10 Cultivo Celular | Técnicas e Aplicações no Câncer

Introdução

O termo cultura de tecidos vem sendo empregado de forma genérica, sendo utilizado para se referir aos estudos com células ou órgãos mantidos in vitro por mais de 24 h. A cultura de órgãos refere-se ao cultivo de fragmentos ou de um órgão completo, com a manutenção da sua estrutura tecidual tridimensional e das funções integrais ou parciais que eram exercidas in vivo, enquanto a cultura de células se refere a células mantidas in vitro, provenientes de desagregação mecânica, química ou enzimática de um tecido ou órgão.

 

Breve histórico

O estabelecimento de técnicas para manter e cultivar células in vitro é um marco importante na evolução das Ciências Biológicas. Desde a sua introdução em 1907, métodos têm sido desenvolvidos para elucidar questões fundamentais da biologia celular e direcionar pesquisas na área da saúde.

A história do desenvolvimento do cultivo celular teve início com o pioneirismo de Ross Granville Harrison com o objetivo de melhor compreender o sistema nervoso. Seus experimentos consistiam em colocar um fragmento de medula espinal de embriões de anfíbios em linfa, vedada entre uma lamínula e uma lâmina de vidro, o qual permitiu acompanhar por até uma semana o crescimento e a formação de fibras nervosas, identificando como ocorria a inervação dos órgãos em direção ao sistema

nervoso central.1 Outro importante pesquisador, laureado com o prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1912 por aprimorar a técnica de cultivo celular observando os estudos realizados por Harrison, foi Alexis Carrel, que implantou modificações inovadoras para a época no controle rígido da assepsia e na troca periódica do meio de cultura, sendo considerado por muitos pesquisadores o descobridor da técnica de cultivo celular em virtude de seu sucesso com células cardíacas de embrião de galinha por

aproximadamente 4 semanas.2, 3

Neste contexto, Albert Eberling, um dos assistentes de Carrel, desenvolveu a técnica de subcultivo de células do coração de embrião de galinha, repetindo o processo por 34 anos e criando a lenda do coração imortal de galinha. A desagregação das células de explante (fragmento de tecido retirado de um órgão) por tripsina (enzima que age na quebra de proteínas) e o posterior plaqueamento das células dispersas em garrafas de cultivo foram demonstrados pela primeira vez por Peyton Rous e Fred

Jones em 1916.2, 3

Em 1923, Carrel desenvolveu os primeiros frascos de cultura, circulares e de vidro. Em 1948, Keilova introduziu o uso de antibióticos para a manutenção das culturas. Somente na década de 1950 a tripsina se tornou amplamente utilizada para expansão de subculturas, seguindo procedimentos descritos por Dulbecco em culturas em monocamada para facilitar as clonagens de células por ensaios virais. Os primeiros modelos tridimensionais testados por Joseph Leighton surgiram em 1951, com intuito de minimizar as limitações de um cultivo celular em monocamada e

aproximá-lo da estrutura observada em um organismo vivo.1,2,4

George Gey apud Collins, em 1952, estabeleceu uma linhagem contínua de células derivadas de um câncer de cérvice humano, retiradas de uma mulher afro-americana de 31 anos chamada Henrietta Lacks, atualmente conhecida como a linhagem HeLa. Utilizada até hoje em todo o mundo, demonstrou que tumores humanos apresentam características heteroaploides, em que o número de cromossomos varia de uma célula para

outra, o que aumentou ainda mais o interesse pelo cultivo celular.5

Eagle e Dulbecco et al. apud Alberts et. al e Cruz et al., em 1955, fizeram a primeira investigação sistemática dos nutrientes essenciais para o cultivo celular e descobriram que células eucariotas poderiam se propagar em uma mistura de aminoácidos com uma pequena proporção de proteínas séricas, desenvolvendo a base dos meios de cultura utilizados atualmente. Em 1961, Hayflick e Moorhead apud Alberts et al. e Cruz et al. mostraram que fibroblastos humanos em cultura continham um número finito de divisões celulares. Desse modo, muitas linhagens foram estabelecidas por pesquisadores com o intuito de desvendar os processos individuais de cada sistema. Em 1962, Nakamura et al. apud Alberts et al. e Cruz et al. estabeleceram a linhagem VERO, oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecusaethiops), que se tornou um excelente modelo para o desenvolvimento de vacinas aprovadas pela Organização Mundial da Saúde

