RNA Pol II) leva à expressão de um gene. Em células tumorais, o mesmo gene pode apresentar agrupamentos metil ligados em citosinas dos dinucleotídios CpG, inibindo a ligação dos

mesmos fatores e impedindo a expressão do gene. Adaptada de Alberts 4 et al ., 1994.

 

Dessa forma, em comparação com as células normais, as células neoplásicas exibem hipometilação global do DNA, que pode levar à instabilidade genômica e à hipermetilação em promotores específicos de genes supressores tumorais, resultando em silenciamento desses genes. Em diferentes tipos de câncer, já foram identificados muitos genes mostrando essas alterações epigenéticas, como RASSF1, RAR2, DAPK, p16, p15, p53, p14, MGMT, GSTP1, CDKN2A, APC, BRCA1, MGMT, TIMP3, GSTP.

As alterações epigenéticas podem ser empregadas como marcadores no monitoramento da gênese e da progressão do câncer e constituem alvos terapêuticos potenciais em virtude de sua reversibilidade. Tratamentos com inibidores da metilação do DNA podem restaurar a atividade de genes silenciados e diminuir a taxa de crescimento de células tumorais em um modo herdável. A reversão parcial do fenótipo tumoral pelo uso de inibidores da metilação é, portanto, possível. Alguns experimentos já realizados com camundongos da espécie Min também têm sugerido que esse tratamento suprime o desenvolvimento tumoral e pode ser aplicado como uma estratégia de prevenção.

 

Alterações genéticas e marcadores tumorais O câncer é uma doença heterogênea, e as múltiplas alterações genéticas e epigenéticas que o caracterizam dificultam sua prevenção, seu diagnóstico e a terapia. Dessa forma, o estudo do perfil genético molecular dos tumores é necessário para o entendimento da complexidade da doença, o esclarecimento das bases biológicas e a identificação das melhores estratégias terapêuticas, pois, apesar dos avanços na quimioterapia, nas técnicas cirúrgicas e nas combinações de medicamentos, há tipos de neoplasia que não apresentaram melhora de prognóstico nos últimos anos. Muitos eventos relacionados com o aparecimento de tumores ainda permanecem desconhecidos e, de maneira geral, poucos marcadores moleculares associados a um grupo de neoplasias estão sendo utilizados na prática clínica habitual. Contudo, com o progresso no conhecimento da genética molecular e o desenvolvimento de tecnologias mais aprimoradas, surge a oportunidade de identificar novos marcadores de diagnóstico e prognóstico e novos alvos terapêuticos no câncer.

Atualmente, em Medicina Veterinária têm-se apenas exem-plos de marcadores bioquímicos tumorais, como a lactato desidrogenase (LDH), a alfa fetoproteína (AFP) e o antígeno carcinoembrionário (CEA). A LDH é uma enzima produzida pelas células de vários tecidos em condições normais, mas sabe-se que seus níveis podem aumentar significativamente em condições neoplásicas. Apesar de o LDH ser um marcador inespecífico, sua determinação no sangue pode auxiliar no diagnóstico e, principalmente, na resposta ao tratamento. A AFP é produzida por hepatócitos fetais, mas não o é por hepatócitos adultos normais; no entanto, observa-se seu aumento em cães com carcinoma hepatocelular e com colangiocarcinomas.

A falta de marcadores moleculares na prática veterinária oncológica reforça a necessidade do conhecimento da biologia molecular em neoplasias de animais, o que contribuirá para diagnóstico e prognóstico mais precisos, assim como para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais adequadas e com menos efeitos colaterais.

 

Morte celular

A reação da célula a qualquer tipo de mudança em suas condições internas ou externas envolve respostas complexas que eventualmente levam à adaptação celular e à sobrevivência, ou à iniciação e à execução da morte celular. A eliminação de células é essencial para o processo de embriogênese, no período pós-embrionário e na renovação tecidual, bem como para o desenvolvimento e funcionamento do sistema imune, agindo na regulação dessa resposta. Antigamente, acreditava-se que a morte celular era um processo acidental, de caráter degenerativo, que ocorria em situações de estresse celular. Como consequência, a célula alteraria a integridade da membrana plasmática, aumentando seu volume e perdendo suas funções metabólicas. Entretanto, nem todos os eventos de morte celular são acidentais. Sabe-se que organismos multicelulares são capazes de induzir a morte celular programada em resposta a estímulos intra ou extracelulares. Em 1964, foi proposto o termo “morte celular programada” para designar o processo que ocorre de uma forma não acidental. Existem diferentes mecanismos de morte celular, como senescência, mitose catastrófica, autofagia, necrose e apoptose, sendo os dois últimos os principais.

 

■ Senescência Processo metabólico ativo essencial para o envelhecimento. Durante o processo de senescência, a divisão celular é bloqueada de forma irreversível, mas as células permanecem metabolicamente ativas. A senescência pode ser iniciada pelo encurtamento dos telômeros ou por algum tipo de estresse. As células em senescência apresentam-se achatadas e esticadas e ocorre aumento da granulosidade do citoplasma.

