Oncologia em Cães e Gatos
9 Imuno-histoquímica no Diagnóstico Oncológico
Introdução
A imuno-histoquímica é uma técnica que permite a localização e a visualização de um antígeno in situ, em cortes histológicos processados de forma rotineira, ou seja, em material fixado em formol e incluído em parafina, bem como em tecidos de congelação e preparados citológicos.
A vantagem da técnica de imuno-histoquímica é a associação da visualização do antígeno a ser pesquisado com sua localização no tecido, o que difere de métodos que têm a capacidade de determinar a presença do antígeno e quantificá-lo (p. ex., citometria de fluxo, Western blot), porém sem a possibilidade de se conhecer o tipo celular que o expressa.
De forma resumida, o método imuno-histoquímico se baseia no uso de anticorpos primários contra antígenos a serem identificados em tecidos, em cortes histológicos.
Em 1981, Hsu et al. descreveram a técnica conhecida como método Avidina Biotina Peroxidase (ABC), que se baseia na aplicação de um anticorpo secundário biotinilado, direcionado contra a espécie animal em que foi produzido o anticorpo primário, e, no posteriormente, uso de um complexo contendo avidina-biotina e peroxidase. Este, pela afinidade entre a avidina e a biotina, liga-se ao anticorpo secundário biotinilado. As moléculas de peroxidase recebem elétrons de um cromógeno (Diaminobenzidina – DAB ou AEC – 3-amino, 9-etil carbazol), que se coram de castanho (DAB) ou vermelho
(AEC), sendo este o resultado final da imuno-histoquímica.1
Anticorpos
Os anticorpos primários são de dois tipos: monoclonais ou policlonais. O primeiro deles reage contra um único epítopo antigênico, sendo produzido, normalmente, em camundongos e coelhos. Os anticorpos policlonais reagem contra diferentes epítopos, do mesmo antígeno, e a maior parte é produzida em coelhos.
Os anticorpos monoclonais são mais específicos do que os policlonais, porém a chance de reação cruzada com as diferentes espécies animais é menor do que a dos policlonais, o que pode dificultar o uso de anticorpos monoclonais comerciais, a maioria direcionada contra epítopos de tecidos humanos, no estudo imuno-histoquímico em Medicina Veterinária.
Os anticorpos secundários devem ser direcionados contra a espécie em que foi produzido o anticorpo primário, produzido em uma terceira espécie animal. Por exemplo: pesquisa do imunofenótipo nos linfomas caninos. O anticorpo primário direcionado contra linfócitos T pode ser monoclonal, produzido em camundongos; o secundário – anti-imunoglobulinas de camundongo – pode ser produzido em caprinos, suínos ou equinos.
Esses anticorpos secundários, também denominados sistemas de detecção, podem ser biotinilados (usados nos kits comerciais ABC, LSAB) ou ligados a um polímero que tem a ele aderido moléculas de peroxidase ou fosfatase alcalina.
Diagnóstico
O uso de métodos para melhor exposição de antígenos nas amostras teciduais, antes da reação antígeno-anticorpo propriamente dita, revolucionou a imuno-histoquímica diagnóstica. Métodos de recuperação de epítopos baseados em calor (Heat-Induced Epitope Retrieval, ou HIER) melhoraram a qualidade da imunocoloração de diversos anticorpos primários utilizados no diagnóstico das doenças oncológicas. Várias opções de HIER são descritas, como vaporizador, panela de pressão e forno de microondas. Em geral, na bula dos anticorpos primários vendidos comercialmente, há orientação sobre qual método de recuperação antigênica deve ser utilizado para cada anticorpo em particular.
No entanto, a maioria dos anticorpos utilizados na rotina diagnóstica em pequenos animais é fabricada para funcionar em tecidos humanos, sendo fundamental padronizar os tipos de recuperação antigênica (soluções básicas ou ácidas) para que se obtenha uma adequada reação cruzada do anticorpo primário com o tecido animal.
Existem outros métodos de recuperação antigênica, por exemplo, por digestão enzimática com a utilização de proteinase K. Há também, porém em número bem reduzido, anticorpos primários que não necessitam de recuperação antigênica. É importante que o patologista esteja familiarizado com a padronização das diversas técnicas de realização do exame imuno-histoquímico para a adequada análise da imunocoloração específica para cada anticorpo.
Ainda existem anticorpos primários que somente reagem em cortes de congelação, que não foram submetidos à fixação em formol. Este procedimento é mais difícil de ser aplicado na rotina de um serviço de patologia e tem seu uso limitado.
