19 Mecanismo de Resistência aos Quimioterápicos

Introdução

Nos últimos anos, o estabelecimento de novos protocolos e de fármacos quimioterápicos propiciou avanços importantes no aumento da sobrevida dos pacientes caninos e felinos com neoplasias. No entanto, mesmo com os recentes progressos, a efetividade do tratamento quimioterápico de certos neoplasmas pode ser limitada pela resistência tumoral aos fármacos antineoplásicos.

A resistência tumoral é um fenômeno comum encontrado por médicos e veterinários que tratam pacientes oncológicos. Infelizmente, um grande número de pacientes desenvolve resistência aos fármacos durante o curso do tratamento e se torna irresponsivo a vários agentes antineoplásicos. Essa inabilidade de tratar os pacientes efetivamente após a recidiva tumoral é provavelmente decorrente de vários mecanismos de resistência, pelos quais células neoplásicas selecionadas para resistência a um único agente quimioterápico podem apresentar resistência cruzada a vários compostos não relacionados estrutural e funcionalmente. Esse fenômeno é conhecido como resistência a múltiplas drogas (RMD) e é o maior obstáculo ao sucesso da quimioterapia. Na Medicina, acredita-se que esse fenômeno possa contribuir com a morte de mais de 90% dos pacientes com câncer.

A resistência aos fármacos está associada a mecanismos celulares e a fatores que afetam a biodisponibilidade e a eficácia do fármaco. Estes últimos incluem método e protocolo de administração, dosagem, absorção, biotransformação, suprimento sanguíneo e oxigenação do tecido. O mecanismo celular é uma forma de resistência mais duradoura e complexa e é classificado como intrínseco (as células são resistentes antes do início da terapia) e adquirido (normalmente surge após o início da quimioterapia). Alguns tumores, incluindo o carcinoma de células não pequenas do pulmão e do cólon, têm um fenótipo resistente, por definição, e respondem insuficientemente aos fármacos citotóxicos. Outros tumores, como os de mama, de ovários em estágios avançados e os linfomas humanos e caninos, frequentemente recidivam após uma resposta inicial à quimioterapia e se tornam resistentes a um amplo espectro de fármacos.

Nas últimas décadas, vários mecanismos celulares explicando a resistência aos fármacos têm sido caracterizados. Tais mecanismos podem agir individualmente ou em sinergismo, levando à RMD, e incluem a ativação de proteínas transmembrânicas que reduzem as concentrações intracelulares de diferentes substâncias químicas; ativação do sistema glutationa/glutationa-S-transferase; alterações no alvo do fármaco; alterações nos mecanismos de reparação celular; e alterações de genes e

proteínas envolvidas no controle da apoptose (Quadro 19.1).

 

Resistência a múltiplas drogas

■ Por redução das concentrações intracelulares

Glicoproteína-P

O mecanismo mais estudado de RMD é o que envolve a super-expressão da glicoproteína-P (gp-P), uma proteína de membrana que confere resistência a fármacos em células tumorais de mamíferos. A gp-P, que também é denominada p170, em virtude do seu peso molecular (160 a 180 quilodaltons), age como uma bomba de efluxo de fármacos, a qual os expulsa ativamente das células neoplásicas e, dessa forma, limita o efeito citotóxico desses fármacos no seu local de ação. A gp-P é uma bomba de efluxo ATP-dependente, pertencente à superfamília de transportadores ABC (“ATP Binding Cassete”), a qual representa a maior família de proteínas transportadoras, que compreendem 49 transportadores, posteriormente subdivididos em sete subfamílias ABC, A a G. Entre elas, a gp-P faz parte da subfamília B, membro 1 (ABCB1).

 

Quadro 19.1 Principais mecanismos celulares de resistência a múltiplas drogas.

 

Redução das concentrações intracelulares dos fármacos

 

Glicoproteína-P

 

Proteína associada à resistência a múltiplas drogas (MRP)

 

Proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP)

 

Proteína relacionada com a resistência no pulmão (LRP)

 

Alteração no metabolismo do fármaco

 

Glutationa

 

Glutationa-S-transferase

 

Outras

 

Alteração no alvo do fármaco

Topoisomerase I

 

Topoisomerase II

 

Aumento do reparo do DNA

 

06-alcoilguanina-DNA-alcoiltransferase

 

Outros

 

Expressão de genes reguladores da apoptose

 

p53, p21, p27 e outros

 

Família BCL-2

 

Outros

 

Embora, recentemente, tenham ocorrido avanços no entendimento de sua estrutura, o mecanismo molecular preciso do transporte dos fármacos pela gp-P não está ainda totalmente elucidado. Inicialmente, foi proposto que, semelhantemente ao que ocorre com as proteínas dos canais de íons, as regiões hidrofóbicas da membrana e os elementos hidrofóbicos da glicoproteína-P formam um poro aquoso transmembrânico pelo qual os fármacos são transportados do citosol para o meio extracelular por meio da energia obtida por hidrólise da adenosina trifosfato (ATP, adenosine triphosphate). Entretanto, dados de pesquisas posteriores sugerem que a gp-P não funciona simplesmente como uma bomba de efluxo, expulsando substâncias por meio dos poros, mas sim como um aspirador hidrofóbico, como uma “flippase”. Neste modelo, a gp-P intercepta o fármaco lipofílico quando ele se move por meio da camada lipídica da membrana celular e o remove da porção interna para a externa da membrana e, daí, para o meio extracelular. Este modelo é consistente com o conceito de que a capacidade lipofílica do fármaco é um determinante importante na sua interação com a gp-P.

A gp-P humana é codificada pelo gene MDR1, que é um membro da família MDR localizado no cromossomo 7 (banda 7q21.1). A família MDR inclui dois genes no homem (MDR1 e MDR2), três nos camundongos (mdr 1, 2, 3) e nos hamsters (pgp1, 2, 3). Apesar de uma identidade alta das sequências de aminoácidos entre as glicoproteínas-P (> 70%), os produtos do gene MDR são subdivididos em duas classes diferentes. A classe 1 consiste nas gp-P transportadoras de fármacos (ou transportadores de múltiplos fármacos), que incluem o MDR1 humano, mdr3 e mdr1 de camundongo e pgp1 e pgp2 de hamster. A classe 2 inclui as gp-P não transportadoras de fármacos, como os MDR2/3 humano, mdr2 de camundongo, pgp3 de hamster. Experimentos utilizando transferência gênica demonstraram que apenas os genes da classe 1 causaram a RMD, enquanto a introdução dos genes da classe 2 nas células não produz este efeito. Os produtos dos genes da classe 2 estão predominantemente expressados nos canalículos biliares do fígado. O MDR1 canino tem 93% de homologia com o gene humano e 90% com os genes equivalentes em camundongos e hamsters. Coletivamente, estudos sobre a gp-P canina sugerem que ela atue da mesma forma que a gp-P humana, no entanto, com base na diferenças encontradas nas sequências na região promotora do gene MDR1 entre as duas espécies, é especulado que a regulação da expressão da gp-P nas células tumorais humanas pode ser diferente da regulação nas células caninas.

Os substratos químicos transportados pela gp-P têm estruturas muito diversas, compartilhando apenas as propriedades de serem moléculas hidrofóbicas anfipáticas (moléculas que têm dois sítios com propriedades caracteristicamente distintas), com peso molecular variando de 200 a 1.800 kDa. A gama de substratos transportada pela gp-P é ampla e inclui uma variedade de agentes farmacologicamente distintos, utilizados na quimioterapia das neoplasias, no tratamento da hipertensão, nas alergias, nas infecções, na indução da imunossupressão, em neurologia e no combate

da inflamação (Quadro 19.2).

 

Quadro 19.2 Substratos e indutores da gp-P.