 

■ Mitose catastrófica

Considerada uma sinalização irreversível para a morte. Trata-se de um processo passivo, porém considerado por muitos estudos um mecanismo regulado geneticamente. Esse processo resulta da tentativa de divisão de células com DNA danificado. Dessa forma, caracteriza-se como uma mitose aberrante, o que resulta em uma segregação cromossômica errônea, determinando assim uma sinalização irreversível para a morte. Durante esse processo, observa-se a presença de células gigantes, multinucleadas e com cromossomos descondensados.

 

■ Autofagia

A autofagia (auto = próprio; fagia = comer/alimentar-se), também denominada morte celular tipo II, é um processo celular catabólico cujo objetivo é eliminar componentes citoplasmáticos em condições de estresse, como o jejum e a hipoxia. A autofagia modula a morte celular pela autodigestão excessiva e pela degradação de constituintes celulares essenciais. Este processo pode ser desencadeado por estresse metabólico ou terapêutico, como o bloqueio de vias de sinalização de fatores de crescimento, a ativação de vias de sinalização de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK), o acúmulo de cálcio intracelular e de espécies reativas de oxigênio. Durante o processo de autofagia, observa-se a presença de vesículas autofágicas formadas pela fusão de lisossomos e estruturas celulares.

■ Necrose

Também chamada oncose, é considerada um tipo de morte celular não programada. Em geral, células necróticas apresentam vacuolização citoplasmática, ruptura da membrana plasmática, dilatação das organelas (mitocôndria, retículo endoplasmático e complexo de Golgi) e condensação da cromatina. Quando as células incham e estouram, provocam uma

resposta inflamatória, na tentativa de fagocitar a célula morta (Figura 2.7).

A necrose é geralmente considerada uma morte celular acidental que, ao contrário da apoptose, não é dependente de energia. Bioquimicamente, durante a necrose ocorrem o esgotamento de energia (adenosina trifosfato – ATP), a formação de espécies reativas de oxigênio e a ativação de proteases não apoptóticas. Considerando que a ATP é necessária para certos passos de ativação das caspases, o esgotamento de ATP leva à morte celular por necrose. Além disso, um aumento substancial do cálcio intracelular é observado durante a necrose. Níveis elevados de cálcio no citoplasma podem provocar uma sobrecarga mitocondrial, o que leva à despolarização da membrana mitocondrial interna e a uma parada de produção de ATP. Necrose, no entanto, pode também ser observada em resposta à ativação dos receptores de morte ou à quimioterapia.

 

■ Apoptose

Também denominada morte celular tipo I, é um processo fisiológico, conhecido como morte celular programada. Os primeiros indícios da existência da apoptose foram descobertos em 1972 por Kerr, Wyllie e Currie, o que revolucionou a compreensão da proliferação celular, da homeostase do tecido e da fisiopatologia de muitas doenças. Nos anos seguintes, uma série de proteínas envolvidas nas vias de sinalização da morte celular foi identificada, e, 30 anos mais tarde, o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina foi atribuído a S. Brenner, H. R. Horvitz e J. E. Sulston por suas descobertas relacionadas com a descrição dos mecanismos de morte celular (apoptose).

 

Figura 2.7 Etapas das modificações morfológicas de necrose e apoptose. Adaptada de

Grivicich 5 et al ., 2007.

 

O termo “apoptose” vem do grego; o prefixo “apo” significa separação e o sufixo “ptose” pode ser traduzido como queda, sendo associado à queda das folhas de uma árvore ou pétalas das flores. Esse termo é uma alusão à liberação de pequenos corpos revestidos por membrana, resultantes da

fragmentação da célula apoptótica, denominados corpos apoptóticos (Figura

2.8).

A apoptose ocorre ao longo da vida em praticamente todos os tecidos e é essencial para o desenvolvimento do tecido normal, da homeostase e para os processos patogênicos. O equilíbrio entre a morte celular e a sobrevivência é uma das principais características da homeostase celular e requer a ação coordenada de proteases e nucleases dentro da membrana plasmática intacta. Considera-se que a apoptose tenha um papel oposto ao da mitose no controle da proliferação celular. Atua como uma resposta fisiológica, permitindo a remoção de células ou tecidos alterados, exercendo importante papel na manutenção da estrutura do órgão ou dos tecidos e impedindo que suas funções sejam alteradas por fatores externos.

 

Vias de sinalização

A ativação da apoptose pode ser iniciada por meio de duas vias que dependem do local inicial de ativação do processo de morte celular: via extrínseca (citoplasmática) e intrínseca (mitocondrial).

 

Via extrínseca

A via extrínseca é iniciada pela ativação dos receptores de morte da superfície celular, capazes de ativar a cascata das caspases. Os receptores de morte são membros da superfamília dos receptores de fatores de necrose tumoral (rTNF). Todos os membros dessa superfamília têm domínios ricos em cisteína (CRD), e apenas os receptores funcionais apresentam domínios de morte (DD). Os membros desta superfamília incluem o Fas/APO1 (receptor ou proteína de membrana pró-apoptose), o TNFR1/TRAIL-R1 (ligante indutor de apoptose associado ao TNF), -2(TRAIL-R2), receptores FasL/APO1/CD95 (proteína de membrana que se liga ao Fas), TRAIL/APO2L e receptores de morte 3, 4 e 5 (DR3, DR4 e DR5).