(OMS).1, 6

Graham e van der Eb apud Robertis e Evans et al., em 1973, desenvolveram um método para introdução de DNA humano em culturas de células de ratos. Já Köhler e Milstein apud Robertis e Evans et al., em 1975, produziram o primeiro hibridoma de linhagens celulares capazes de secretar anticorpos monoclonais. Enquanto, em 1976, Hayashi e Sato apud Robertis e Evans et al., mostraram que cada tipo celular necessita de uma mistura diferente de hormônios e fatores de crescimento para se desenvolverem em um meio não suplementado. A partir dos anos 1980, grandes progressos foram observados no cultivo celular para confirmar a importância dessa metodologia, na qual foram identificados por Evans et al.

em 1983 alguns dos principais reguladores do ciclo celular.2, 7

Incentivados inicialmente pelos estudos de Martin et al. apud Freshney em 1986, os estudos em cultivo celular também identificaram células com grande potencial de diferenciação, em que células-tronco embrionárias pluripotentes de camundongos foram isoladas e cultivadas. Células-tronco mesenquimais de humanos adultos e embrionárias foram isoladas e cultivadas por Caplan, em 1991, e Thomson et al. apud Freshney, em 1998,

respectivamente.8

Com a evolução da Medicina e das tecnologias de informação, as pesquisas no campo científico foram sendo ainda mais incentivadas a partir dos anos 2000. O Projeto Genoma Humano reuniu esforços internacionais para o mapeamento do genoma da espécie humana e a identificação de todos os nucleotídeos que o compõem. Após iniciativa dos Institutos Nacionais da Saúde (NIH) dos EUA, centenas de laboratórios de todo o mundo se uniram à tarefa de sequenciar, um a um, os genes que codificam as proteínas do corpo humano e também aquelas sequências de DNA que não são genes.

As tecnologias em cultivo celular também foram adotadas em muitas aplicações de rotina em Medicina e na indústria. A análise cromossômica de células derivadas de placenta coletadas por amniocentese pôde identificar doenças genéticas em bebês durante o seu desenvolvimento uterino. Efeitos tóxicos de compostos farmacêuticos e o potencial de poluentes ambientais puderam ser medidos em ensaios in vitro. Da mesma forma, produtos celulares, como o hormônio de crescimento humano, a insulina e a interferona, agora são produzidos rotineiramente por células modificadas com genes específicos. Aplicações em fertilização in vitro também foram desenvolvidas a partir de experimentos em cultura de embriões, agora amplamente utilizados em muitos países. Além disso, o desenvolvimento de gametas in vitro a partir da cultura de células germinativas primordiais, isoladas em testículos e ovário ou a partir de células-tronco embrionárias, tem sido alvo de estudos.

Avanços substanciais foram observados ao longo dos anos, e, atualmente, estudos têm sido direcionados para a avaliação do perfil proteômico e metabolômico dos organismos. De uma forma interessante, ações inovadoras têm sido exploradas na engenharia de tecidos com a aplicação da bioimpressão automatizada de tecidos e órgãos humanos baseada na estruturação por blocos de construção conhecidos como esferoides teciduais, utilizando impressoras 3D, em que esferoides contendo células vivas sofrem um processo de fusão natural e o tecido/órgão recém-fabricado é levado a um sistema de cultivo que deverá prover as condições necessárias para a maturação do novo órgão antes de este ser implantado no paciente.

Desse modo, a cultura celular não permite somente a avaliação direta, independente e restrita de um único tipo celular, mas também é possível observar a interação célula-célula e sua importância no organismo.

 

Classificação das culturas celulares As culturas celulares podem ser classificadas quanto ao tipo de ancoragem das células, podendo ser aderentes ou não aderentes e, quanto à sua origem e o número de divisões celulares, como cultura primária ou de linhagem contínua.

 

■ Células aderentes e não aderentes Dependendo do tecido de origem, as células podem crescer tanto suspensas no meio de cultura quanto aderidas, formando monocamadas em superfície sólida. Na cultura em monocamada, as células aderem ao substrato, pré-requisito indispensável à proliferação celular. O frasco de cultivo deve ser tratado por ionização para estimular o processo de adesão celular, cuja produção de integrinas, proteoglicanos, microfilamentos, moléculas de adesão (CAM) dependentes ou não dependentes de cálcio e outros interagem com o citoesqueleto celular, promovendo a ligação célula-célula e célula-arcabouço.

O crescimento em monocamada é observado na maioria das culturas de células normais com exceção das células provenientes do tecido hematopoético, de tecido tumoral em processo de metastatização e aquelas circulantes oriundas do sistema imune, cujas células crescem em suspensão

de células individuais não aderidas ou em esferas (Figura 10.1).