Uma boa técnica histológica é essencial para o diagnóstico das neoplasias. A formalina, o mais comum e prático fixador de amostras teciduais disponível, permite boa análise histológica e adequada preservação da antigenicidade para a análise imuno-
histoquímica. O ideal é utilizar formalina tamponada a 10% (Tabela 9.1) como fixador universal. Para fixar amostras teciduais, é necessário que o fixador tenha um pH semelhante ao do sangue. Isso evita que uma solução ácida ou alcalina venha a alterar os tecidos e prejudicar futuras análises diagnósticas ou prognósticas, especialmente em exames de imuno-histoquímica e de biologia molecular.
Outro fator importante é o período de fixação na formalina tamponada a 10%. Geralmente, um período de 24 a 72 h é o ideal para que as reações de imuno-histoquímica e de biologia molecular apresentem bons resultados. Amostras teciduais que permanecem por tempo prolongado na formalina perdem a reatividade. O inverso também é verdadeiro; amostras pouco fixadas sofrem autólise e destruição dos epítopos antigênicos.
Tabela 9.1 Receita para confecção de solução de formalina tamponada a 10%.
Reagentes Quantidade (preparo de 1 Quantidade (preparo de 10 ℓ)
ℓ)
Solução de formaldeído (37%) 270 mℓ 2.700 mℓ
Água ltrada 730 mℓ 7.300 mℓ
Fosfato monobásico de sódio 4 g 40 g
Fosfato dibásico (anidro) de sódio 6,5 g 65 g
Atualmente, no diagnóstico oncológico, a técnica de imuno-histoquímica pode ser usada no diagnóstico de neoplasias indiferenciadas, no imunofenótipo das células neoplásicas, na determinação da origem de metástases, como fator prognóstico e avaliação da terapêutica instituída.
Muitos anticorpos utilizados no diagnóstico oncológico usam a nomenclatura CD. A abreviação CD origina-se do inglês cluster of differentiation ou cluster of designation e significa grupo de diferenciação, sendo introduzida na literatura para racionalizar a descrição e a identificação de moléculas da superfície celular utilizadas como alvo de imunofenotipagem. Inicialmente, foi utilizada para leucócitos e, posteriormente, ampliada para outras populações celulares. Fisiologicamente, as moléculas CD atuam, principalmente, como receptores encontrados na membrana celular, e outras têm função, por exemplo, de adesão celular. O número de moléculas CD descrito na literatura médica humana atualmente é superior a 350.
Nem todos os anticorpos produzidos contra moléculas CD funcionam em tecido fixado em formalina e incluído em parafina. Dos anticorpos que não funcionam em blocos de parafina destacam-se alguns marcadores para as doenças histiocíticas e linfoides dos cães e gatos.
A Tabela 9.2 apresenta uma lista dos principais anticorpos primários utilizados no diagnóstico oncológico pela técnica de imuno-histoquímica.
O exame imuno-histoquímico é um exame complementar que pode fornecer informações adicionais, não devendo ser utilizado como única ferramenta diagnóstica das neoplasias. A solicitação de um exame de imuno-histoquímica deve ser baseada em um diagnóstico presuntivo, com um diagnóstico morfológico sólido feito pelo exame histopatológico. Também deve ser indicado para avaliação de fatores prognósticos, como nos mastocitomas caninos, e preditivos, frente a um diagnóstico já estabelecido.
A técnica de imuno-histoquímica deve ser aplicada na forma de painéis de anticorpos primários (marcadores), mas, por meio de outras técnicas, o diagnóstico pode ser feito por exclusão, com a negatividade para os anticorpos testados, por exemplo, por falta de um anticorpo primário específico para determinado tipo celular.
Tabela 9.2 Principais anticorpos primários utilizados no diagnóstico das neoplasias.
ACTH Marcador de grupo de tumores de hipó se
Actina muscular alfa Mio lamento citoplasmático com expressão em músculo liso, células
mioepiteliais e mio broblastos e neoplasias relacionadas (liomiossarcoma e
tumores cutâneos de parede perivascular)
Alfainibina Marcador de tumores de células da granulosa e tumores do córtex adrenal
BCL-2 Oncoproteína codi cada pelo gene BCL-2 envolvido com ação antiapoptótica.