Figura 2.8 Esquema das vias extrínseca e intrínseca de sinalização da apoptose. Na via extrínseca, a ligação da FADD à caspase-8 e 10 induz a formação do complexo de sinalização indutor de morte (DISC), que ativa a caspase-3, 6 e/ou 7, originando a apoptose. A caspase-8 pode ser bloqueada pelo recrutamento de c-FLIP (proteína inibidora de FLICE). O mecanismo mitocondrial (via intrínseca) ocorre por meio da ativação de membros pró-apoptóticos da família Bcl-2. Proteínas pró-apoptóticas e antiapoptóticas competem para regular a saída de citocromo C. Se as pró-apoptóticas vencem, ocorre a liberação de uma série de moléculas do compartimento mitocondrial, principalmente citocromo C, que se associam ao Apaf-1 e à pró-caspase-9 para formar o apoptossomo. O mecanismo de receptor de morte e o mecanismo mitocondrial convergem para a ativação da caspase-3. A ativação da caspase-3 é antagonizada pelas IAP, que são antagonizadas pela proteína Smac/DIABLO liberada pela mitocôndria. A ativação da caspase-3 leva à apoptose da célula. A sinalização e a integração entre o receptor de morte e a via mitocondrial são feitas pelo BID, um membro da família de moléculas pró-apoptóticas Bcl-2. A caspase-8 faz a mediação da clivagem da BID, aumentando a atividade de morte celular, resultando na sua translocação para a mitocôndria, onde promoverá a liberação do

citocromo C. Adaptada de Khan 6 et al ., 2014.

Os domínios ricos em cisteína permitem que os receptores reconheçam seus ligantes, resultando na ativação dos receptores de morte específicos. Quando os receptores de morte celular reconhecem um ligante específico, os seus domínios de morte interagem com moléculas conhecidas como FADD (domínio de morte associado ao Fas). Essas moléculas têm a capacidade de recrutar a caspase-8 e a caspase-10 no citoplasma para formar um complexo de indução de sinalização (DISC), o qual ativará a caspase-3, a caspase-6 e/ou a caspase-7, executando a morte por apoptose

(Figura 2.8).

 

Via intrínseca

A via intrínseca pode ser estimulada por meio de diferentes sinais de morte, como agentes quimioterápicos, irradiação, danos no DNA, hipoxia ou ativação de oncogenes e ausência de fatores de crescimento, os quais geram estresse intracelular ou extracelular, ativando proteínas que induzirão apoptose diretamente pela via mitocondrial. Esta via é regulada por um equilíbrio entre moléculas pró-apoptóticas e antiapoptóticas da superfamília de proteínas Bcl-2. Os membros da família Bcl-2 incluem as proteínas pró-apoptóticas (BAX, BAK, Bcl-xS, BAD, BID, BIK, HRK, BIM e BOK), e antiapoptóticas (Bcl-xL, Bcl-w, BFL-1,BRSAG-1, MCL-1, A1, E1B19K, LMW5-HL e EBV BHRF1). A função principal destas proteínas é manter a inergridade da membrana mitocondrial externa.

A via intrínseca, quando ativada por estresse celular, leva ao aumento da expressão das proteínas pró-apoptóticas com domínio “BH-3 only”, como BAD (antagonista de morte celular do Bcl-2), BID (agonista de morte que interage com o domínio BH3), BIM (mediador da morte celular que interage com Bcl-2), BMF (fator modificador de Bcl-2), PUMA

(modulador de apoptose hiper-regulado por p53) e Noxa (Figura 2.8). Estas proteínas, por sua vez, ligam-se aos membros antiapoptóticos da família Bcl-2 e inibem suas ações. Um subgrupo de proteína somente com domínios BH-3 inclui ativadores diretos (BID e BIM), que são capazes de se ligar e inibir proteínas antiapoptóticas, mas também podem ativar as proteínas efetoras, Bak e BAX. Outro grupo chamado sensibilizador inclui BAD, Noxa e PUMA. Estas proteínas ligam-se ao sulco hidrofóbico de proteínas antiapoptóticas Bcl-2, evitando, assim, qualquer futura interação entre as proteínas antiapoptóticas e pró-apoptóticas. Uma vez que a via é ativada, Bak e BAX formam poros na membrana mitocondrial externa, levando a sua permeabilização. Isso resulta na liberação de proteínas pró-apoptóticas, como citocromo c e Smac/DIABLO (segundo ativador mitocondrial de caspase/inibidores diretos da apoptose) para o citoplasma. O citocromo C forma um complexo com o Apaf-1 (fator de ativação de apoptose 1) e pró-caspase-9,enquanto o Smac/DIABLO liga-se a proteínas inibidoras de apoptose (IAPs). Essas ligações levam à ativação da caspase-9

e à subsequente ativação da caspase-3 e do fenótipo pró-apoptótico (Figura

2.2).

 

Caspases

As caspases pertencem à família das cisteínas proteases (contêm uma cisteína no sítio ativo), que têm a capacidade de reconhecer e clivar substratos que tenham resíduos de aspartato. Essas enzimas são específicas para substratos contendo ácido aspártico, clivando a ligação peptídica seguinte a esse resíduo, e a sua atividade proteolítica deve-se a uma cisteína polarizada na cadeia lateral. As caspases são sintetizadas na forma de precursores inativos denominados zimogênios e, quando clivadas, tornam-se enzimas ativas. Foram identificadas 14 isoformas de caspase; dessas, a maioria está envolvida com o processo de morte, e o restante está relacionado com processo inflamatório.As caspases que estão envolvidas com apoptose podem ser divididas em dois grupos: as indutoras (caspases-8 e 9), que dão início à cascata proteolítica, e as efetoras (caspases-3, 6 e 7), que clivam substratos específicos, responsáveis pelas características próprias desse tipo de morte (fragmentação do DNA, condensação da cromatina, perda de volume e desestruturação do citoesqueleto).