 

Substratos

 

Fármacos antineoplásicos: actinomicina D, daunorrubicina, docetaxel, doxorrubicina,

etoposídeo, imatinibe, irinotecano, mitomicina C, mitoxantrona, paclitaxel, teniposida,

topotecana, vimblastina, vincristina

 

Anti-hipertensivos: celiprolol, diltiazem, lorsatana, talinolol

 

Antiarrítmicos: digoxina, quinidina, verapamil

 

Antidepressivos: amitriptilina

 

Antimicrobianos: doxiciclina, eritromicina, itraconazol, cetoconazol, levo oxacino,

rifampicina, tetraciclina

 

Antiepilépticos: fenobarbital, fenitoína

 

Antiácidos: cimetidina, ranitidina

 

Antieméticos: domperidona, ondansetrona

 

Antivirais: amprenavir, indinavir, nel navir, ritonavir, saquinavir

Imunossupressores: ciclosporina A, sirolimus, tacrolimus, valspodar

 

Neurolépticos: clorpromazina, fenotizina

 

Hormônios esteroides: aldosterona, cortisol, dexametasona, metilprednisolona

 

Opioides: mor na, pentazocina

 

Outros: ivermectina, loperamida, terfenadina, vencurônio

 

Indutores

 

Ácido retinoico, amiodarona, amprenavir, clorambucila, clotrimazol, colchicina, ciclosporina,

daunorrubicina, dexametasona, diltiazem, doxorrubicina, eritromicina, etoposídeo,

fenobarbital, fenitoína, urouracil, hidroxiureia, insulina, indinavir, metotrexato, midazolam,

mitoxantrona, mor na, nel navir, reserpina, rifampicina, tacrolimus, taximoxifeno, verapamil,

vimblastina, vincristina, ioimbina

 

Infelizmente, muitos destes agentes, além de substratos, são indutores da expressão da gp-P (p. ex., a dexametasona, a ciclosporina e a morfina, ver

Quadro 19.2). Portanto, o uso de muitos deles, antes da realização da quimioterapia, pode induzir o fenótipo de resistência aos fármacos nos pacientes. Adicionalmente, o uso desses agentes no momento da administração da quimioterapia pode alterar a farmacocinética e a toxicidade dos agentes quimioterápicos ou de outros substratos da gp-P. Além dos fármacos, o estresse físico, como a irradiação por raios X, luz ultravioleta e choque térmico, pode induzir expressão da gp-P.

Em humanos, encontrou-se alta expressão da gp-P em células normais de

fígado, pâncreas, rins (túbulos renais), cólon (Figura 19.1 A), jejuno, córtex da adrenal, placenta, barreira hematencefálica, células da medula óssea e do sangue. Em cães, por meio da imuno-histoquímica, encontrou-se um padrão de marcação consistente da gp-P em tecidos normais, como fígado,

glândula adrenal, cólon (Figura 19.1 B), rim, estômago, pâncreas e ductos das glândulas salivares, semelhante ao observado no homem. Empregando a mesma técnica em tecidos felinos, van der Heyden et al. concluíram que a distribuição tissular e a localização celular da marcação foram semelhantes ao descrito no homem e no cão na maioria dos tecidos, com exceção dos

rins.1

Tanto em humanos como nos cães e nos gatos, a gp-P parece ter um papel fisiológico nos processos de secreção, entretanto a sua função normal não está completamente elucidada. Estudos em camundongos nocauteados para o gene mdr1 mostraram que tais animais mantiveram vitalidade e fertilidade inalteradas e uma variedade de parâmetros bioquímicos e imunológicos normais. Contrariamente, apresentaram cinética e “clearance” mais lentos da vimblastina e acumularam altos níveis de certos fármacos no cérebro (vimblastina, ivermectina, ciclosporina A, dexametasona, ondasetrona, loperamina e digoxina), demonstrando o importante papel da gp-P na barreira hematencefálica, que previne o acúmulo de muitos fármacos no tecido cerebral. Esses camundongos também demonstraram um aumento marcante nos níveis desses fármacos nos testículos, no ovário e na glândula adrenal, comparados com os camundongos não nocauteados. É interessante que esses camundongos e alguns cães da raça Collie apresentam sinais neurológicos semelhantes após a administração de ivermectina. Estudos têm mostrado que uma subpopulação de Collies sensíveis à administração de ivermectina têm uma gp-P mutante e que 35% dos Collies são homozigotos para o alelo mutante da gp-P, o que é consistente com relatos anteriores que sugerem que 30 a 40% dos Collies têm sensibilidade à ivermectina.

Figura 19.1 Fotomicrografias de cólon humano (A) e canino (B), submetidos à reação de imuno-histoquímica ao anticorpo primário antiglicoproteína-P pelo método avidina-biotina-peroxidase (ABC). A. Observam-se marcações de coloração castanha nas margens apicais dos enterócitos. Aumento: 400 ×. B. Observam-se marcações, notadamente mais intensas, situadas tanto nas membranas como nos citoplasmas dos enterócitos. Aumento: 400 ×. Contracoloração: hematoxilina de Harris.

 

Em algumas neoplasias, a expressão ativa da gp-P (ou superexpressão do gene MDR1) é geralmente encontrada no momento do diagnóstico. Frequentemente, ela está relacionada com o tipo de célula que origina o tumor. Portanto, altos níveis de expressão do MDR1 comumente ocorrem em neoplasias derivadas de tecidos normais provenientes de órgãos que intrinsecamente expressam a gp-P, como fígado, cólon, rim e pâncreas.

Contudo, níveis elevados de expressão do MDR1 são mais frequentemente observados em pacientes previamente tratados com fármacos citotóxicos, sugerindo que a expressão do MDR1 seja induzida por um processo seletivo que ocorre por repetidas exposições a esses fármacos.

A expressão da gp-P foi detectada em uma ampla gama de tumores humanos. Quatro padrões de expressão do gene MDR1 têm sido observados nos tumores humanos:

 

1. Expressão alta e frequente em tumores não tratados (p. ex., hepatoma e adenocarcinoma renal).

2. Expressão alta e ocasional em tumores não tratados (p. ex., linfomas não hodgkinianos e mieloma múltiplo).

3. Expressão baixa ou ausente em tumores não tratados (p. ex., neoplasias mamárias e melanoma).

4. Expressão alta do gene MDR1 nos tumores recidivantes após o tratamento (p. ex., leucemia linfoide crônica e feocromocitoma).

 

Estudos indicaram que a expressão da gp-P em neoplasias caninas e felinas é comparável àquela dos tumores no homem que expressam intrinsecamente a gp-P. Em cães, pode-se observar que os adenomas e adenocarcinomas colorretais, os adenomas adrenais, os hepatomas, os colangiocarcinomas, os carcinomas de células de transição, os adenocarcinomas de glândulas apócrinas, os carcinomas de células escamosas, os hemangiopericitomas, os adenocarcinomas mamários e os tumores de células basais apresentaram expressão alta e frequente; os linfomas, melanomas, liomiossarcomas, adenomas mamários e os carcinomas de glândula tireoide apresentaram expressão variável; e os plasmocitomas, histiocitomas, fibromas e fibrossarcomas e liomiomas não

expressaram a gp-P.2

Em felinos, os tumores de glândulas apócrinas, de ductos biliares, os carcinomas bronquioloalveolares, adenocarcinomas intestinais, meningiomas, tumores de tireoide, hemangiopericitomas, linfomas de células T e hemangiossarcomas apresentaram expressão da gp-P. Em contraste, os tumores de célula basal, os fibrossarcomas, o sarcoma histiocítico, o carcinoma hepatocelular e o carcinoma de células de

transição não apresentaram expressão.1

 

Proteína associada à resistência a múltiplas drogas Em 1992, Cole et al. descobriram um segundo tipo de proteína que atua como uma bomba de efluxo de fármacos em uma linhagem celular isolada de carcinoma de pequenas células de pulmão resistentes à doxorrubicina

(HL60/Adr).3 Essa proteína, denominada proteína associada à resistência a múltiplas drogas (MRP), é o segundo mecanismo mais frequente de RMD e pode ser responsável por esse fenômeno nos casos em que a gp-P não está envolvida.

Assim como a gp-P, a MRP pertence à superfamília dos transportadores ABC (ABCC). A subfamília MRP é composta de 30 membros, e nove destes estão primariamente envolvidos na RMD. A MRP1 (ABCC1) e a MRP2 (ABCC2) são os membros mais bem caracterizados.