Utilizada para distinção entre linfoma folicular e hiperplasia linfoide folicular reativa
Calponina Marcador mioepitelial
Calcitonina Marcador de células C da tireoide e carcinoma medular da tireoide
Calretinina Marcador de mesotelioma, tumores de células de Sertoli-Leydig e
ameloblastomas
CD117 Proto-oncogene C-KIT ou proteína tirosinoquinase kit, marcador de tumor
gastrintestinal estromal, mastocitoma (painel prognósitco) e seminoma
CD11 d Marcador de sarcoma histiocítico eritrofagocitário
CD163 Marcador de sarcoma histiocítico
CD1a Marcador de histiocitoma (especí co anticanino, utilizado em tecido
congelado)
CD20 Marcador de linhagem linfoide B, persistindo em alguns plasmócitos.
Marcador de linfomas B e alguns plasmocitomas
CD204 Marcador de sarcoma histiocítico
CD3 Receptor de linfócitos T cadeia épsilon. Marcador de linfomas de células T
CD31 Molécula de adesão celular endotelial plaquetária. Marcador de
hemangiossarcoma
CD45 Marcador de neoplasias hematopoéticas. Utilizado para diferenciar neoplasias
linfoides de outra linhagem
CD45RA Antígeno de linhagem B e T naive. Especí co anticanino, utilizado em painéis
diagnósticos de TVT e plasmocitoma (CD45 positivo) e histiocitoma (CD45RA negativo)
CD56 Molécula de adesão de células neurais e neuroendócrinas.
CD79a Expressão em células linfoides pré-B, linfócitos B maduros, persistindo em
alguns plasmócitos. Marcador de linfomas B e alguns plasmocitomas
CD10 Marcador para subgrupo de linfomas, carcinoma de células renais e células
mioepiteliais no diagnóstico diferencial de lesões benignas e malignas da mama
Citoqueratina Clone 34bE12. Marcador de carcinoma de células escamosas e de células
basais de próstata
Citoqueratina 19 Citoqueratina de baixo peso molecular expressa em epitélios escamosos, basal
e ductal. Utilizada em painéis diagnósticos de tumores pancreáticos,
hepáticos, da tireoide e ovarianos
Citoqueratina 20 Marcador de epitélio intestinal e gástrico, urotélio, células de Merkel e
neoplasias relacionadas
Citoqueratina 7 Marcador de epitélio ductal, glandular, escamoso super cial e de transição e
neoplasias relacionadas
Pancitoqueratina Clone AE1AE3. Marcador de carcinomas em geral
Cromogranina Marcador de tumores neuroendócrinos
Desmina Marcador de tumores de musculatura lisa e esquelética (liomiossarcomas e
rabdomiossarcomas)
E-caderina Molécula de adesão celular e marcador de células de Langerhans na maioria
dos histiocitomas
NSE Utilizada em painéis para o diagnóstico dos melanomas, gangliomas, gliomas
e do feocromocitoma
Fator de von Willebrand Marcador de células endoteliais, utilizado no diagnóstico de
(Fator VIII) hemangiossarcomas
FSH Marcador de grupo de tumores de hipó se
Gastrina Marcador de grupo de tumores de células de ilhotas pancreáticas e
gastrinomas
GFAP Proteína ácida brilar glial. Utilizada em painéis diagnósticos de tumores de
bainha neural periférica e tumores neurais
Glucagon Marcador de grupo de tumores de ilhotas pancreáticas
HLA-DR Complexo principal de histocompatibilidade MHC II. Utilizado em painéis
diagnósticos de neoplasias histiocíticas e TVT
Insulina Marcador de grupo de tumores de ilhotas pancreáticas
Ki67 Antígeno de proliferação celular. Marcador de proliferação celular (células em
fases não G0)
Lisozima Marcador de granulócitos, histiócitos e leucemias mieloides
Melan A Marcador de melanomas e tumor do córtex adrenal e de estroma ovariano
MyoD Marcador de rabdomiossarcoma
MUM1 Marcador de plasmocitoma e mieloma múltiplo
Neuro lamentos Marcador de tumores neuronais
PTH Marcador de adenoma e carcinoma de paratireoide
Pax5 Proteína ativadora especí ca de célula B (BSAP). Marcador de linfomas de
células B
PNL2 Marcador de melanomas
Polipeptídio pancreático Marcador de tumores pancreáticos
PSA Marcador de tumores prostáticos
Receptor de androgênio Marcador de tumores prostáticos
Receptor de estrógeno Tumores de mama e alguns carcinomas
Receptor de progesterona Tumores de mama e alguns carcinomas
S-100 Marcador de células neurogliais, ependimárias, melanocíticas e células de
Schwann
Sinapto sina Marcador de tumores neuroendócrinos
Somatostatina Marcador de grupo de tumores de células de ilhotas pancreáticas e outros
tumores neuroendócrinos
Tireoglobulina Marcador de tumores foliculares da tireoide
Triptase Marcador de leucemias e mastocitoma
TTF-1 Fator de transcrição tireoidiano. Marcador de carcinomas de pulmão e tireoide
Uroplaquina Marcador de carcinoma urotelial
Vimentina Marcador de sarcomas em geral
WT-1 Produto de gene supressor de tumor. Marcador de mesotelioma e tumores
epiteliais ovarianos
Adaptada de Dabbs D, 2006.2 NSE = enolase neuronal especí ca; FSH = hormônio folículo-estimulante; PTH = paratormônio; PSA = antígeno prostático especí co.