 

Controle genético

A apoptose é um evento cuja iniciação e as inúmeras alterações celulares, bem como sua inibição, são dependentes da atividade de genes determinados. As pesquisas sobre o envolvimento de genes no controle da apoptose iniciaram-se com o nematódio Caenorhabditis elegans. O controle da morte fisiológica nesses organismos é realizado pelos genes da família CED (cell death abnormal/morte celular anormal): CED-3, CED-4 e CED-9, além de outros genes. Quando o gene supressor da apoptose CED-9 (homólogo ao gene humano Bcl-2) está associado ao gene CED-4 (homólogo à proteína Apaf-1), inibe a ativação de CED-3 (pró-apoptótica). Quando a apoptose é iniciada, o indutor apoptótico EGL-1 (homólogo à proteína humana Bax) se associa ao CED-9, liberando o CED-4 e levando à ativação do CED-3. A indução da apoptose ocorre quando a proteína Bax se associa ao Bcl-2, induzindo a liberação da Apaf-1 e ativando a caspase-9.

Os genes envolvidos no processo apoptótico podem agir inibindo ou estimulando a apoptose, de acordo com a situação em que a célula ou o tecido se encontram, e podem ser denominados antiapoptóticos e pró-apoptóticos, respectivamente. Entre os genes que apresentam ação

antiapoptótica, está o grupo Bcl-2(Figura 2.9), enquanto os pró-apoptóticos

incluem o c-myc, o grupo Bax, o grupo BH3-only, o p53 e o Fas (Figura

2.9); esses genes exercem importante função nas células normais e neoplásicas.

 

Apoptose e câncer

A apoptose é um eficiente mecanismo na prevenção de uma transformação maligna das células, pois atua removendo as células com danos genéticos. No entanto, mutações nas vias apoptóticas podem levar à formação de um tumor.

Vários oncogenes e antioncogenes regulam a apoptose. Por exemplo, o aumento na expressão do Bcl-2 impede as células de iniciarem apoptose em resposta a vários estímulos e, inclusive, confere resistência à morte celular em resposta a agentes quimioterápicos. Vários tipos de câncer apresentam alta expressão do Bcl-2 ou produtos gênicos relacionados para impedir a morte celular.

 

Figura 2.9 Genes anti e pró-apoptóticos.

 

O supressor tumoral p53, responsável por regular a expressão do Bcl-2, encontra-se alterado no câncer. O p53 se liga ao DNA e regula a transcrição, ativando ou reprimindo a expressão de vários genes envolvidos na replicação e no reparo do DNA, conforme descrito anteriormente. Além disso, o produto do p53 é necessário para que a célula inicie a apoptose em resposta a danos genotóxicos, contribuindo para a supressão do crescimento tumoral. O p53 encontra-se inativo em uma grande quantidade de tumores, nos quais é observada uma incapacidade das células de sofrer apoptose em resposta ao dano ao DNA, relacionado a uma maior resistência aos agentes quimioterápicos e à radiação. O p53 também ativa a expressão do Bax, cuja proteína funciona como um promotor da morte celular. Portanto, em virtude do fato de as proteínas inibidoras de apoptose estarem superexpressas em vários tipos de câncer, essas proteínas são importante alvo terapêutico.

 

Angiogênese

A angiogênese é definida como a formação de novos vasos sanguíneos a partir de um endotélio vascular preexistente. Em circunstâncias fisiológicas controladas, a angiogênese é um processo normal e essencial. Atua na embriogênese, no crescimento,no aparelho reprodutor feminino a cada ciclo menstrual, na gravidez, no processo de cicatrização e na sequência de processos inflamatórios.

Em contraste com o processo ordenado, regulado e autolimitado da vascularização normal, a angiogênese patológica é um processo no qual a multiplicação vascular ocorre de modo descontrolado e contínuo. A angiogênese patológica acontece em uma variedade de transtornos, como na retinopatia proliferativa, na regeneração macular relacionada com a idade, na artrite reumatoide, na psoríase, no diabetes melito, no crescimento tumoral e na disseminação metastática.

 

■ Fatores pró e antiangiogênicos O processo angiogênico é regulado por inúmeros fatores pró e antiangiogênicos. Entre esses, o fator de crescimento fibroblástico (bFGF), que apresenta importante atividade mitogênica e quimiotáxica para células endoteliais, os fatores de crescimento ligados à heparina, o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), o fator de necrose tumoral (TNFα e TNFβ), moléculas de adesão como as integrinas e as caderinas, o fator de transformação de crescimento (TGFα), as interleucinas 1, 6 e 8 (IL-1, IL-6 e IL-8), o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), as metaloproteinases (MMPs), o fator de transcrição induzido por hipoxia (HIF), o ciclo-oxigenase 2 (COX 2) e as angiopoetinas 1 e 2 (ang-1 e ang-2). Esses fatores são liberados pelas células tumorais, pelas células endoteliais ou pela matriz extracelular e promovem a formação de novos vasos sanguíneos.