 

Figura 10.1 Imagens de células em cultivo. A. Células de cultura primária de fibroblastos provenientes de explante de tumor mamário canino (indicado pela seta). B. Células aderentes em monocamada da linhagem tumoral mamária canina, CMT-U229, cedidas pela Dra. Eva Hellmén da Universidade de Uppsala, Suécia. C. Células em suspensão provenientes da linhagem MDA-MB-231 para formação de mamosferas, obtida pelo banco de células ATCC. D. Mamosferas da linhagem CMT-U229. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

■ Células primárias

As células primárias são obtidas diretamente de organismos vivos, em que o tecido separado em condições assépticas é fragmentado em pequenos pedaços e submetido a um tratamento enzimático (tripsina, colagenase, elastase, hialuronidase e outros) ou mecânico para dissociar-se dos agregados celulares e gerar uma suspensão de células livres, devendo ser cultivado em recipiente e meio de cultura apropriados. Com a proliferação celular e o aumento do número de células, as culturas primárias necessitam ser subcultivadas ou repicadas. Apesar disso, esse tipo celular permite um número limitado de divisões, sem grandes alterações morfológicas.

Um dos principais desafios na realização da cultura primária a partir de tumores caninos é a manutenção de um cultivo sem contaminação, uma vez que a maioria dos tumores desses animais é retirada cirurgicamente após um longo período de evolução clínica e se apresenta ulcerada e contaminada, o que será um grande fator limitante no estabelecimento do cultivo celular.

 

■ Células transformadas ou de linhagem contínua À medida que o cultivo primário é subcultivado e as células mais resistentes sobrevivem aos processos de repique e senescência, as células com maior capacidade proliferativa predominam no cultivo, mantendo as características do tecido de origem em células mais homogêneas, com alto índice de proliferação. Obtém-se dessa forma uma linhagem celular por subcultivo de uma cultura primária na qual, por seleção de uma mutação aleatória, as células são transformadas ou imortalizadas, dando origem a uma linhagem celular contínua. Este tipo celular frequentemente está relacionado com a tumorigênese e pode ser propagado sem perder suas características por inúmeras vezes.

Algumas células desenvolvem essa capacidade proliferativa pelo aumento da expressão de uma enzima chamada telomerase, que tem a função de adicionar sequências específicas e repetidas de DNA à extremidade 3 dos cromossomos, onde se encontra o telômero. A presença da sequência telomérica garante o anelamento da telomerase, que, por sua vez, permite a replicação completa do cromossomo e sua correta distribuição espacial. Nas células normais, é natural que o telômero diminua de tamanho durante seu ciclo de vida, em uma taxa de 30 a 120 pares de base por replicação, sendo esse um sinal de senescência. Nas linhagens celulares imortalizadas, o comprimento dos telômeros varia com o tempo, revelando uma atividade compensatória da telomerase.

Diversos são os mecanismos que potencializam e transformam células em linhagens contínuas por meio de técnicas de introdução de genes virais transformantes, ligados a sequências de oncogenes, ou inativação dos mecanismos de ponto de checagem que detêm o ciclo celular.

Linhagens celulares muitas vezes podem ser mais facilmente geradas a partir de células de câncer, mas essas culturas diferem daquelas preparadas a partir de células normais de várias maneiras, sendo referidas como linhagens de células transformadas. Essas linhagens frequentemente crescem sem aderir a uma superfície e podem proliferar para uma densidade muito mais alta em uma placa de cultura. São extremamente úteis na pesquisa celular, como fonte de um grande número de células de um tipo uniforme, especialmente por poderem ser estocadas em nitrogênio líquido a –196 °C por um período indefinido e manter sua viabilidade quando descongeladas.

Tanto as linhagens celulares comercializadas quanto as cedidas ao laboratório de pesquisa por doação devem ser caracteriza- das com marcadores específicos, a fim de confirmar sua origem, seu fenótipo, seu grau de invasividade e a proliferação celular para futuras aplicações.

Os bancos de células são empresas responsáveis pela caracterização das linhagens celulares, assim como pela sua distribuição e comercialização, mantendo estoques em condições-padrão e respeitando normas de segurança. Atualmente, existem bancos de células em todo o mundo que fornecem catálogos de informações dessas linhagens ou apresentam a disponibilização dessas informações por meio da rede internacional de computadores, como o banco de células americano American Type Culture Collection (ATCC), o banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ/UFRJ), entre outros. Algumas das linhagens celulares amplamente utilizadas em

pesquisa estão listadas na Tabela 10.1 e ilustradas na Figura 10.2.

 

Tabela 10.1 Algumas linhagens celulares comumente utilizadas em pesquisa.