Nas neoplasias indiferenciadas e na determinação do imunofenótipo de certos tipos de câncer, um painel com anticorpos primários deve ser usado.
Para instituir um painel de anticorpos primários de neoplasias indiferenciadas, estas devem ser classificadas de acordo com o tamanho e o tipo de célula, e a experiência do patologista é fundamental para que o número de anticorpos primários usados seja o
menor possível. Nas Figuras 9.1 a 9.4, encontram-se as indicações de painéis de diagnóstico de algumas neoplasias de cães e gatos.
As neoplasias primárias e suas metástases mantêm a expressão de filamentos intermediários, que são estruturas, como os microtúbulos e microfilamentos, que formam uma rede de sustentação no citoplasma celular, sendo específicos para cada tipo celular, o que permite o uso de anticorpos primários contra essas proteínas na caracterização de tumores malignos, especialmente os anaplásicos.
Figura 9.1 A e B. Organogramas de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno-histoquímico de linfomas de células B e T.
Figura 9.2 Organograma de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno-histoquímico de plasmocitomas cutâneos.
Figura 9.3 Organograma de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno-histoquímico de mastocitoma cutâneo canino.
Figura 9.4 Organograma de anticorpos utilizados no diagnóstico imuno-histoquímico de histiocitoma canino.
Existem cinco tipos de proteínas de filamentos intermediários. A maioria das células mesenquimais contém a vimentina como um dos principais filamentos intermediários; as células musculares têm a desmina; e os astrócitos, a proteína ácida fibrilar glial (GFAP). As células epiteliais contêm um sistema de filamentos intermediários mais complexos composto de citoqueratinas.
Alguns tumores histologicamente indiferenciados podem ser submetidos à técnica de imuno-histoquímica a fim de, inicialmente, determinar-se a origem epitelial (uso de painel de anticorpos anticitoqueratinas-CK) ou mesenquimal (anticorpo antivimentina)
(Figura 9.5). A partir desse ponto, pode-se aprofundar na origem do tipo de epitélio (citoqueratina positivo) por meio do uso de anticorpos contra citoqueratinas de diferentes
pesos moleculares, específicas para cada tipo de epitélio (Tabela 9.3), ou de proteínas relacionadas ao tecido mesequimal (alfa-actina muscular, por exemplo em linhagem muscular lisa), se vimentina positivo.
Para tumores de origem epitelial, pode-se citar o uso de citoqueratinas (CK7 e CK20) na diferenciação do sítio primário dos carcinomas, e principalmente de adenocarcinomas
(Tabela 9.4). Esses dois tipos de citoqueratina apresentam distribuição peculiar em epitélios de revestimento normais e nos carcinomas correspondentes. Quando avaliada simultaneamente e de maneira racional, a imunorreatividade de CK7 e CK20 pode contribuir na identificação do sítio primário de vários carcinomas e adenocarcinomas.
Figura 9.5 Canino. Massa na região óssea (sacro). Metástase óssea. Carcinoma de origem primária desconhecida. A. Células neoplásicas negativas para vimentina. B. Células neoplásicas positivas para pancitoqueratina (AE1/AE3). C. Pancitoqueratina (AE1/AE3), com mais detalhe das células positivas (seta) em meio à matriz óssea. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Tabela 9.3 Painel de anticorpos para tumores de origem epitelial, de acordo com o tipo tumoral.