O estímulo angiogênico é acompanhado da supressão dos inibidores locais da angiogênese, denominados fatores antiangiogênicos, que protegem o endotélio vascular do estímulo proliferativo. Alguns fatores já descritos incluem: fator plaquetário 4 (PF4), fator de transformação de crescimento (TGF-β), inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMP-1, TIMP-2 e TIMP-3), interferona-alfa (α-IFN), prolactina (fragmento 16 kDa), angiostatina (fragmento 38 kDa do plasminogênio), trombospondina-1 (TSP-1), interleucina 10 (IL10) e endostatina. Entre as inúmeras moléculas indutoras da angiogênese, destaca-se o VEGF.

 

■ Angiogênese e câncer

Na década de 1970, o pesquisador Judah Folkman7 foi um dos pioneiros a sugerir que os tumores poderiam recrutar o seu próprio aporte sanguíneo por meio da produção e da liberação de moléculas estimuladoras da angiogênese. Propôs ainda a importante participação do desenvolvimento da microcirculação no processo de crescimento tumoral. As ideias de Folkman se baseavam em estudos de investigadores, como Algire e

Chalkley8, Greenblatt e Shubik9, e Warren10, que atribuíam à angiogênese o pré-requisito para o crescimento neoplásico.

Durante o processo de estabelecimento e progressão do câncer, a angiogênese permite que o tumor tenha sua própria rede vascular, facilitando o crescimento tumoral e contribuindo para o processo metastático, em virtude do desprendimento de células neoplásicas no interior dos vasos sanguíneos recentemente formados.

Assim, a formação de novos vasos sanguíneos no tecido tumoral visa ao fornecimento de nutrientes e oxigênio, permitindo a proliferação das células e o consequente crescimento e a progressão do tumor. Além disso, permite a retirada do gás carbônico (CO2) e dos resíduos metabólicos e representa uma importante via de disseminação metastática.

Durante seu crescimento, o tumor pode alcançar aproximadamente 1 a 2 mm3 antes que suas demandas metabólicas sejam restritas ao limite de difusão de oxigênio e nutrientes no local. A baixa oxigenação é caracterizada como hipoxia e pode ocorrer por causa da proliferação descontrolada das células e do rápido crescimento do tumor, além de ser consequência da perfusão inadequada em parte do tecido resultante da estrutura caótica dos novos vasos sanguíneos formados.

De acordo com a intensidade, a hipoxia pode resultar em apoptose ou induzir respostas adaptativas de sobrevivência celular. Assim, ao contrário do que ocorre com as células normais, para manter a sobrevivência em situações de hipoxia, as células tumorais são capazes de promover mecanismos adaptativos, como a indução de fatores envolvidos no processo de angiogênese.

 

■ Fator de transcrição induzido por hipoxia (HIF-1) O fator de transcrição induzido por hipoxia (HIF-1) é essencial na manutenção da homeostase do oxigênio e responsável por essas respostas adaptativas. O HIF-1 é um fator heterodímero composto de duas subunidades: HIF-1α e HIF-1β. Em normóxia, o HIF-1β é constitutivamente expresso e o HIF-1α sofre degradação dependente de oxigênio. O HIF-1α é hidroxilado e, então, reconhecido pela proteína supressora de tumor Von-Hippel-Lindau (pVHL) e ubiquitinilado para sofrer degradação proteossomal. Em condições de hipoxia, essa degradação não acontece, e então o HIF-1α migra para o núcleo, associando-se a HIF-

1β, atuando como fator de transcrição de diversos genes (Figura 2.10).

O HIF-1α pode regular mais de 100 genes envolvidos nos processos da eritropoese, metabolismo do ferro e da glicose, proliferação celular, apoptose e angiogênese. Em condições de hipoxia, o principal alvo do HIF-1α é o fator pró-angiogê-nico VEGF.

 

■ Fator de crescimento endotelial vascular O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um potente mitógeno que atua em diferentes etapas do processo angiogênico, promovendo o aumento da permeabilidade vascular, estimulação da migração, proliferação e invasão de células endoteliais. Esse fator foi primeiro descrito em células endoteliais e, portanto, denominado “fator de crescimento endotelial vascular”; no entanto, o VEGF pode exercer ação mitogênica em outros tipos celulares. O VEGF é composto de uma família de cinco isoformas denominadas VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e fator de crescimento placentário (PGF), os quais se ligam a receptores específicos do tipo tirosinoquinase, promovendo uma cascata de eventos intracelulares.

Cada isoforma pode ativar um ou mais receptores conhecidos, como VEGFR1, localizado na superfície de células hematopoéticas, macrófagos e monócitos, VEGFR2, encontrado no endotélio vascular e linfático, e o VEGFR3, localizado predominantemente no endotélio linfático. Receptores de VEGF também são encontrados em células tumorais e podem estimular o crescimento celular de maneira autócrina.

Figura 2.10 Ativação do HIF-1α em situações de hipoxia e degradação em normóxia.

Adaptada de Hoeben 11 et al ., 2004.