 

Linhagem celular Origem do tecido/ Tipo Patologia

celular

 

A2780 Ovário/Epitelial (humano) Carcinoma

 

A549 Pulmão/Epitelial (humano) Carcinoma

 

DU 145 Próstata/Epitelial (humano) Carcinoma

 

HepG2 Fígado/Epitelial (humano) Hepatocarcinoma

 

MCF10A Glândula mamária/ Epitelial Fibrose cística

(humano)

 

MCF7 Mama/Epitelial (humano) Adenocarcinoma

 

MDA-MB-231/ MDA-MB- Glândula mamária/ Epitelial Adenocarcinoma

468 (humano)

 

SCC-9/SCC-25 Boca/Epitelial (humano) Carcinoma

SCC-4/SCC-15 Língua/Epitelial (humano) Carcinoma

 

HCT116 Cólon/Epitelial (humano) Carcinoma colorretal

 

MDCK 60 Rim/Epitelial (canino) Normal

 

MDCK 1 Rim/Fibroblasto (canino) Normal

 

D-17 Osso/Epitelial (canino) Osteossarcoma

 

CRFK Rim/Epitelial (gato) Normal

 

CMT-U229 Glândula mamária/ Epitelial Tumor misto benigno

(canino)

 

CF41 Glândula mamária/ Epitelial Carcinoma

(canino)

 

HT1080 Tecido conjuntivo/ Epitelial Fibrossarcoma

(humano)

 

HeLa Cérvice/Epitelial (humano) Adenocarcinoma

 

HEK293 Rim/Epitelial (humano) Normal

Figura 10.2 Imagens de células aderentes em cultivo em monocamada. A. Linhagem tumoral mamária canina, CMT-U229, cedida pela Dra. Eva Hellmén da Universidade de Uppsala, Suécia. B. Linhagem tumoral mamária canina, CF-41, obtida pelo banco de células ATCC. C. Cultura primária de fibroblastos provenientes de tecido mamário tumoral canino. D. Linhagem tumoral mamária humana não metastática, MCF-7, obtida pelo banco de células ATCC. E. Linhagem tumoral mamária humana metastática, MDA-MB-231, obtida pelo banco de células ATCC. F. Linhagem tumoral mamária humana não transformada, MCF-10A. G. Linhagem tumoral de fígado humana, HepG2. H. Linhagem tumoral de língua SCC-4. I. Linhagem tumoral de língua, SCC-15. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

 

Biossegurança em cultivo de células Para o sucesso da técnica de cultura de células, o cumprimento das regras e os cuidados com assepsia são fundamentais, uma vez que cerca de 70% dos problemas que surgem estão relacionados com contaminações. Assim, o cultivo de células deve ser realizado em condições assépticas. Para isso, vários cuidados básicos de manipulação e prevenção devem ser tomados.

Entre os equipamentos de proteção individual que devem ser obrigatoriamente utilizados para a manipulação das células em cultivo, estão máscara e luvas cirúrgicas, touca, propés e aventais descartáveis. Além disso, antes de iniciar a manipulação das células em cultivo, deve-se realizar a higienização simples das mãos com água e sabão e antisséptica com álcool etílico 70%, seguindo os passos de lavagem estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), desde as unhas e as extremidades dos dedos até o antebraço, com a finalidade de remover a sujidade propícia à permanência e a proliferação de microrganismos que colonizam as camadas superficiais da pele, assim como o suor, a oleosidade e as células mortas, reduzindo a carga microbiana das mãos. Ao final, secar as mãos com papel-toalha descartável seguindo pelos punhos e depois descartar o papel-toalha em depósito de lixo próprio para resíduos comuns e vestir luvas cirúrgicas. Como medida de segurança, o profissional também não deve usar anéis, pulseiras, relógios, entre outros adereços que possam entrar em contato com os materiais estéreis utilizados na manipulação das células.

Além disso, toda a superfície da área de trabalho deve ser limpa com álcool etílico 70% antes e após o desenvolvimento de cada atividade. Assim como todo material aquecido em banho-maria deve passar por assepsia antes de ser introduzido na cabine de segurança biológica. Deve-se retirar o material do banho-maria, remover o excesso de umidade com auxílio de uma gaze ou um papel absorvente e realizar posterior limpeza com álcool etílico 70%. O álcool é eficaz na redução da flora bacteriana da pele por ter propriedade desnaturante de proteínas, responsável por sua ação antimicrobiana.