Tumor MNF116 AE1/AE3 CK7 CK20 CK5/6 34βE12 E- Vimentina
caderina
Ameloblastoma P N N N P P P P
acantomatoso
Adenocarcinoma P P N N N BM P N
de saco anal
Adenocarcinoma P P P N Células Células P V
ceruminoso basais basais
Tumor de P V N N V P P N
folículo piloso
Carcinoma P BM N N P BM P N
basocelular P
Carcinoma P P BM N P BM P N
espinocelular
Adenocarcinoma Células N N N Células P P N
sebáceo basais basais
Adenocarcinoma Células N N N Células P P N
perianal basais basais
Carcinoma renal P P V N N V P P
Adenocarcinoma P P P N V# V# P P
pulmonar
Adenocarcinoma P* P BM** P N V P V
gastrintestinal
Adenocarcinoma P P V N Células Células P V
mamário basais basais
Carcinoma BM N N N N N P N
hepatocelular
Carcinoma biliar P P P BM N BM P N
Carcinoma P P P N N N P N
pancreático
Carcinoma P P P P N BM P N
endometrial
* não gástrico; ** gástrico; # diferenciação escamosa; P = positivo; N = negativo; V = variável; BM = baixa marcação.
Tabela 9.4 Uso de CK7 e CK20 no diagnóstico dos adenocarcinomas
Local Porcentagem (%)
CK7+ CK20+
Ovário mucinoso 90
Céls. de transição 65
Pâncreas 65
Colângio 65
Gástrico 40
Exclui carcinoide espinocelular e hepatocelular, < 5
pequenas células pulmonar, ovário não mucionoso,
renal
CK7+ CK20-
Ovário não mucinoso 100
Tireoide 100
Mama 90
Pulmão 90
Útero 85
Mesotelioma 65
Céls. de transição 35
Pâncreas 30
Colângio 30
Exclui colorretal, ovário mucinoso, seminoma < 5
CK7- CK20+
Colorretal 80
Céls. Merkel 70
Gástrico 35
Exclui mama, carcinoide pulmonar, colângio, células < 5
escamosas, pulmonares (todos os tipos),
hepatocelular, ovário, pâncreas, renal, de células de
transição, útero
CK7- CK20-
Adrenal 100
Seminoma 95
Próstata 85
Hepatocelular 80
Renal 80
Carcinoide GI e pulmonar 80
Pequenas células pulmonares 75
Escamoso do esôfago 70
Escamoso de cabeça e pescoço 70
Mesotelioma 35
Exclui mama, colângio, pulmão, ovário, pâncreas, < 5
células de transição
Adaptada de Dabbs D, 2006.2
Em relação às neoplasias de origem mesenquimal, é importante a diferenciação entre
os tumores considerados sarcomas cutâneos e subcutâneos de partes moles3 daqueles que não estão nesta categoria, já que os sarcomas de partes moles têm baixo potencial metastático, porém são localmente agressivos. Neste caso, a avaliação das margens cirúrgicas é mais importante que o tipo específico de sarcoma de partes moles.
Entre os sarcomas com maior potencial metastático e pior prognóstico, é possível citar os sarcomas histiocíticos, o hemangiossarcoma, o osteossarcoma e o melanoma. Pode-se usar um painel para diferenciação do tipo celular, com o uso de marcadores miogênicos
(desmina, alfa-actina muscular, calponina e miogenina) (Figura 9.6), de origem vascular e
parede perivascular (fator VIII, CD31, Fli-1 e alfa-actina muscular) (Figura 9.7), além
dos associados à bainha neural (S100, GFAP e CD56) (Figura 9.8).
As neoplasias melanocíticas são comumente diagnosticadas em cães, e o melanoma é referido como a neoplasia maligna mais comum em cavidade oral nos caninos. Os principais marcadores para o diagnóstico das lesões melanocíticas de cães e gatos são o Melan A ou MART-1, anticorpo monoclonal que reconhece proteína específica de diferenciação melanocítica, o PNL2, também denominado antígeno melanocítico, e o
S100, proteína expressa em muitas células, incluindo os melanócitos (Figuras 9.9 e 9.10).
Como fator prognóstico dos melanomas, a taxa de proliferação celular, avaliada pelo
anticorpo Ki67, é indicada. O valor de corte para o Ki67 é de 19,5 para melanomas orais4, e para as lesões melanocíticas cutâneas, acima de 15% de positividade para o Ki67
confere pior prognóstico.5,6
Nos cães, o diagnóstico de tumores de células redondas, baseado na histopatologia, é desafiador. Neoplasias de células redondas podem apresentar-se morfologicamente semelhantes, principalmente em tumores pouco diferenciados. O uso da imuno-histoquímica nesses casos é de grande auxílio para o diagnóstico diferencial e consequente determinação do prognóstico e tratamento mais adequado.