 

O VEGF-A se liga a dois receptores específicos, o VEGFR1 e o VEGFR2, enquanto o VEGF-B e PGF são reconhecidos apenas pelo receptor VEGFR1. O VEGF-C e VEGF-D se ligam ao VEGFR2 e também

são reconhecidos pelo VEGFR3 (Figura 2.11). A ligação entre o VEGF-A e VEGFR2 é considerada o mais importante passo do processo de angiogênese, enquanto a ligação de VEGF-C com VEGFR3 está envolvida no processo de linfangiogênese.

Inicialmente, para o processo de angiogênese, ocorre a ativação de células endoteliais quiescentes por fatores liberados pelas células tumorais em resposta a condições adversas, como privação de nutrientes e oxigênio. Alguns fatores, como VEGF e angiopoitina-2, atuam na desestabilização inicial dos vasos preexistentes e no aumento da permeabilidade vascular. Em seguida, ocorre a degradação da membrana basal e da matriz extracelular, permitindo a migração de células endoteliais pelo espaço intersticial e a eventual liberação de fatores pró-angiogênicos ligados à matriz. Subsequentemente, ocorrem a migração e a proliferação de células endoteliais, bem como a formação do tubo, recrutamento e diferenciação de células de suporte perivascular (pericitos). Nessa etapa, inúmeros fatores estão envolvidos, como VEGF, angiogenina, PDGF, bFGF, EGF, entre outros. Ao final, ocorrem a maturação e a estabilização dos novos vasos formados, com a participação de fatores como a angiopoitina-1 e seu

receptor Tie-2 (Figura 2.12).

Essas etapas podem ser inibidas por fatores antiangiogênicos como a endostatina ou pelo fragmento derivado do plasminogênio, denominado angiostatina, os quais podem induzir a apoptose em células endoteliais ou inibir a ativação de alguns fatores pró-angiogênicos.

 

■ Terapias antiangiogênicas ou terapia metronômica Graças à variedade de sinais envolvidos no processo angiogênico, diversos fatores podem ser considerados alvos terapêuticos, auxiliando no bloqueio da progressão do câncer. Vários estudos se concentram na inibição da atividade de VEGF, uma vez que anticorpos anti-VEGF pareceram inibir o crescimento tumoral. A inibição do VEGF via bloqueio de seus receptores representa um importante enfoque para a terapia contra o câncer, podendo ser utilizada para causar regressão de vasos sanguíneos imaturos, característicos dos tumores, e reduzir a permeabilidade vascular, de modo a diminuir a pressão intratumoral, diminuindo, com isso, a probabilidade de metastatização. Além disso, existem estudos com fármacos inibidores multiquinase, ou seja, que inibem uma variedade de diferentes receptores tipo tirosinoquinase. Dessa forma, a terapia antiangiogênica pode fornecer um caminho promissor para o tratamento do câncer.

Figura 2.11 Esquema da ligação entre as isoformas de VEGF e seus receptores. Adaptada

 

de Hoeben 11 et al ., 2004.

 

Figura 2.12 Representação das etapas do processo de angiogênese com a participação de

inúmeros fatores pró-angiogênicos. Adaptada de Gacche e Meshram, 2003. 12

 

Metástase

Durante a progressão tumoral, algumas células adquirem habilidade para invadir tecidos adjacentes, desenvolvendo metástases a distância. Para que esse processo ocorra, são necessárias várias etapas, que incluem perda da capacidade de aderência da célula, secreção de enzimas que degradam a matriz extracelular, invasão de tecidos adjacentes, sobrevivência nos vasos sanguíneos e linfáticos e proliferação em locais distantes de sua origem, estabelecendo tumores secundários.

As células do tecido normal têm forte adesão à membrana basal e às células vizinhas. No entanto, as células tumorais apresentam adesão diminuída, permitindo que se tornem móveis, podendo migrar por meio do estroma e invadir os vasos sanguíneos e linfáticos. Quando entram na circulação, nem todas as células tumorais conseguem alcançar um novo tecido para formar metástases. A maioria é destruída por diferentes processos na circulação, como ruptura durante seu percurso, ataque pelas moléculas de defesa imune e fagocitose por macrófagos. Assim, para garantir sua sobrevivência na circulação, as células tumorais interagem umas com as outras ou com elementos do sangue, formando êmbolos tumorais intravasculares.

As células que sobrevivem saem da circulação por meio do parênquima externo, invadindo um novo tecido, onde se proliferam para formar um novo tumor, distante do original. O crescimento desse novo tumor estimula a angiogênese e os consequentescrescimento e formação de novas metástases. Normalmente, as metástases não ocorrem em órgãos que não apresentam condições apropriadas para o crescimento tumoral, assim, frequentemente, acometem órgãos altamente vascularizados.

Em resumo, para que ocorra a metástase a partir de um tumor primário, a célula neoplásica deve inicialmente se destacar desse tumor, invadir e migrar os tecidos adjacentes, se infiltrar e sobreviver na corrente sanguínea, aderir e atravessar os capilares sanguíneos e sobreviver em um tecido estranho ao de sua origem. Para que as células neoplásicas com caráter metastático possam invadir órgãos distantes, elas necessitam de vias de disseminação.

As vias de disseminação das metástases são principalmente a rede linfática, uma vez que estão presentes em tecido conjuntivo e apresentam estrutura sensível, sendo considerada a via mais comum para disseminação inicial dos carcinomas. A via hematogênica também representa uma importante via de disseminação metastática, em vitude da permeação de células em capilares e vênulas. Os sarcomas, em geral, têm preferência por essa via. Outras vias menos frequentes incluem a linfo-hematogênica, a canalicular (de ductos envolvidos por epitélio) e a transcelômica (passagem de células neoplásicas por meio das cavidades serosas que atingem um local distante do primário).