O cultivo celular deve ser realizado em fluxo laminar ou em cabine de segurança biológica, uma capela para manipulação de reagentes e substâncias tóxicas e voláteis, com espaço suficiente apenas para colocar os braços dentro. Antes do início dos procedimentos, a câmara interna do fluxo deve ser limpa com gaze estéril embebida em álcool etílico 70% e o fluxo de ar e a luz ultravioleta (UV), útil para a eliminação específica de microrganismos no ar e na água, devem ser ligados por, no mínimo, 30 min

antes do uso (Figura 10.3). Todo o material utilizado deve ser desinfetado, autoclavado e esterilizado para minimizar as chances de contaminação, assim como o uso do fogo dentro do fluxo laminar. Durante a manipulação, a cada retirada das mãos do espaço interno do fluxo laminar, devem-se friccionar as luvas com álcool etílico 70%. Com esses procedimentos básicos para a manipulação das células, a chance de contaminação com microrganismos pode ser evitada.

 

Manutenção celular in vitro A dissociação das células dos tecidos e a separação de acordo com o tipo celular resultam em uma população celular relativamente homogênea que pode ser analisada diretamente ou após inúmeras replicações.

Estudos de cultura celular bidimensional são frequentemente realizados em substrato sintético como vidro ou plástico, forçando as células a ajustarem-se ao plano artificial e à superfície rígida fornecida. As garrafas e os frascos utilizados para a manutenção de células aderentes têm superfície plana, propriedades ópticas e cargas negativas, são constituídos de poliestireno, são uniformes quanto às propriedades e à reprodutibilidade, são hidrofóbicos e previamente tratados com químicos e radiações γ. O estabelecimento da cultura celular exige condições assépticas, regulação de temperatura, umidade, oxigênio e gás carbônico, bem como meios de cultivo e suplementos específicos.

 

■ Condições e meios nutritivos apropriados ao cultivo

celular Para manutenção e propagação das células em cultura, é necessário mimetizar as condições fisiológicas, vias metabólicas e bioquímicas, reproduzir as condições nutricionais, mimetizar uma atmosfera apropriada, de temperatura, umidade, oxigênio e gás carbônico encontrados in vivo, além de ter condições de esterilidade com ausência total de microrganismos e agentes tóxicos. As células devem ser mantidas em incubadoras apropriadas, que controlarão a temperatura geralmente em torno de 36,5°C, ter concentração de CO2 em torno de 5% e manter a umidade do ar controlada.

Em procedimentos rotineiros, como troca de meio, repique e outros, deve-se trabalhar utilizando-se cabine de segurança biológica, equipamento que possibilita a filtração do ar por um sistema de membranas seriadas com poros de diâmetro que decrescem gradativamente até 0,3 μm, criando-se assim um local de trabalho no qual o ar que entrará em contato com as células estará em condições de esterilidade, evitando-se possíveis contaminações. As células são frequentemente observadas por microscópio

invertido de imagem (invertoscópio; Figura 10.4).

 

Figura 10.3 Cabine de segurança biológica adequada para o desenvolvimento da técnica de cultivo celular. A. Câmara interna limpa com álcool etílico 70%, fluxo de ar e luz ultravioleta (UV) ligados antes da manipulação das células em cultivo. B. Cabine de segurança biológica com luz fluorescente acesa e pronta para a utilização. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

 

É necessário o fornecimento de nutrientes específicos e em concentrações ideais para as células com o intuito de simular as condições encontradas no tecido original. Este meio pode ser encontrado na forma em pó, altamente estável, ou, ainda, em forma líquida. Os meios de cultivo foram estabelecidos a partir de 1950, com diferentes formulações que proporcionassem a manutenção e o crescimento celular in vitro, como o meio 199 de Morgan de 1950, o meio CMRL de Parker de 1957, os meios basais de Eagle de 1955 e 1959, e o meio NCTC 109 desenvolvido por Evans et al. a partir de 1956, utilizados até hoje.

Em sua composição, devem conter sais inorgânicos (como cálcio, ferro, magnésio, potássio, entre outros), aminoácidos essenciais e não essenciais, vitaminas, proteínas, antibióticos, fontes de energia, como a glicose, hormônios ou fatores de crescimento, condições físico-químicas adequadas,

como pH e osmolaridade, para garantir a sobrevivência celular (Figura

10.5). Antibióticos e fungicidas são utilizados nos meios nutritivos para controle da contaminação microbiológica, sendo os compostos mais utilizados a gentamicina, a estreptomicina, a penicilina e a anfotericina.