A imunofenotipagem dos linfomas caninos é importante para a classificação histológica e o fator prognóstico. Os principais marcadores para a imunofenotipagem dos linfomas caninos e felinos, resistentes à fixação por formalina, são o CD20, o CD79A e o
Pax5, para os linfomas de células B (Figuras 9.11 e 9.12), e CD3 para os linfomas de
células T (Figura 9.13). Atualmente, não há um marcador de linhagem específica para células NK em cães e gatos, sendo utilizado para o auxílio da imunofenotipagem desses linfomas (de células NK) o anticorpo Granzima B.
Figura 9.6 Canino. Rabdomiossarcoma metastático. Positividade citoplasmática esparsa nas células neoplásicas para desmina. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.7 Canino. Fêmur hemangiossarcoma ósseo. A. Corte histológico corado por HE, onde se observam células fusiformes neoplásicas e grande quantidade de eritrócitos. B. Células fusiformes neoplásicas positivas para vimentina. C. Células fusiformes neoplásicas positivas para fator VIII. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.8 Canino. Pele, subcutâneo, tumor maligno de bainha neural periférica. A. Positividade membranosa e citoplasmática para CD56. B. Positividade citoplasmática para GFAP. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.9 Canino. Melanoma acral. A. Imunorreatividade positiva para PNL2. B. Imunorreatividade positiva para Melan A. C. Imunorreatividade positiva para S100. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Como marcadores para os plasmocitomas caninos, são utilizados o MUM-1 (expresso em 90% dos plasmocitomas), o CD20 e o CD79A com padrões de positividades variáveis
(Figura 9.14).
A proliferação de mastócitos está associada à mutação do proto-ocogene c-KIT, que é responsável pela produção de uma proteína KIT (CD117), que estimula a proliferação dessas células. Essa proteína também é conhecida como fator de crescimento dos mastócitos.
Um grupo de pesquisadores7,8 realizou estudos correlacionando o padrão de imunocoloração da proteína KIT nos mastocitomas cutâneos e subcutâneos com o comportamento biológico desses tumores nos cães. Foram determinados três padrões da proteína KIT (CD117) nos mastócitos neoplásicos, padrão KIT 1 (imunocoloração
membranosa; Figura 9.15 A), padrão KIT 2 (citoplasmática focal perinuclear associada à
perda de marcação membranosa; Figura 9.15 B) e padrão KIT 3 (marcação
citoplasmática difusa; Figura 9.15 C). Os padrões 2 e 3 da proteína KIT estão associados ao aumento do risco de recidiva tumoral e/ou à metástase. Os mastocitomas cutâneos e subcutâneos caninos com padrão KIT1, na maioria dos casos, não estão associados a prognóstico ruim.
Associado à análise da proteína KIT, o Ki67 (clone MIB-1) também tem valor
prognóstico nos mastocitomas cutâneos e subcutâneos caninos (Figura 9.16). A
metodologia de contagem de células positivas para o Ki67 foi descrita por Webster et al.7 e é altamente reprodutível na rotina diagnóstica. Nesta metodologia, com o auxílio de um retículo de 1-cm2 10 × 10 em objetiva de 40, são contados os núcleos positivos para o Ki67. Quando no campo de um retículo houver mais de 23 células positivas para Ki67 em mastocitomas cutâneos e 22 células positivas nos mastocitomas subcutâneos, a chance de recorrência local e metástase será maior. Quando estes números não somarem em um único retículo, será avaliado o resultado da média de 5 campos (40 ×) em uma área de maior proliferação celular no infiltrado tumoral.
Nos felinos, até o momento da publicação deste capítulo, não havia um consenso entre os estudos do valor prognóstico dos marcadores KIT (CD117) e Ki67.
Figura 9.10 Canino. Melanoma acral amelanótico. Presença de células fusiformes com nucléolos evidentes e ausência de pigmento de melanina (HE). Células neoplásicas positivas para Melan A. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
■ Marcadores
O diagnóstico imuno-histoquímico das doenças histiocíticas nos cães e gatos é complicado, pois vários marcadores amplamente utilizados na medicina humana não apresentam reação cruzada com o tecido dessas espécies. Ainda, muitos marcadores linhagem-específicos somente funcionam em cortes de congelação. A seguir, serão descritos os principais marcadores para as doenças histiocíticas neoplásicas em cães e gatos que funcionam em tecido fixado em formol e incluído em parafina.