 

■ Transição epitélio-mesenquimal Ao mesmo tempo que as células tumorais se soltam do tumor primário por diminuição da interação célula-célula, elas devem ter a capacidade de migrar e invadir o estroma adjacente. Assim, células tumorais passam por um processo denominado transição epitélio-mesenquimal (EMT, do inglês epithelial-mesenchymal transition), caracterizado pela mudança no fenótipo epitelial para mesenquimal, que leva à perda ou à expressão reduzida dos marcadores de células epiteliais e ao aumento da expressão de marcadores mesenquimais.

A transição epitélio-mesenquimal é geralmente induzida em células epiteliais por sinais intracelulares, especificamente enviados pelas células mesenquimais, que constituem o estroma normal e neoplásico dos tecidos. Um evento crítico molecular subjacente à dissolução dos contatos célula-célula durante a EMT é a diminuição da expressão da E-caderina, um componente-chave nas junções de adesão. A perda funcional da E-caderina pode ocorrer por meio de vários mecanismos, mas é frequentemente envolvida com deleção ou mutação do gene CDH1. Além disso, mudanças na expressão de proteínas que fazem parte do complexo de adesão da E-caderina, como as claudinas e ocludinas, podem prejudicar sua função. Estudos recentes associam a baixa expressão de E-caderina em tumores mamários caninos com o caráter invasivo do tumor e metástases em linfonodos. A EMT também envolve a expressão de marcadores mesenquimais, como a N-caderina, a fibronectina e a vimentina. Essas alterações tornam as células capazes de migrar e invadir o compartimento

estromal subjacente, rompendo a membrana basal (Figura 2.13).

Após o extravasamento e a adaptação em um novo microambiente, as células tumorais podem novamente reverter para um fenótipo epitelial, permitindo a aderência e a proliferação no novo tecido. Esta inversão da EMT é conhecida como transição mesenquimal-epitelial (MET, do inglês

mesenchymal-epithelial transition, Figura 2.14). Essa conversão tem sido observada em alguns estudos que demonstram que células tumorais disseminadas na medula óssea muitas vezes exibem um fenótipo epitelial e que metástases a distância se assemelham a estruturas glandulares com o mesmo subtipo molecular de seus respectivos tumores primários.

 

Figura 2.13 A transição epitélio-mesenquimal faz com que a célula converta seu fenótipo epitelial para o fenótipo mesenquimal, diminuindo a expressão de proteínas epiteliais e aumentando a expressão de proteínas mesenquimais, responsáveis pela motilidade da

célula. Adaptada de Kalluri e Weinberg, 2009. 13

 

Sabe-se atualmente que esse comportamento das células neoplásicas é bastante influenciado pela interação com a matriz extracelular, modulando a expressão de diferentes genes. A EMT é controlada por proteínas que interagem com receptores específicos, muitos deles com atividade tirosinoquinase, que, além de atuarem nessa transição de fenótipos, podem atuar como fatores de crescimento. Algumas proteínas que induzem EMT incluem o fator de transformação de crescimento Beta (TGF-β), o fator de dispersão/fator de crescimento de hepatócito (SF/HGF), o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), os membros da família do fator de crescimento epitelial (EGF) e o fator de crescimento insulina-like 1 e 2 (IGF-1 e -2).

O TGF-β está envolvido em diversos processos fisiológicos e é responsável por regular a diferenciação e a proliferação celular, inibindo a progressão do ciclo da célula epitelial, promovendo a apoptose e a migração celular, que, em conjunto, contribuem significativamente para a função supressora dos carcinomas durante o início da progressão. Atualmente, acredita-se que o TGF-β tem exercido duplo papel na progressão e metástase do câncer, sendo considerado um importante supressor de proliferação em células epiteliais cancerosas nos primeiros estágios da carcinogênese, mas induzindo metástases em estágios avançados, por meio da indução da motilidade e da invasão celular. Assim, o TGF-β é, simultaneamente, um importante supressor da proliferação de células epiteliais e um regulador positivo da progressão tumoral e das metástases. Células que adquirem um fenótipo mesenquimal não respondem aos efeitos supressores de TGF-β.

Além disso, membros da família TGF-β desempenham papéis importantes na iniciação da EMT em uma variedade de sistemas biológicos e situações fisiopatológicas, por meio da ativação das principais vias de sinalização e de reguladores de transcrição. Esses diversos estímulos desencadeiam uma infinidade de vias de transdução de sinal que convergem em vários indutores de EMT, incluindo Snail, Slug, Zeb1, Zeb2 e Twist, muitos dos quais frequentemente superexpressos principalmente em tumores mamários.

Figura 2.14 No carcinoma invasivo, ocorre a perda da polaridade de células epiteliais. A composição da membrana basal também muda, alterando as interações entre célula e matriz extracelular. As células se desprendem do tumor primário e, por meio da corrente sanguínea, migram para órgãos distantes. Ao se adaptarem ao novo microambiente, as células metastáticas passam pelo processo da transição mesenquimal-epitelial (EMT) e, portanto, revertem seu fenótipo mesenquimal novamente para o fenótipo epitelial.