Em acréscimo, os meios de cultivo geralmente são suplementados com 5% a 20% de soro. Este aditivo fornece elementos essenciais ao meio de uma forma empírica, contendo: fatores de crescimento, como insulina, fator de crescimento epidermal (EGF) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), que estimulam o crescimento e a diferenciação celular, prevenindo assim os processos de apoptose; albumina, com a função de proteger as células de choques físicos decorrentes dos processos de pipetagem e ainda como agente desintoxicante; fatores de adesão celular; transportadores de íons de ferro, como a transferrina; além de fatores protetores (inibidores de proteases). Deve-se utilizar um soro fetal certificado, estéril, inativado a 56°C por 30 min, livre de micoplasmas e sem endotoxinas. Os soros estão disponíveis comercialmente, e os mais utilizados são de origem bovina, equina e humana.

A formulação dos meios de cultivo e dos suplementos utilizados varia de acordo com a origem celular a que se destina, podendo ser adaptada a cada tipo celular. Para a escolha do meio de cultivo adequado a cada célula, é necessário que se façam uma minuciosa consulta literária e uma busca de referências em bancos oficiais de células. Como exemplo, é possível citar os meios BME (basal medium Eagle’s), EMEM (essencial minnimun with Earl’s salts medium), DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, meio sintético complexo), RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial Institute, meio sintético complexo), CMRL (basal medium designed for serum-free formulations), D-22 (basal medium for insect cell culture) e HAM-F12 (F-12 nutrientmedium).

 

Figura 10.4 Esquema ilustrativo da cabine de segurança biológica (A), invertoscópio (B) e incubadora de CO (C) para manutenção do cultivo celular. Imagens cedidas pelo 2

Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

 

Após acréscimo de quaisquer substâncias ao meio celular, é importante rotular o frasco imediatamente, com etiquetas que contenham informações sobre a solução preparada, o lote, a data do preparo, o prazo de validade, o nome dos técnicos responsáveis e a temperatura de estocagem, que deve ser preconizada entre 4 e 8°C.

 

Principais agentes contaminantes Manter a assepsia em cultura é algo muito difícil. O material esterilizado erroneamente, a manipulação sem cuidado e, principalmente, a falta de higiene e de vestimenta correta dos manipuladores podem causar contaminação de uma cultura.

Embora a contaminação microbiana seja a mais comum, quando as condições de cultura já estão estabelecidas, pode ocorrer também a contaminação química, principalmente quando se utiliza lavagem de vidrarias e materiais com água de qualidade não apropriada. Além disso, também pode ocorrer a chamada contaminação cruzada, que é a contaminação entre células de linhagens diferentes. A contaminação microbiana leva à perda das culturas celulares em andamento e geralmente ocorre em razão de erros de manipulação durante a interação do pesquisador com as técnicas e condições de cultura. Diferentes tipos de agentes podem causar a contaminação microbiana: bactérias, vírus, fungos

(Figura 10.6), leveduras, protozoários e micoplasmas.

Figura 10.5 Componentes básicos constituintes do meio de cultivo celular. CaCl = cloreto 2 de cálcio; KCl = cloreto de potássio; MgS = sulfeto de magnésio; NaCl = cloreto de sódio; NaH PO = fosfato monossódico; NaHCO = bicarbonato de sódio. 2 4 3

 

As bactérias são organismos procariontes com capacidade de proliferação muito rápida e que, na maioria das vezes, conseguem crescer em qualquer condição. Elas estão presentes no ar e nas superfícies. As contaminações por bactérias e fungos são geralmente fáceis e rapidamente detectadas em virtude da turvação do meio de cultura, da alteração do pH pela capacidade de metabolizar o meio de cultura tornando-o excessivamente ácido, da rápida morte celular e da presença de partículas em suspensão. Assim, uma contaminação bacteriana inviabiliza a utilização da cultura celular, visto que elas competem pelos nutrientes do meio fazendo com que as células morram por causa da falta de alimento, alterando o metabolismo celular e diminuindo consequentemente a viabilidade. A presença de micélios filamentosos de fungos é facilmente observada em um frasco de cultura.

Micoplasmas são microrganismos procariotos desprovidos de parede celular que contêm uma membrana lipídica em bicamadas, imperceptíveis na visualização por microscópio óptico invertido, sendo os contaminantes mais comuns na cultura de células. As contaminações por vírus e micoplasmas geralmente ocorrem de forma mais lenta, podendo apresentar período variável de latência, com diminuição gradativa do crescimento celular até a perda das culturas. No caso dos vírus, às vezes é possível a observação de regiões de morte celular nas culturas, enquanto nos micoplasmas a detecção visual da contaminação não é possível. Para diagnóstico de contaminação por esses agentes, existem testes que utilizam a imunofluorescência ou a marcação de proteínas específicas.