• Marcadores para o histiocitoma (Figura 9.17) e a histiocitose cutânea de células de Langerhans: CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), E-caderina (±). Essas neoplasias não expressam CD204, CD163, Thy-1 (CD90), CD45RA e CD3, sendo estes marcadores úteis na construção de painéis diagnósticos para a diferenciação de sarcoma histiocítico, histiocitose reativa e linfomas cutâneos de células T
• Marcadores para o sarcoma histiocítico de células dendríticas: MHC II (+), CD18 (+), lisozima (+), CD204 (±), CD163 (–). A molécula de superfície CD204, apesar de ser um
receptor macrofágico, assim como o CD163 (Figura 9.18), apresentou positividade em
uma série de sarcomas histiocíticos de células dendríticas em estudo recente9 • Marcadores para o sarcoma histiocítico de origem macrofágica: CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), CD204 (+), CD163 (±)
• Sarcoma histiocítico eritrofagocitário: CD11 d (+), CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), CD204 (±), CD163 (±)
• Histiocitose felina progressiva: CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+), E-caderina (±) • Histiocitose pulmonar de células de Langerhans: CD18 (+), MHC II (+), lisozima (+),
E-caderina (+) (Figura 9.19). Em sítios extrapulmonares, o marcador E-caderina pode ser negativo.
Não há marcadores específicos para o tumor venéreo transmissível (TVT), no entanto
eles expressam consistentemente CD45RA, lisozima e MCH II (Figura 9.20) e são negativos para os marcadores de linhagem celular T e B.
Em relação aos tumores de mama em cadelas, a reação de imuno-histoquímica pode
ser realizada para fins prognósticos. Gama et al.10 relataram quatro tipos de fenótipos moleculares dos tumores de mama em caninos, com base na classificação humana. Foram utilizados cinco anticorpos diferentes (receptor de progesterona-RP; receptor de estrógeno alfa-RE, HER-2; p63; citoqueratina 5 e caderinas). Os tumores com piores prognósticos, relacionados com menor sobrevida e tempo livre da doença, foram os basais RE (–), HER2 (–) e p63 (+). Esse painel não é feito de rotina na Medicina Veterinária, mas bem-aceito e utilizado na Medicina Humana.
Figura 9.11 Felino. A. Intestino, linfoma de células T, células linfoides neoplásicas com poucas atipias, HE. B. Positividade para o anticorpo CD3. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.12 Canino. Linfoma de células B. A. Baço. Positividade nuclear para Pax5. B. Linfonodo. Positividade membranosa para o anticorpo CD20. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.13 Canino. Pele, linfoma cutâneo epiteliotrópico. A. Nota-se a intensa infiltração de células linfoides T CD3 positivas no epitélio folicular. B. Nota-se a infiltração de células linfoides T CD3 positivas na epiderme com formação de microabscesso de Pautrier (*). Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.14 Canino. Massa cutânea com diagnóstico de neoplasia maligna de célula redonda indiferenciada. Painel imuno-histoquímico para plasmocitoma. A. Observa-se infiltrado neoplásico composto de células arredondadas, HE. B. Células neoplásicas positivas para MUM1 (marcador de plasmócitos). C. Células neoplásicas positivas para CD79A (marcador de células linfoides B e persistente em alguns plasmócitos). D. Células neoplásicas positivas para CD20 (marcador de células linfoides B, persistentes em alguns plasmócitos). E. Células neoplásicas negativas para CD3, com raros linfócitos T reativos infiltrando a neoplasia. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.15 Mastocitoma cutâneo canino, positividade para CD117 (c-KIT ou proteína KIT). A. Padrão de marcação KIT 1 (membranoso). B. Padrão de marcação KIT 2 (citoplasmática focal perinuclear associada à perda de marcação membranosa). C. Padrão de marcação KIT 3 (citoplasmático difuso), de acordo com
Webster 7 et al . Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.16 Mastocitoma cutâneo canino. Avaliação da taxa de proliferação celular com o anticorpo primário Ki67 (clone MIB-1). A. Mastocitoma de baixo grau de malignidade/grau II de Patnaik. Positividade nuclear para Ki67. Baixa proliferação celular com menos de 23 células positivas, avaliadas em 5 campos (objetiva de 40 ×) com auxílio de retículo de 10 × 10 mm (1-cm 2). B. Mastocitoma de baixo grau de malignidade/grau II de Patnaik, positividade nuclear para Ki67. Alta proliferação celular com mais de 23 células positivas, avaliadas em um único campo (objetiva de 40 ×) com auxílio de retículo de 10 × 10 mm
(1-cm2 7 ). Contagem feita de acordo com Webster et al . Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.17 Canino. Pele, histiocitoma. A. Positividade membranosa e citoplasmática para o MHC II nas células neoplásicas. B. Positividade membranosa em queratinócitos da epiderme e nas células neoplásicas para E-caderina. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Peña et al.11 sugerem que o painel imuno-histoquímico para tumores de mama incluam marcadores para células mioepiteliais (p63 e/ou calponina); para células luminais (citoquerainas 8, 18 e 19); RE, RP e HER-2. No último consenso nacional sobre tumores de mama em cadelas (Belo Horizonte, dezembro de 2013), recomendou-se um painel
prognóstico com o uso de anticorpos para RE, RP, COX-2, E-caderina e Ki67 (Figura
9.21). A pesquisa de metástases de carcinomas mamários em linfonodos também pode ser feita com auxílio da pancitoqueratina (AE1AE3), que evidencia focos de micrometástase.