A MRP1 é expressa em vários tecidos humanos, incluindo pulmões, testículos, rins, músculos cardíaco e esquelético, placenta e macrófagos. Ela também tem sido localizada predominantemente nas barreiras hematoteciduais, como na membrana basolateral do plexo coroide da barreira hematencefálica, no epitélio brônquico e na membrana apical dos sinciciotrofoblastos placentários. A MRP1 e a gp-P compartilham apenas de 15% de homologia, no entanto elas apresentam uma sobreposição significativa no perfil de resistência. A MRP1 é capaz de conferir resistência às antraciclinas, aos alcaloides da vinca, à epipodofilotoxina, às camptotecinas, ao metotrexato e à mitoxantrona, contudo, diferentemente da gp-P, a MRP1 não confere resistência aos taxóis, um importante componente do perfil de resistência da gp-P. Outra diferença entre elas é que a MRP1 atua como um transportador de substratos aniônicos lipofílicos que transportam conjugados de glutationa, glucuronídios, sais biliares dianiônicos e conjugados de sulfato. Recentemente, a resistência mediada pela MRP1 foi capaz de interferir na ação de fármacos inibidores de tirosinoquinase, como o imatinibe.

A expressão da MRP1 foi detectada em uma variedade de tumores humanos, como os carcinomas pulmonares, mamários, vesical, gástrico, prostático e de tireoide. Também foram detectados em neuroblastoma, glioma, retinoblastoma, melanoma e em blastos de pacientes com leucemia mieloide aguda. Nos carcinomas mamários, a expressão da MRP1 está relacionada com um menor tempo até a recidiva tumoral. Além disso, foi encontrada uma correlação negativa entre a expressão da MRP1 e a resposta ao tratamento.

Existem poucos estudos envolvendo a MRP1 em Medicina Veterinária. Sabe-se que a MRP1 canina (canMRP1) apresenta 92% de identidade com a MRP1 humana e 88% com a MRP1 murina. A canMRP1 confere resistência ao etoposídeo e à vincristina, entretanto falhou em conferir resistência à doxorrubicina e à mitoxantrona. Quanto a sua distribuição nos tecidos caninos, a canMRP1 foi detectada em maiores níveis no cérebro, nos rins, no fígado e nos testículos, enquanto nos pulmões e intestinos esses níveis foram baixos.

A MRP2 compartilha 49% de homologia com a MRP1, mas tem um padrão de expressão diferente. Enquanto a MRP1 tem uma distribuição ampla entre os tecidos, a MRP2 é principalmente expressa nas membranas na porção apical (canicular) das membranas plasmáticas dos hepatócitos, do intestino delgado e dos túbulos proximais renais. Alguns trabalhos demonstraram que a MRP2 é capaz de conferir resistência aos agentes antineoplásicos, como o metotrexato, a cisplatina, o etoposídeo, a doxorrubicina, a epirrubicina, o paclitaxel, o docetaxel, a vincristina, a vimblastina e a mitoxantrona. A expressão da MRP2 tem sido relatada em várias linhagens celulares tumorais de pulmão, estômago, rins e colorretais.

A canMRP2 apresenta 83,4% de homologia em relação à humana e está expressa em altos níveis em rins, no fígado, seguida por duodeno jejuno e íleo. Essa proteína não pode ser detectada no cólon, nos pulmões, no cérebro e nos testículos.

A MRP3 (ABCC3) apresenta 58% de homologia com a MRP1 e é encontrada nas glândulas adrenais, nos rins, no intestino delgado, no colón, no pâncreas e na vesícula biliar. A sua expressão é menor nos pulmões, no baço, no estômago e nas tonsilas. Embora tenha a maior homologia com a MRP1 entre as MRP conhecidas, a MRP3 apresenta menor afinidade aos conjugados com a glutationa. O perfil de resistência aos fármacos inclui o metotrexato, o etoposídeo e o teniposídeo. Em humanos, o aumento da expressão da MRP3 foi relatado em carcinomas hepatocelulares, tumores ovarianos primários e leucemia linfoblástica aguda em adultos.

O quarto membro da superfamília MRP é a MRP4 (ABCC4). A MRP4 tem duas localizações nos tecidos normais humanos: apical nas células dos túbulos proximais renais e no lado luminal do endotélio capilar cerebral; e nas membranas basolaterais das células tubuloacinares prostáticas, nos hepatócitos e no epitélio do plexo coroide. A MRP4 pode transportar para fora das células vários compostos aniônicos orgânicos com seus metabólitos, conferindo, desse modo, resistência a vários compostos citotóxicos, e, em troca, protegendo os tecidos fundamentais contra eles. O perfil de resistência da MRP4 inclui a 6-mercaptopurina, a 6-tioguanina, o metotrexato, o irinotecano e a topotecana.

A MRP5 (ABCC5) é amplamente distribuída em tecidos humanos, sendo encontrada em níveis mais altos no coração, no cérebro, nos pulmões e no sistema musculoesquelético. Sua expressão nos capilares endoteliais de vários tecidos como o coração e o cérebro tem função protetora e de barreira. O perfil de resistência é semelhante ao da MRP4, incluindo a 6-mercaptopurina, a 6-tioguanina, a 5-fluoruracila e o metotrexato.

A MRP6 (ABCC6) apresenta 41% de semelhança estrutural com a MRP1. Contudo, a sua distribuição nos tecidos é restrita ao fígado e aos rins. Em linhagens de células de ovário de hamster transfectadas pelo MRP6 foi demonstrado que a proteína pode atuar como uma bomba de efluxo capaz de conferir níveis baixos de resistência ao etoposídeo e ao teniposídeo. Além disso, estudos sugerem que a MRP6 confere níveis baixos de resistência às antraciclinas e à cisplatina.

Nos tecidos humanos, a MRP7 (ABCC10) é encontrada em níveis mais altos no pâncreas, seguido pelo fígado, pela placenta, por pulmões, rins, cérebro, ovários, linfonodos, baço, coração, leucócitos e cólon. Semelhantemente às outras MRP, a MRP7 também pode conferir resistência a vários fármacos antineoplásicos naturais. Um nível alto de resistência foi observado contra o docetaxel; por sua vez, contra o paclitaxel o nível de resistência foi moderado. A MRP7 também pode conferir resistência contra a vincristina e a vimblastina. A expressão da MRP7 em tumores humanos foi relatada em adenocarcinoma salivar, câncer de células não pequenas pulmonares, tumores de mama, cólon, próstata, ovário e de pâncreas.

O MRP8 (ABCC11) é um dos mais novos membros encontrados da família MRP. Ele é amplamente expresso em tecidos humanos, com os níveis mais altos encontrados no fígado, no cérebro, na placenta, nas mamas e nos testículos. O perfil de resistência ainda não está bem estabelecido, porém sabe-se que a MRP8 pode conferir resistência contra o 5-fluoruracila. Clinicamente, a MRP8 é expressa em altos níveis nos tumores mamários humanos, e sua expressão foi associada a uma menor sobrevida em pacientes com leucemias mieloides agudas.

O membro da família MRP mais recentemente clonado foi a MRP9 (ABCC12). Em humanos, ela foi encontrada no câncer de mama, em tecido mamário normal, em testículos, no cérebro, no sistema musculoesquelético e em ovários. Ainda não há estudos sobre o perfil de substratos da MRP9, e sua participação na resistência contra os fármacos antineoplásicos não foi caracterizada.

 

Proteína de resistência ao câncer de mama A proteína de resistência ao câncer de mama (breast cancer related protein – BCRP/ABCG2) também faz parte da superfamília de transportadores ABC e é codificada pelo gene ABCG2. Em tecidos humanos normais, a BCRP apresenta níveis altos na placenta, na barreira hematencefálica, em glândulas mamárias em lactação, no intestino delgado, nos rins, nos testículos e no fígado. Os substratos da BCRP incluem o metotrexato, a mitoxantrona, a doxorrubicina, a epirrubicina, a daunorrubicina, os inibidores de tirosinoquinase e a topotecana. A BCRP foi detectada em vários tipos de neoplasias humanas, desde tumores hematopoéticos, como as leucemias, até tumores sólidos, tumores de cólon, esôfago, endométrio, mama, pâncreas e pulmão. Nestes, a sua expressão foi correlacionada com evolução ruim.

 

Proteína relacionada com a resistência no pulmão A proteína relacionada com a resistência no pulmão (lung resistance related protein – LRP) foi identificada em 1993, em células tumorais de neoplasia de pulmão resistentes a múltiplas drogas, por mecanismos que não foram mediados pela gp-P. Ela apresenta peso molecular de 110 kd e é a maior proteína estrutural que compõe as partículas de ribonucleoproteínas citoplasmáticas denominadas “vaults”.