Em casos de contaminação, é importante fazer a rastreabilidade, avaliando as condições e o ambiente nos quais a célula foi cultivada, os meios e as soluções utilizados e a paramentação do pesquisador responsável pela manipulação e a revisão das técnicas e dos procedimentos. Isso impede que, em caso de contaminação pontual, esta se espalhe para outras culturas do laboratório, além de permitir a investigação dos principais motivos da contaminação, a fim de eliminá-la. Nesse sentido, a esterilidade deve ser garantida por meio da qualidade das soluções e do material utilizado e do bom treinamento dos técnicos.

 

Tripsinização celular

Após determinado tempo em cultivo, as células estabelecem contato umas com as outras e os nutrientes disponíveis para a manutenção das células podem não ser mais suficientes para a densidade celular. Assim, há necessidade de proceder subculturas sucessivas. O primeiro passo no isolamento de células individuais é romper a matriz extracelular e as junções entre as células que as mantêm unidas. Com esse propósito, um tecido normalmente é tratado com enzimas proteolíticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteínas na matriz extracelular e com agentes (como o ácido etilenodiaminotetracético, ou EDTA) que ligam ou quelam o Ca2+, do qual a adesão entre as células depende.

O processo de renovação de células de uma garrafa a outra é chamado passagem. O número de passagens se refere ao número de vezes que essa cultura foi subcultivada. Muitas linhagens contínuas são capazes de manter as características iniciais do tecido original com algumas passagens, enquanto as células transformadas não mantêm as mesmas características e são capazes de permanecer em cultura por um grande número de passagens (chegando até virtualmente ao infinito número de passagens).

Para as células não aderentes, o procedimento de passagem se assemelha a uma diluição, e basta retirar células da garrafa de cultivo, adicionando novo meio ao seu lugar. Isso ocorre porque essas células se encontram em suspensão no meio, sendo possível retirá-las sem que seja necessário um procedimento específico.

Para as células aderentes, são necessários processos de dissociação mecânica (raspadores) ou enzimática (por ação da tripsina) para estabelecimento de nova cultura celular. A desagregação mecânica pode ser feita por compressão das células contra uma peneira com malha de diâmetro sucessivamente menor, passando as células por meio de uma seringa e uma agulha ou simplesmente pipetando repetidamente. Esta técnica tem a vantagem de ser mais rápida do que a dissociação enzimática, embora cause mais lesões mecânicas às células.

A desagregação enzimática ocorre pela digestão das proteínas de adesão por proteases, ocasionando a dissociação da matriz e a quebra das proteínas de contato célula/célula, sem comprometer a membrana ou danificar a superfície celular. A tripsina, enzima proteolítica inespecífica, hidrolisa cadeias polipeptídicas nos radicais lisil-arginil, formando terminações de clivagem, éster e amida, desestruturando assim a matriz, obrigando as células a restabelecerem os rearranjos do citoesqueleto. Sua atividade residual pode ser neutralizada por intermédio do soro do meio de cultura ou por meio de um inibidor sintético adicionado.

 

Figura 10.6 Esquema ilustrativo de garrafa de explante celular em cultivo. A. Cultivo primário livre de contaminação. B. Cultivo primário com contaminação fúngica. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

 

Contagem celular em hematímetro de Neubauer A viabilidade celular e as condições de crescimento são controladas por meio da quantificação celular; além disso, diversos experimentos necessitam de número preciso de células para novo plaqueamento. A forma direta de contagem de células consiste na contagem direta no frasco de cultivo, e a forma indireta é feita por quantificação de determinadas estruturas celulares, como proteínas ou medição do metabolismo celular.

O método mais utilizado na quantificação direta é a contagem em câmara de Neubauer. A câmara de Neubauer é uma lâmina de vidro com divisões que auxiliam na contagem; ela contém 9 quadrados que medem 1 mm2 de área, e somente os quatro quadrados externos são utilizados na contagem de células. Cada quadrado externo é formado por mais 16 quadrados menores

que auxiliam a contagem (Figura 10.7 A). É necessário acoplar uma lamínula de vidro sobre a câmara, a fim de conter a suspensão celular; o espaço formado entre a lamínula e a câmara é de 0,1 mm. Dessa forma, o volume determinado por cada quadrado é equivalente a 0,1 mm3 e as células contadas em um quadrante, ressuspensas em 1 m ℓ de meio de cultivo,

equivalem ao valor de células contado, multiplicado por 104 (fator de correção da câmara).