Os tumores neuroendócrinos (NET, do inglês neuroendocrine tumors) são neoplasias de difícil diagnóstico anatomopatológico, e o auxílio do exame imuno-histoquímico é sempre recomendado. Os marcadores primários de todos os NET são a cromogranina, o CD56 e a sinaptofisina.
Figura 9.18 Canino. Pele, sarcoma histiocítico, positividade citoplasmática granular de CD163 nas células neoplásicas. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Os NET são um grupo de neoplasias malignas sólidas, com origem a partir de células neuroendócrinas encontradas em todo o corpo. Alguns NET, denominados NET funcionais, podem produzir sintomas e comorbidades relacionadas com a secreção de hormônios ou peptídios específicos (p. ex., diarreia, hipoglicemia). No entanto, muitos NET são chamados não funcionais, porque eles são clinicamente silenciosos (assintomáticos) ou apenas produzem sintomas causados pela presença da massa tumoral (p. ex., dor, obstrução, sangramento). Em cães e gatos, os NET são raros e, geralmente, multi-hormonais, isto é, têm o envolvimento de vários hormônios secretados pelo tumor. Os NET podem ser designados por meio de uma variedade de termos, como “carcinoides”, “tumores carcinoides”, “tumores endócrinos”, ou tumores
neuroendócrinos gastrenteropancreáticos (GEP-NET). A Tabela 9.5 apresenta os vários tipos de marcadores para os NET.
Figura 9.19 Felino, nódulo pulmonar. Histiocitose pulmonar de células de Langerhans, positividade difusa para E-caderina nas células histiocíticas. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.20 Canino. Linfonodo, metástase de tumor venéreo transmissível. A. Marcação citoplasmática granular para lisozima das células neoplásicas. B. Positividade membranosa para CD45RA das células neoplásicas. C. Positividade para MHC II das células neoplásicas. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Figura 9.21 Canino, tumor de mama. A. Positividade membranosa nas células neoplásicas para E-caderina. B. Positividade nuclear nas células neoplásicas para receptor de progesterona. C. Positividade citoplasmática nas células neoplásicas para ciclo-oxigenase 2. Imuno-histoquímica, polímero, DAB, contracoloração hematoxilina. Imagem cedida por VetMol.
Considerações finais
Nos últimos anos, o uso da técnica de imuno-histoquímica cresceu bastante na rotina diagnóstica oncológica veterinária. Deve-se lembrar que esta é uma técnica viável, que é feita no mesmo material que foi utilizado para o diagnóstico histopatológico da neoplasia (o mesmo bloco de parafina) e que auxilia no diagnóstico morfológico, na determinação de fatores prognósticos e preditivos, importantes na tomada de decisão da conduta com o paciente oncológico.
Tabela 9.5 Vários tipos de tumor neuroendócrino e seus marcadores imuno-histoquímicos.
Tipos Sítio primário Hormônio Marcadores IHQ
predominantemente
envolvido
Carcinoide Estômago, intestino Serotonina CK (+), marcadores
delgado grosso, pâncreas primários, serotonina +
Gastrinoma Duodeno, pâncreas Gastrina Gastrina (+),
polipeptídio pancreático
(±)
Insulinoma Pâncreas Insulina Insulina (+), 50% multi-
hormonal (polipeptídio
pancreático, gastrina,
glucagon, somatostatina,
ACTH)
VIPoma Pâncreas Peptídio intestinal Peptídio intestinal
vasoativo vasoativo (+)
Glucagonoma Pâncreas Glucagon Glucagon (+),
polipeptídio pancreático
(±), insulina (±)
Somatostatinoma Pâncreas, duodeno Somatostatina Somatostatina +,
polipeptídio pancreático
±, gastrina (±), ACTH
(±), calcitonina (±)
ACTHoma Adrenal, pâncreas ACTH ACTH (+)
GRFoma Pâncreas, hipotálamo GRF GRF (+)
ACTH = hormônio adrenocorticotró co; GRF = fator de liberação do hormônio de crescimento.
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