O termo “vault” foi empregado para descrever sua morfologia, que consiste em múltiplos arcos semelhantes a abóbadas de uma catedral. “Vaults” são organelas que estão presentes no citoplasma, porém uma pequena fração está localizada na membrana nuclear e nos poros nucleares. Sua função é regular o transporte de substâncias entre o núcleo e o citoplasma. Isso sugere que a LRP possa estar envolvida no transporte de agentes citotóxicos para fora do meio intracelular.

Por meio da imuno-histoquímica, a LRP foi detectada em vários tecidos normais humanos. Uma alta expressão foi encontrada nos epitélios dos brônquios, no trato digestivo, assim como nos queratinócitos, no córtex da

adrenal e nos macrófagos.4 Em ratos, a LRP foi detectada no epitélio intestinal, e em coelhos, nos macrófagos alveolares. Em tecidos fetais felinos, um estudo realizado detectou uma expressão relativamente alta da LRP, por meio de reação em cadeia pela polimerase em tempo real (RT-PCR), em pulmão, no jejuno e no cólon. Entretanto, no coração e no

cérebro a expressão foi baixa.5

A LRP tem sido detectada em várias linhagens de células neoplásicas e em espécimes clínicos de muitos tumores humanos. Em um painel de linhagens celulares de neoplasias humanas extraídas de neoplasias de cólon, pulmão, rim, mama, ovário e cérebro e também de melanomas e leucemias, a expressão da LRP foi encontrada em uma frequência de 78%. A expressão da LRP também pôde ser detectada em espécimes clínicos de pacientes humanos com leucemia mieloide aguda, carcinoma ovariano, mieloma, fibrossarcoma, linfomas, osteossarcoma, neuroblastoma, melanoma e em neoplasias de epitélio brônquico, ceco, cólon e reto.

Em algumas neoplasias humanas, a expressão da LRP está relacionada com a resistência a agentes alquilantes como o melfalana. Além deste, observaram-se resistência à doxorrubicina, à vincristina, à carboplatina, à cisplatina, ao etoposídeo, ao paclitaxel e à daunorrubicina.

 

■ Por ativação do sistema glutationa/glutationa-s-

transferase

O sistema glutationa (GSH)/glutationa-S-transferase (GST) apresenta um importante papel na desintoxicação de fármacos citotóxicos e citostáticos. A GSH é um importante antioxidante intracelular e é o tiol não proteico mais abundante presente na célula. Ela pode interagir por meio do grupo tiol com sítios reativos de uma droga espontaneamente ou catalisada pela GST, resultando em conjugação. O conjugado resultante é menos tóxico, mais hidrossolúvel e, portanto, mais facilmente excretado da célula. O transporte para fora das células ocorre por meio da ação de proteínas transportadoras denominadas GS-X (incluindo a MRP1).

Em mamíferos, as GST fazem parte da família de multigenes da fase II do metabolismo. Localizam-se preferencialmente no citoplasma, entretanto também apresentam atividade na membrana mitocondrial, nos microssomos e no núcleo. A expressão das GST pode variar de acordo com o sexo, a idade, a espécie, o tecido e o tipo de neoplasia. A família das GST consiste em sete isoenzimas designadas alfa, mu, pi, theta, sigma, kappa e zeta. Entre elas, a GSTpi é a que tem sido mais frequentemente detectada em tumores humanos e possivelmente a sua superexpressão possa resultar em um aumento na rapidez na desintoxicação e, assim, diminuir a efetividade do tratamento.

As evidências primárias do papel da GSH/GST na resistência aos fármacos em seres humanos provêm de três fontes:

 

• Análise das células tumorais de pacientes antes e após o início da resistência clínica a drogas, em que se observa um aumento da GSH/GST após o desenvolvimento da resistência

• Um aumento da GSH/GST após a seleção de linhagens celulares extraídas de tumores com resistência adquirida a agentes antineoplásicos • Análise da expressão de resistência após a transfecção de genes particulares da GST em linhagens celulares.

 

A característica comum dos substratos catalisados pela GST e conjugados com a GSH é a sua propriedade eletrofílica. Trata-se de uma característica primária da maioria dos agentes alquilantes, e muitos estudos têm enfocado esta classe de fármacos antineoplásicos como substratos para as GST. Em geral, as isoenzimas alfa e mu estão associadas à desintoxicação da mostarda nitrogenada e nitrosureia, respectivamente. O aumento da expressão da isoenzima pi tem sido associado à resistência ao melfalana, à clorambucila e à ciclofosfamida. Outros substratos para GST incluem a doxorrubicina, a cisplatina, a mitomicina C e a vincristina.

Em humanos, muitos tumores de origem leucêmica, ovariana, mamária, pulmonar, vesical, renal, prostática, nervosa e de cólon demonstraram aumentos na expressão de GSH/GST quando comparados com tecidos normais. Como citado anteriormente, a GSTpi é a isoenzima mais predominantemente detectada nos espécimes tumorais e nas linhagens celulares. Aparentemente, a GSTpi está envolvida na regulação da proliferação celular por inibir os efeitos das espécies reativas de oxigênio (ERO) sobre a divisão celular. No caso de células neoplásicas resistentes à doxorrubicina, sugere-se que a superexpressão da GSTpi possa influenciar no status do redox celular e suprimir a conversão da doxorrubicina em radicais livres, semiquinona e na subsequente produção de radicais ânions superóxido e peróxido. Portanto, a superexpressão da GSTpi também pode estar associada ao desenvolvimento da resistência aos fármacos não apenas por aumentar a desintoxicação dos agentes antineoplásicos, mas também em virtude de uma supressão do ERO celular que pode induzir a apoptose.

 

■ Por alteração do alvo da droga As enzimas topoisomerases I e II são essenciais no funcionamento normal de qualquer célula. São elas que mantêm a integridade do DNA, reparando-o quando danificado. Nos organismos mais simples, quando em ação reparadora, as topoisomerases I ligam-se a uma ou duas fitas do DNA, mas introduzem um só corte em uma das fitas do DNA. Organismos mais complexos contêm, além da topoisomerase I, a topoisomerase II, que se liga com duas fitas do DNA e induz dois cortes durante o processo de reparação. As enzimas topos I e II têm funções recíprocas reversas, ou seja, uma é expressa quando a outra é inibida. Ambas cortam o DNA por ataque a pontos de unidade tirosínica na ligação fosfodiéster do DNA e são críticas para o bom funcionamento celular. Qualquer alteração no balanço entre essas enzimas é suficiente para levar à apoptose.

As topoisomerases são alvos de importantes agentes antineoplásicos. A topoisomerase I é um alvo muito específico da camptotecina de seus análogos, enquanto as epipodofilotoxinas, as aminoacridinas e as antraciclinas são inibidores específicos da topoisomerase II. Os inibidores da topoisomerase estabilizam o complexo enzima-DNA após o estágio do corte e antes de o DNA ser recomposto. Portanto, o DNA e a enzima não podem prosseguir com suas funções normais e, consequentemente, isso leva a célula à morte.

Nas linhagens celulares selecionadas para resistência aos fármacos inibidores da topoisomerase II, a atividade ou a qualidade dessas enzimas estão reduzidas. Mutações de ponto no gene que codifica a topoisomerase II ou deleções foram encontradas. Provavelmente, isso seja a causa de alguns casos de resistência mediada pela topoisomerase II. Todavia, a importância clínica desse tipo de RMD ainda não está clara. Isso se deve ao fato de muitos inibidores da topoisomerase (p. ex., etoposídeo, doxorrubicina, daunorrubicina, entre outros) também serem substratos para a glicoproteína-P. Portanto, é evidente que esse tipo de RMD ocasionalmente ocorra nas células em associação com outros mecanismos de resistência.

 

■ Por alterações nos mecanismos de reparação celular A citotoxicidade da maioria dos fármacos quimioterápicos está diretamente relacionada com a habilidade de causar dano no DNA. Existem várias respostas celulares possíveis para tais insultos potencialmente citotóxicos, incluindo indução da apoptose, modulação da progressão do ciclo celular e tolerância ao dano e iniciação do reparo do DNA. Coletivamente, essas respostas determinam se a célula sobreviverá, possivelmente com um genoma mutante, ou se iniciará o mecanismo de apoptose. Respostas que promovem a sobrevivência celular têm um impacto negativo sobre a eficácia do tratamento e levam à resistência à terapia.