Adaptada de Kalluri e Weinberg, 2009.13

 

Em modelo de neoplasia mamária, a inibição do Twist mostrou não ter efeito no crescimento do tumor primário, no entanto reduziu potencialmente o número de lesões metastáticas no pulmão.

 

■ Transição epitélio-mesenquimal e células-tronco tumorais A EMT também contribui com a suscetibilidade de invasão, por conferir propriedades de células-tronco às células tumorais. Cada vez mais é aceito que o processo de EMT pode conferir às células tumorais capacidade de migração e invasão, associadas ao perfil metastático. Além disso, nos últimos anos, tem sido demonstrado que nem todas as células tumorais no interior da massa tumoral apresentam o mesmo potencial de iniciação tumoral. Sugere-se que uma pequena subpopulação de células, denominadas células-tronco tumorais (CCT), apresenta características de autorrenovação, e estas células são capazes de iniciar e manter o crescimento do tumor primário e de metástases.

Estudos recentes têm estabelecido uma associação entre o mecanismo de EMT e as propriedades características de células-tronco tumorais. Em neoplasias mamárias, por exemplo, além de conferir potencial migratório e invasivo, a indução de EMT em células epiteliais mamárias melhora significativamente sua autorrenovação e a capacidade de iniciação do tumor, induzindo a expressão de marcadores de células-tronco tumorais.

Mais recentemente, a presença de subpopulações de CTT em tumores de pulmão, próstata, cérebro, cólon e em linhagens de células malignas provenientes de diferentes origens foi identificada por proteínas de superfícies específicas. O CD133 é considerado um marcador importante para a identificação e o isolamento de CTT, presentes em uma variedade de tumores. Células tumorais, caracterizadas como CTT, têm a capacidade de iniciar o tumor. Células CD133+ estão presentes em câncer de cérebro humano e, principalmente, em gliomas caninos.

Outro biomarcador de CTT é o Oct4, um fator de transcrição também conhecido como POU5F1, que é um dos responsáveis pela autorrenovação e manutenção da pluripotência das células-tronco embrionárias. O gene OCT4 é expresso em células-tronco embrionárias, células germinativas e células-tronco adultas. Estudos recentes demonstraram que a proteína Oct4 está presente principalmente nas CTT de osteossarcoma canino.

O CD44 é outro importante biomarcador que caracteriza CTT na mama, no cólon, na próstata, na cabeça e no pescoço, em tumores do pâncreas, no melanoma e na leucemia. Interessantemente, as células-tronco de neoplasia mamária superexpressam a molécula de adesão CD44 e apresentam baixa ou nenhuma expressão da molécula de adesão CD24. Estudos demonstram que células (CD44+/CD24–low) apresentam características tumorigênicas e metastáticas em tumores de mama. Além disso, em tumores humanos e caninos, um elevado nível de atividade do aldeído desidrogenase (ALDH) é uma característica comum de células cancerosas estaminais em tumores e em células-tronco somáticas normais. Muitos estudos associam a expressão de ALDH+ CD44+/CD24–/low com um fenótipo de células-tronco tumorais de mama.

Heterogeneidade intratumoral A pequena população de CTT se divide de forma assimétrica, dando origem a uma célula semelhante a ela própria (autorrenovação) e a outra diferenciada, o que, ao longo das divisões sucessivas, dá origem a células

em diferentes estados de diferenciação (Figura 2.15). Desse modo, os tumores apresentam células em diferentes estágios de proliferação e diferenciação, o que contribui para a heterogeneidade intratumoral.

A heterogeneidade intratumoral é caracterizada por subpopulações de células tumorais geneticamente distintas, que estão organizadas em diferentes locais subanatômicos dentro do tumor. Cada subpopulação apresenta um perfil gênico e proteico distinto, diferindo, portanto, quanto à agressividade e à sensibilidade ao tratamento.

O princípio da heterogeneidade tumoral é importante em Oncologia, já que muitas vezes considera-se um tumor homogêneo, quando, na realidade, constituído por vários tipos de células com características e comportamentos distintos. Fatores intrínsecos e extrínsecos podem contribuir com a heterogeneidade intratumoral, os quais incluem mutações em genes específicos, alterações cromossômicas, expressão de proteínas específicas, metabolismo energético, estímulos citotóxicos, perfusão sanguínea,oxigenação, bioquímica das membranas, entre outros.

Dependendo do grau de heterogeneidade, ou seja, do tipo e da quantidade de subpopulações celulares, o tumor poderá apresentar comportamentos variados ao longo de toda a sua massa, influenciando na progressão tumoral e na resposta à terapia.

A heterogeneidade tumoral constitui um obstáculo a uma terapia simples, já que um tratamento que tem como alvo terapêutico uma população celular com determinadas características pode não ser eficaz na eliminação de populações celulares neoplásicas com propriedades distintas e, desse modo, falhar na erradicação do tumor. Por isso, é necessário desenvolver novas abordagens terapêuticas, incluindo terapias combinadas, eliminando as células tumorais com fenótipos distintos e, consequentemente, a massa tumoral em sua totalidade.

 

Figura 2.15 As células-tronco tumorais (CTT) geram um tumor com base em suas

propriedades de autorrenovação e alto potencial proliferativo. Adaptada de Dick, 2009. 14

 

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