Muitas drogas antineoplásicas interagem como o DNA na posição O6 da

guanina para formar adutos de DNA extremamente potentes. A O6-

alquilguanina-DNA alquiltransferase (O6-AT) é uma enzima reparadora do DNA codificada pelo gene MGMT que tem sido recentemente associada a

mecanismo de resistência aos agentes antineoplásicos. Altos níveis de O6-AT foram associados à resistência à dacarbazina, à estreptozotocina e às nitrosoureias, provavelmente porque essa enzima repara o dano no DNA induzido pela quimioterapia. Mudanças na quantidade de proteínas de reconhecimento e reparo a lesões ao DNA (ERCC1, ERCC2 e ERCC3/XPB) foram detectadas em culturas de células com sensibilidade alterada à cisplatina. Algumas dessas células são resistentes a vários fármacos, entretanto o número de células que exibem resistência cruzada não é tão grande como em células com expressão de MDR/gp-P.

 

■ Por alterações de genes e proteínas envolvidas no controle

da apoptose

A maioria dos agentes antineoplásicos causa direta ou indiretamente morte das células neoplásicas por meio da indução da apoptose. Esses agentes incluem os inibidores da topoisomerase II, análogos de nucleosídios, como a citosina arabinosídio e a fludarabina, os agentes alquilantes, a vimblastina, a vincristina e a cisplatina.

Uma célula pode entrar em apoptose ou continuar a progredir no ciclo celular após algum insulto, e isso depende da interação de um grupo complexo de proteínas e genes que interagem para regular a progressão do ciclo celular. A resistência aos fármacos pode surgir se as células alterarem a expressão das proteínas que regulam a propagação dos sinais que resultam do insulto celular, como a quimioterapia, para proteger contra a apoptose. Embora muitos detalhes sobre a via apoptótica não estejam completamente elucidados, várias proteínas são conhecidas por serem importantes reguladores desse processo.

 

Proteína p53

O gene p53 codifica uma fosfoproteína com 393 aminoácidos, a qual é capaz de se ligar com sequências específicas de DNA, atuando como um fator de transcrição. Em células normais, uma variedade de danos ao DNA, como exposição à luz ultravioleta, radiações ionizantes e fármacos radiomiméticos, leva a um aumento da proteína p53 em decorrência da estabilização pós-transducional. O consequente aumento da proteína p53 leva a um bloqueio do ciclo celular na fase G1, permitindo o reparo dos danos induzidos ou espontâneos que ocorreram na fase de replicação do DNA. Caso o reparo do DNA não seja concretizado, pode ocorrer a morte celular programada (apoptose). Assim, considera-se que o gene p53 garante a integridade genômica. Entretanto, o gene p53 não estabelece diretamente a integridade do genoma, mas atua como um fator de transcrição para aumentar a expressão de outros genes (WAF-1, GADD45, MDM2, p21 e ciclina G). A falta de p53 funcional em células tumorais é considerada responsável pela instabilidade genômica destas células, que se manifesta por aneuploidias e pela habilidade de produzir amplificação gênica.

O tipo selvagem da p53 é uma fosfoproteína intranuclear de 53 kDa, que regula a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular eucarioto. A p53 funciona como um transativador da transcrição genética, promovendo ou reprimindo a síntese de mRNA. Ela representa uma garantia de manutenção da fidelidade genômica, podendo suspender o ciclo celular para permitir que o reparo do DNA ocorra antes da nova replicação. Quando o reparo do DNA está concluído, a célula retorna à fase G1, continuando com a replicação e a síntese do DNA.

Mutações no gene que codifica o tipo selvagem da proteína p53 têm sido observadas em uma variedade de tumores humanos e de animais. Atualmente, é amplamente aceito que essas mutações de ponto no gene p53 ocorrem principalmente dentro do éxon 5 a 8, causando um distúrbio na regulação normal da célula. A atividade biológica da proteína mutante p53 é alterada, o que pode causar um decréscimo ou a completa perda de sua função. Muitas formas mutantes da proteína p53 são oncogênicas e estimulam a divisão celular sem reparar as mutações de ponto do DNA durante a sua replicação.

A maioria dos agentes antineoplásicos é genotóxica, e nesse sentido a p53 tem um papel importante na resposta ao dano do DNA induzido por fármacos quimioterápicos. A interrupção do ciclo celular na fase G1 permite o reparo do DNA antes da fase S. Contudo, se o reparo perfeito for impossível, a p53 então aciona a morte celular programada. Nas células tumorais com a p53 mutante, a perda da função dessa proteína e, subsequentemente, dos eventos celulares descritos anteriormente resultam em resistência à quimioterapia. Entretanto, em algumas células, a perda do ponto de controle do G1 não influencia a quimiossensibilidade, já que o do G2 parece ser um determinante mais importante da sensibilidade. As diferenças descritas provavelmente indicam que o tipo da resposta é um fenômeno específico do tipo celular.

Lowe et al. foram os primeiros a perceber a importância da p53 na morte celular induzida pela quimioterapia ao detectarem que os fibroblastos embrionários de camundongos deficientes de p53 foram mais resistentes que suas contrapartes, que conservavam esta proteína, em induzir apoptose

pelos agentes quimioterápicos.6 Estudos posteriores em camundongos e humanos confirmaram que a p53 é um mediador crítico da morte celular induzida por muitos dos fármacos quimioterápicos usados comumente. Grande parte dos agentes que lesam o DNA induz o acúmulo e a ativação da p53, geralmente como resultado de modificações pós-transducionais, como a fosforilação. Clinicamente, a resposta do tumor à quimioterapia pode ser também correlacionada com a condição da p53.

 

Proteínas da família BCL-2

O BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma 2) é um oncogene que contribui para a ocorrência neoplásica em virtude da inibição da apoptose. O BCL-2 é membro de uma grande família de genes que se divide em dois grupos principais. O primeiro grupo consiste em proteínas antiapoptóticas que compartilham de uma alta homologia estrutural e funcional com o gene BCL-2 (Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1), enquanto o segundo inclui proteínas que compartilham de uma menor homologia com a BCL-2 e exibe atividades pró-apoptóticas (Bax, Bak, Bad, Bid).

A desregulação dos membros da família BCL-2 tem sido fortemente associada à tumorigênese. Todos os homólogos BCL-2 parecem atuar como oncoproteínas, e as proteínas pró-apoptóticas Bh3 e Bax podem agir como supressores de tumores. A superexpressão do gene BCL-2, detectada principalmente por métodos imuno-histoquímicos, ocorre em diferentes tipos de neoplasias humanas, incluindo as de próstata, cólon, pulmão, mama, estômago, rins, leucemias e linfoma não Hodgkin. Em alguns desses tipos de neoplasias, sua upregulation pode ser utilizada como um marcador prognóstico. Na maioria dos casos, a superexpressão do gene BCL-2 é associada à resistência à quimioterapia e à radioterapia. A alta expressão da proteína Bcl-2 nas células da leucemia mieloide aguda e nos linfomas de células B indica uma pobre resposta aos agentes quimioterápicos em relação ao desenvolvimento e ao tempo de sobrevida.

Muitos fármacos quimioterápicos foram designados para combater a progressão tumoral por meio da downregulation da produção da proteína Bcl-2 pelas células tumorais. O ácido ocadáico e o ácido retinoico, usados no tratamento das leucemias, provocam uma downregulation do gene BCL-2 e melhoram a resposta à quimioterapia. Entretanto, o pré-tratamento da leucemia mieloide aguda com dexametasona levou à downregulation do BCL-2, ainda que sem aumentar a sensibilização à apoptose.

A proteína Bcl-XL é outra proteína antiapoptótica que variavelmente está envolvida em neoplasias. É amplamente expressa em neoplasias humanas, como as de cólon, pâncreas, fígado, rim, ovário, mama e linfomas. Nas células de carcinomas mamários, a concentração excessiva da Bcl-X L e da Bcl-2 inibe a ação protetora do fator de necrose tumoral (TNF, tumor necrosis factor).

A proteína Bax é uma supressora tumoral, o que indica que em células saudáveis sua função provoca uma morte por apoptose de células excessivamente danificadas, contribuindo para a homeostase do tecido. Entretanto, em certas malignidades, a concentração dessa proteína nas células neoplásicas está reduzida. Na maioria dos casos de neoplasia, as concentrações reduzidas da Bax são acompanhadas por mutações no gene p53. Uma mutação de sentido errado no códon 273 do gene p53 pode reduzir drasticamente os níveis da Bax na célula.

Em Medicina Veterinária, a proteína Bcl-2 foi detectada por meio da técnica de imuno-histoquímica em uma linhagem celular renal em tecidos felinos fetais, neonatais, adultos e neoplásicos. A distribuição da Bcl-2 nos tecidos sadios foi semelhante ao observado em tecidos humanos. Nos tecidos neoplásicos estudados, a Bcl-2 foi expressa quase uniformemente nos tumores cutâneos de células basais, nos adenomas de tireoide, nos carcinomas mamários e em 50% dos linfomas examinados. Os autores sugerem que a Bcl-2 pode ter um papel no bloqueio da morte celular por apoptose em uma ampla gama de tecidos felinos normais, enquanto a desregulação da Bcl-2 pode prolongar a existência ou conferir resistência de

certos tumores felinos à quimioterapia.7

Em outro estudo, realizado pelos mesmos autores, ainda com a espécie felina, a expressão das proteínas Bax e Bcl-2 foi avaliada em pele sadia, em 24 espécimes de tumores benignos cutâneos de células basais e em 14 espécimes de carcinomas de células escamosas. Nesse estudo, a Bcl-2 foi detectada no epitélio basal normal e em 23 de 24 tumores de células basais. A Bax foi detectada tanto no epitélio basal como no suprabasal, mas foi observada em apenas 7 dos 24 espécimes. Nos espécimes que coexpressaram as duas proteínas, a proporção Bax:Bcl-2 foi 0 ou menor que 1 em 21 espécimes, 1 em um espécime e maior que 1 em dois espécimes. Não foi detectada a expressão das duas proteínas nos espécimes de

carcinomas de células escamosas.8

 

■ Em linfomas caninos e felinos A quimioterapia é a principal modalidade terapêutica empregada no tratamento dos linfomas caninos e felinos. No entanto, a resistência aos fármacos é a principal causa de falha na quimioterapia de cães e gatos com linfoma. Por esse motivo, nos últimos anos, a maior parte dos estudos envolvendo a RMD em cães e gatos objetivou a avaliação do papel dos mecanismos de resistência aos fármacos antineoplásicos neste neoplasma.

Os estudos que visaram a avaliar a expressão gp-P/MDR1 nos linfomas caninos no momento do diagnóstico (antes do início do tratamento) mostraram que o nível de expressão é variável (2,7 a 93,3%) e dependeu do

método de detecção e da metodologia empregados.9-12 Quando se comparou a frequência de marcações positivas para a gp-P no momento do diagnóstico com o momento da recidiva tumoral ou na necropsia, constatou-se que nestes dois últimos momentos houve um aumento considerável. Também se observou que a frequência de marcações positivas antes do início da quimioterapia foi inversamente correlacionada com o tempo de remissão e sobrevida, enquanto a frequência de marcação positiva para gp-P na recidiva foi inversamente correlacionada com o tempo da recidiva até a morte. Portanto, os pacientes com alta frequência de imunomarcação no pré-tratamento tiveram tempos de remissão e de sobrevida significativamente menores, e também aqueles com alta frequência de marcação para a gp-P na recidiva tiveram o tempo entre a

recidiva e a morte significativamente diminuído.11 Adicionalmente, em outro estudo, verificou-se que a intensidade forte de marcação no momento do diagnóstico foi considerada um fator preditivo negativo independente

para sobrevida.10

A pesquisa por associação da expressão da gp-P com outros índices clínicos associados ao prognóstico, como o sexo, o estadiamento, a hipercalcemia, o tipo de tratamento, o envolvimento do mediastino cranial e

imunofenótipo, falhou em mostrar diferença significativa.10 A expressão da gp-P também não pareceu ser um bom marcador de prognóstico nos casos

de linfomas indolentes.13

O potencial papel da gp-P em causar RMD no linfoma pode ser mostrado em um estudo in vitro que utilizou uma linhagem celular de linfoma canino de células B (GL-1). Essa linhagem celular foi submetida à exposição contínua com doxorrubicina, a qual é conhecida por ser indutora de RMD. A partir disso, se obteviveram três sublinhagens que mostraram forte resistência à própria doxorrubicina e ainda mais intensa à vincristina, mas não à cisplatina. Isso pode ser explicado em razão de a cisplatina não ser transportada pela gp-P. Nas sublinhagens inicialmente resistentes à doxorrubicina e à vincristina, houve reversão da resistência com a exposição dessas células ao verapamil, um conhecido inibidor da gp-P. Além disso, utilizando a técnica de western-blot, a gp-P foi detectada nas

sublinhagens resistentes e ausente na linhagem GL-1.14

Mais recentemente, a baixa expressão do gene MDR1, determinada pela técnica de PCR em tempo real no sangue de cães com linfoma, foi associada a efeitos adversos mais graves da quimioterapia quando comparados com os dos cães que apresentaram a expressão mais alta do MDR1. Além disso, em análise longitudinal da expressão do gene MDR1 nesses cães, durante o tratamento quimioterápico, concluiu-se que quatro cães que apresentaram aumento de duas ou mais vezes na expressão do

gene tiveram progressão da doença.15

Ainda são escassos os estudos envolvendo a expressão da gp-P/MDR1 em linfomas felinos. As primeiras evidências da participação da gp-P em conferir resistência a fármacos antineoplásicos em células de linfomas felinos foram feitas empregando linhagem celular de linfoma (FT-1) e a sublinhagem resistente à doxorrubicina (FT-1/ADM). Observou-se que a sublinhagem FT-1/ADM foi mais resistente à vincristina que a FT-1. Além disso, o gene MDR1 e a gp-P foram detectados na FT-1/ADM, e não na FT-

1, a qual permaneceu suscetível à doxorrubicina.16

Posteriormente, a expressão da gp-P foi avaliada em espécimes clínicos de 63 linfomas felinos, pela técnica de imuno-histoquímica, no momento do diagnóstico. Além disso, buscou-se verificar a hipótese de que a maior expressão da gp-P no momento do diagnóstico estaria associada a menores tempos de remissão e de sobrevida, no entanto isso não foi observado nesse

estudo com a técnica empregada.17

A coexpressão de diferentes proteínas associadas a RMD foi avaliada no linfoma canino, no momento do diagnóstico, pela técnica de imuno-histoquímica. A porcentagem de espécimes positivos para a gp-P, MRP1,

GSTpi e p53 (Figura 19.2) foram 37,5%, 25%, 56,25% e 18,75%, respectivamente. A coexpressão de quatro e três marcadores foi observada

em 12,5% espécimes e de dois deles em 37,5%.12,18

Análise quantitativa do mRNA dos genes MDR1, MRP1, LRP, ABCG2, p53, p21, Bcl-2, CD40L, GSTα e MGMT foi realizada em cães com linfomas multicêntricos de alto grau para avaliar a associação com a resistência aos fármacos. Todos os cães foram submetidos ao protocolo da Universidade Wisconsin-Madison modificado e divididos em dois grupos de acordo com a resposta clínica à quimioterapia – sensível e resistente à quimioterapia. Não foi observada diferença significativa da expressão dos genes entre os grupos. Entretanto, quatro cães do grupo resistente à quimioterapia apresentaram aumento na expressão do gene MDR1 de 4 a 33 vezes.

Em outro estudo, observou-se que 80% e 22% dos linfomas multicêntricos caninos não tratados apresentaram expressão da gp-P e da p53, respectivamente, pela técnica de imuno-histoquímica. Apenas a expressão da p53 foi estatisticamente correlacionada com menor

sobrevida.19

 

■ Em neoplasias mamárias caninas A expressão da gp-P nos carcinomas mamários, detectada por meio da técnica de imuno-histoquímica, foi significativamente maior que a observada em adenomas mamários, hiperplasia mamária e tecido mamário

normal.20

Entre os subtipos histológicos, o carcinoma tubulopapilar apresentou

maior expressão da gp-P.20,21 O aumento da expressão da gp-P no momento do diagnóstico também pôde ser correlacionado com a recorrência tumoral após a retirada cirúrgica e foi inversamente correlacionado com o tempo de

sobrevida.21

 

Figura 19.2 Fotomicrografias de linfomas caninos submetidos à imuno-histoquímica aos anticorpos primários antiglicoproteína-P (A), anti-MRP1 (B), antiglutationa S-transferase pi (C) e anti-p53 (D), pelo método avidina-biotina-peroxidase (ABC). Aumento: 400 ×. Marcações de coloração castanha indicam imunorreatividade positiva. Contracoloração: hematoxilina de Harris.

 

Ao contrário do observado nos carcinomas mamários que superexpressam a gp-P, a superexpressão da glutationa (GSH) foi observada nas cadelas que tiveram maior sobrevida e que não tinham metástase. In vitro, células neoplásicas extraídas destes carcinomas mamários foram cultivadas e tratadas com doxorrubicina. As células expostas apresentaram menor expressão do gene GSH em comparação ao grupo-controle, sem

tratamento.22

A expressão da gp-P, e também da MRP1, GSTpi e p53 (Figura 19.3), foi detectada em carcinomas mamários em 50%, 78,6%, 92,85% e 92,85% dos espécimes, respectivamente, pela técnica de imuno-histoquímica. A coexpressão dos quatro marcadores pode ser observada em 42,85% dos

espécimes estudados.12,18 Além disso, em outro estudo, foi concluído que as

expressões da gp-P e da p53 estão correlacionadas.21

Evidências de que mais de um mecanismo de RMD possa atuar nos carcinomas mamários também foram observadas em um estudo que detectou a expressão dos genes MDR1 (92,2%), BCRP (100%), MRP1 (100%), MRP3 (96,1%), MRP5 (85,4%), MRP6 (64,1%) e MRP7 (97,1%) em 103 espécimes, pela RT-PCR. Mais da metade dos espécimes tumorais

(56,1%) expressou todas as proteínas transportadoras ABC avaliadas.23

A avaliação funcional das proteínas mostrou que células transfectadas com o gene BCRP canino apresentaram 5,4 vezes mais resistência à doxorrubicina, no entanto a sobrevivência das células na presença do

metotrexato não foi afetada pela BCRP.23 Em outro estudo, foi constatado aumento da expressão do MDR1 nas células neoplásicas mamárias após a exposição à vimblastina e à cisplatina. O tratamento com a cisplatina também provocou aumento da expressão da BCRP, MRP1 e MRP3;

contudo, a ciclofosfamida causou aumento somente do BCRP.24

 

■ Em mastocitomas caninos Nos mastocitomas, pode-se observar um número maior de espécimes positivos para a gp-P nos mastocitomas grau I do que nos de grau III, indicando que os tumores mais bem diferenciados expressam mais frequentemente a gp-P que os tumores indiferenciados. Esses resultados poderiam mostrar, teoricamente, que os mastocitomas grau III responderiam melhor à quimioterapia, entretanto sabe-se que os mastocitomas grau III apresentam resposta variável à quimioterapia com uma combinação de

agentes.25

 

Figura 19.3 Fotomicrografias de carcinomas mamários caninos submetidos à imuno-histoquímica aos anticorpos primários antiglicoproteína-P (A), anti-MRP1 (B), antiglutationa S-transferase pi (C) e anti-p53 (D), pelo método avidina-biotina-peroxidase (ABC). Aumento: 400 ×. Marcações de coloração castanha indicam imunorreatividade positiva. Contracoloração: hematoxilina de Harris.

A expressão do MDR1 e da gp-P foi avaliada por RT-PCR e western-blot, respectivamente, em três linhagens celulares de mastocitomas provenientes da pele, da mucosa oral e gastrintestinal. A expressão do MDR1 e da gp-P foi observada somente nas linhagens provenientes de mastocitomas na mucosa oral e gastrintestinal. A análise funcional da gp-P mostrou que nessas mesmas linhagens houve maior acúmulo do corante rodamina 123 (substrato específico da gp-P), quando essas foram expostas ao verapamil,

um inibidor da gp-P.26

O tratamento de mastocitomas cutâneos com prednisolona resultou em redução significativa da dimensão dos tumores por um curto período, com a maioria dos pacientes (81%) apresentando resposta máxima com 21 dias. A expressão da gp-P foi avaliada nesses pacientes antes e após o tratamento com prednisolona. A porcentagem de espécimes positivos para gp-P foi considerada alta tanto pré (87,5%) como pós-tratamento (85,7%). Isso pode indicar que os mastocitomas já apresentam algum grau de resistência antes do tratamento com prednisolona, no entanto este fármaco não parece

interferir na expressão da gp-P durante o tratamento.27

Jaffe et al. verificaram que mastocitomas cutâneos caninos de grau III apresentaram uma porcentagem de células marcadas com o p53 significativamente maior do que os tumores de graus I e II. Nestes últimos, não foram observadas diferenças significativas entre eles, impossibilitando a distinção por essa técnica. Embora os tumores de grau III tenham apresentado uma porcentagem significativamente maior de células marcadas, não foi possível estabelecer uma associação entre o grau histopatológico e o tempo de sobrevivência ou o tempo de recorrência do

tumor.28

Por sua vez, Ginn et al. não conseguiram estabelecer a relação entre a expressão da p53 e o prognóstico em cães portadores de mastocitoma cutâneo canino. Além disso, não foram verificadas diferenças significativas entre o grau histológico do tumor e a imunorreatividade do p53. Os autores sugerem que a ausência de correlação entre a imunorreatividade para p53 e o comportamento biológico do tumor decorreu da falta de especificidade do

p53 para o gene supressor mutante.29

Um estudo encontrou que 50%, 56,25%, 93,75% e 93,75% dos mastocitomas cutâneos expressaram a gp-P, GSTpi, MRP1 e p53,

respectivamente (Figura 19.4). No entanto, a expressão dos quatro

marcadores foi observada em 31,25% dos espécimes.18 Em outro estudo, foi

possível detectar a coexpressão da MRP/gp-P em 26% dos espécimes.25

 

■ Em osteossarcomas caninos Mealey et al. investigaram a resistência a drogas no osteossarcoma canino, utilizando uma linhagem celular (OS2.4) derivada de um osteossarcoma primário, histologicamente confirmado, e uma sublinhagem resistente a múltiplas drogas (OS2.4/doxo). Nas células resistentes, foi encontrada alta expressão da gp-P, o que pode sugerir que a resistência a múltiplas drogas induzida pela gp-P pode ser importante na falha do tratamento

quimioterápico do osteossarcoma canino.30

Posteriormente, as expressões da p53 e da gp-P foram avaliadas em espécimes clínicos de osteossarcoma canino, pela técnica de imuno-histoquímica. Imunorreatividade para a p53 foi observada em 33% dos espécimes e para a gp-P em 18%. Correlação positiva significativa foi encontrada entre a expressão da p53 e da gp-P. A imunomarcação dupla revelou que em dez espécimes a expressão da p53 e da gp-P ocorreu na mesma célula neoplásica. Além disso, observou-se que a expressão da p53 e

da gp-P foi fortemente associada à sobrevida menor.31

 

Inibidores da resistência a múltiplas drogas Por mais de três décadas, pesquisas têm sido realizadas com intuito de conseguir reverter o fenômeno de RMD. Ao longo dos anos, vários agentes foram testados, com resultados ainda com pouca aplicação clínica. Os primeiros agentes identificados, que modulam ou inibem a função da gp-P, incluem os bloqueadores dos canais de cálcio, antagonistas da calmodulina, agentes esteroides, inibidores da proteína C quinase, fármacos imunossupressores, antibióticos, surfactantes e muitos outros compostos lipofílicos. Todos esses compostos são hidrofóbicos e contêm um anel aromático de baixo peso molecular em sua molécula. Alguns desses compostos, como o verapamil, se ligam à molécula da gp-P e inibem de maneira competitiva a ligação ou o transporte dos fármacos que são substratos da gp-P. Entretanto, esses agentes produzem resultados insatisfatórios in vivo em virtude da interação farmacológica com os agentes quimioterápicos e a sua baixa afinidade de ligação; e a necessidade do uso de altas doses resulta em toxicidade. Para superar essas limitações, vários análogos novos desses primeiros moduladores foram desenvolvidos e testados com o intuito de encontrar moduladores da gp-P com menos toxicidade e com maior potência.

Figura 19.4 Fotomicrografias de mastocitoma cutâneo canino submetido à imuno-histoquímica aos anticorpos primários antiglicoproteína-P (A), anti-MRP1 (B), antiglutationa S-transferase pi (C) e anti-p53 (D), pelo método avidina-biotina-peroxidase (ABC). Aumento: 400 ×. Marcações de coloração castanha indicam imunorreatividade positiva. Contracoloração: hematoxilina de Harris.

 

Os moduladores de gp-P de segunda geração incluem o dexverapamil (isômero D do verapamil), valspodar (PSC 833, derivado da ciclosporina), dexniguldipina e biricodar (VX-710). Apesar de serem menos tóxicos e mais potentes, eles também mantêm algumas características que limitam a utilidade clínica. Entre elas, a falha em reverter a RMD in vivo e a pouca seletividade foram as mais observadas. A afinidade de alguns dos inibidores de segunda geração, como o biricodar (VX-710), por múltiplos transportadores ABC também começou a ser vista como problemática, uma vez que mais interações farmacológicas em potencial podem ocorrer.

Muitos fármacos antineoplásicos são substratos tanto para os transportadores ABC como para a isoenzima 3A4 do citocromo P450. A maioria dos inibidores da gp-P de segunda geração também é substrato para o citocromo P450 (3A4) e metabolizada por essa enzima. A competição entre os agentes antineoplásicos e os moduladores da gp-P pela atividade do citocromo P450 (3A4) pode resultar em interações farmacológicas imprevisíveis.

Os agentes de terceira geração (elacridar, tariquidar, laniquidar, zosuquidar) foram desenvolvidos para superar as limitações dos agentes de segunda geração. Eles não são metabolizados pelo citocromo P450 (3A4) e, portanto, não alteram a farmacocinética plasmática dos fármacos antineoplásicos. Normalmente eles apresentam especificidade maior para a gp-P, porém outros transportadores ABC podem ser inibidos com menor afinidade. Essa especificidade para a bomba de gp-P reduz a possibilidade de que o bloqueio de mais de uma bomba possa resultar em uma biodisponibilidade ou excreção alterada do agente quimioterápico.

A procura por inibidores da RMD também se estendeu aos produtos naturais. O motivo para a busca desses inibidores e seus derivados, considerados de quarta geração, foi a expectativa de serem menos tóxicos e mais potentes que os de primeira e segunda geração. Várias fontes de produtos naturais capazes de reverter o fenótipo de RMD têm sido encontradas. Entre elas, as mais avaliadas foram a curcumina e os flavonoides. A curcumina e seus derivados podem inibir a função dos três maiores transportadores ABC, gp-P, MRP e BCRP. Sua baixa biodisponibilidade quando administrados por via oral e seu rápido metabolismo têm levado os pesquisadores a avaliar o efeito do encapsulamento da curcumina em lipossomo. Aparentemente, a curcumina lipossomal pode reduzir o problema da biodisponibilidade quando administrada por via intravenosa. Sua toxicidade é relativamente baixa, comparável aos inibidores de terceira geração, e tem se mostrado efetiva em modelos animais. Os flavonoides e os isoflavonoides afetam a RMD mediada pela gp-P e MRP de forma diferente. O mecanismo de sua ação é provavelmente a inibição da atividade da ATPase.

Recentemente, foi observado que alguns fármacos inibidores da tirosinoquinase (ITQ) também apresentam efeito inibitório sobre a função de efluxo de fármacos dos transportadores ABC e, dessa forma, podem reverter a resistência das células neoplásicas aos fármacos antineoplásicos tradicionais. Tal efeito pode ser evidenciado em um estudo que empregou linhagem de células provenientes de leucemia linfoide canina, a qual foi

induzida a resistência à doxorrubicina.32 Nesse estudo, a linhagem resistente foi menos sensível aos efeitos antiproliferativos da doxorrubicina que a linhagem original não resistente. Embora o mesilato de masitinibe nas concentrações de 1 e 10 µM não tenha apresentado efeito adicional sobre a citotoxicidade induzida pela doxorrubicina nas células originais, ele aumentou o efeito antiproliferativo da doxorrubicina nas células resistentes. O mesilato de masitinibe também aumentou a concentração do corante

rodamina-123, substrato específico da gp-P nas células resistentes.32

Alguns inibidores têm sido testados com intuito de modular os níveis de GSH e a atividade das GST nas neoplasias humanas. O uso da BSO (butionina sulfoximina) em testes clínicos causou diminuição dos níveis de GSH na combinação com o melfalana. A sulfassalazina também tem sido caracterizada como um modulador da atividade da GST. Um estudo in vitro demonstrou a habilidade desse fármaco em inibir competitivamente a GSTpi e sinergicamente aumentou a citotoxicidade da cisplatina em duas linhagens celulares de neoplasias pulmonares. O ácido etacrínico, normalmente utilizado como um diurético, é conjugado com a GSH e também atua como um inibidor das três maiores classes de enzimas GST. Ele aumenta a citotoxicidade de agentes alquilantes em concentrações fisiológicas apropriadas (clorambucila, melfalana e BCNU).

As técnicas de degradação do mRNA têm sido pesquisadas como uma forma promissora de reverter a RMD. Entre elas, a mais recente é a interferência por RNA (RNAi). A RNAi é um mecanismo celular responsável pelo silenciamento gênico pós-transcricional que atua sobre o RNA mensageiro (mRNA). No foco deste mecanismo, está uma molécula de fita dupla de RNA (double stranded RNA — dsRNA), que, ao ser incorporada na forma ativa a um complexo intracitoplasmático, se liga a uma sequência de nucleotídios complementar localizada no mRNA-alvo, ocasionando assim o silenciamento, por inibição da tradução e/ou degradação do mRNA. Essa técnica tem sido utilizada com sucesso em inibir a gp-P, MRP e BCRP em várias linhagens celulares. Em linhagens celulares de tumores mamários caninos, a técnica mostrou ser efetiva em silenciar os genes MDR1, BCRP, MRP1 e MRP3, o que pode ser mostrado por meio do aumento das concentrações intracelulares do corante rodamina-

123 e da diminuição da atividade de bomba de efluxo.24

 

Considerações finais

A quimioterapia é a principal modalidade terapêutica de determinadas neoplasias, como o linfoma e o TVT, e constitui um importante adjuvante na terapia dos tumores sólidos, como os osteossarcomas e carcinomas mamários. Entretanto, a maior limitação ao sucesso da quimioterapia é a resistência das células neoplásicas às drogas, que pode ocorrer tanto em tumores constituídos por uma linhagem de células geneticamente resistentes ao quimioterápico como em neoplasias que adquirem essa propriedade após o início do tratamento.

Entre os vários mecanismos de RMD, o que envolve a superexpressão da glicoproteína-P é o mais estudado e caracterizado, entretanto parece estar claro que a resistência clínica à quimioterapia é multifatorial e heterogênea. A coexpressão de diferentes proteínas relacionadas com a RMD pode ser observada em várias neoplasias em humanos e em algumas em animais, como nos linfomas e mastocitomas. Muitos mecanismos de resistência podem atuar de modo independente ou podem ainda estar interligados. Por exemplo, a inibição do tipo selvagem da p53 pode resultar na ativação da gp-P, além da inter-relação anteriormente descrita da MRP com o sistema glutationa. Além disso, em humanos, a expressão de determinados mecanismos de resistência, como a gp-P, pode variar de negativa a forte positiva, dependendo do tecido ou do órgão que originou a neoplasia. A heterogeneidade da resistência ainda pode ser observada dentro de um mesmo tipo tumoral. O fato de os mecanismos de resistência estarem inter-relacionados ou agindo em sinergismo, e se apresentarem de forma heterogênea, confere uma grande complexidade ao fenômeno, o que torna mais laborioso seu entendimento e, consequentemente, o desenvolvimento de métodos para a sua reversão.

Até o momento, estratégias de reversão dos principais mecanismos de resistência não estão disponíveis para utilização clínica na Medicina Veterinária. Embora muitas substâncias estudadas para reversão apresentem bons resultados in vitro empregando linhagens celulares derivadas de tumores caninos, a realização de estudos clínicos é necessária para comprovar a efetividade nos pacientes, assim como para avaliar seus efeitos colaterais.

 

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