 

A contagem celular deve ser incluída na fórmula:

 

Para controle na contagem, deve-se fazer um traço nas laterais das linhas de superfície dos quadrados e considerar apenas as células que estiverem sobre essa marcação. Devem-se considerar apenas as células viáveis na contagem celular; assim, utiliza-se o corante azul de Trypan, solução que não atravessa membranas íntegras, desconsiderando assim as células que apresentarem coloração azul, pelo influxo de corante por meio da

membrana danificada (Figura 10.7 B).

Congelamento e descongelamento celular Células em cultura por longos períodos perdem suas características fenotípicas, pois após várias divisões há grande probabilidade de ocorrerem alterações demasiadas em seu DNA. Assim, o processo de preservação celular por congelamento auxilia na manutenção das características originais da célula, cessando as reações bioquímicas ali ativas.

As linhagens celulares primárias ou estabelecidas podem ser congeladas e mantidas por tempo indeterminado por meio de processos gradativos de congelamento, com adição de meio de cultivo e soro, em proporções previamente estabelecidas, e crioprotetores, como o glicerol ou dimetilsulfóxido (DMSO), que impedem a formação de cristais de gelo no interior da célula no processo. As células são geralmente congeladas lentamente, em ampolas ou pequenos frascos resistentes, denominados criotubos, que posteriormente são armazenados em botijões de nitrogênio líquido a –196°C, podendo ficar estocadas por grandes períodos de tempo, até serem descongeladas e colocadas nas condições normais de cultura, quando voltam a se dividir in vitro.

O descongelamento geralmente ocorre de forma rápida, levando o frasco que contém a solução celular diretamente a 37°C. Uma vez congeladas, as células sofrem danos, ainda que pequenos, em suas funções bioquímicas, fisiológicas e de estrutura. Assim, após seu descongelamento, deve-se acrescentar solução de meio contendo 20% de soro, e, após 24 h de aderência celular, deve-se realizar o procedimento de lavagem para retirada de células inviáveis em suspensão.

Figura 10.7 Representação da contagem do número de células em câmara de Neubauer. A. Células não viáveis coradas com azul de Trypan (indicadas pelas setas). B. Câmara de Neubauer acoplada à lamínula. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

 

Aplicações da cultura celular

Nas últimas décadas, a cultura de células tem se desenvolvido amplamente, deixando de ser utilizada apenas em certas áreas especializadas, tornando-se uma ferramenta de trabalho fundamental em diferentes campos de aplicação, tanto em pesquisa como na indústria biotecnológica e no diagnóstico de determinadas doenças.

O estudo de células mantidas em cultivo permite abordagens transcricionais e traducionais, além da avaliação de mudanças morfológicas e fenotípicas. Entre as diversas tecnologias aplicadas aos produtos celulares, incluem-se o método de avaliação da viabilidade celular, por meio do ensaio MTT, cuja redução do sal tetrazólico, pela desidrogenase mitocondrial de células viáveis, forma como produto o azul de Formazan, proporcional ao número de células viáveis; estudos genômicos, por meio da quantificação gênica por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, do sequenciamento e das análises de bioinformática; a expressão

proteica por imunocitoquímica (Figura 10.8), Western blotting e ensaio imunoenzimático (ELISA); avaliação dos produtos formados por citometria de fluxo, métodos bioquímicos, entre outros.

O desenvolvimento das técnicas de cultura celular tem possibilitado avanços nas pesquisas e na profilaxia de várias doenças infecciosas, por meio do entendimento dos processos patológicos, assim como dos mecanismos de defesa do organismo, dos sistemas de liberação e da ação de anticorpos, e pela produção de vacinas antivirais.

Na virologia, a cultura de células é muito utilizada para a obtenção viral. Como os vírus necessitam de hospedeiros, é na cultura de células que é possível cultivá-los. A cultura de células permite o isolamento do vírus para avaliar o seu efeito em determinados tipos celulares, além de verificar quais células são suscetíveis a determinados vírus.

Além de ser utilizado para o estudo dos vírus, o cultivo de células possibilita a investigação e a criação de modelos para estudos da atividade, do metabolismo e de processos fisiológicos e bioquímicos de células normais e tumorais; entendimento do fluxo intracelular como replicação, transcrição e síntese de proteínas; interações entre complexos receptor/hormônios, resposta a estímulos externos durante a infecção ou a transformação por agentes virais, assim como por agentes mutagênicos; interação célula-célula (morfologia, controle parácrino, cinética de proliferação celular, cooperação metabólica, adesão e mortalidade celular) na diferenciação, adesão celular e compreensão da carcinogênese. O cultivo de células também tem sido utilizado no estudo dos mecanismos de ação de fármacos variados sobre tipos específicos de células, na análise da resposta imune, na sinalização celular, na produção de vacinas e anticorpos monoclonais, entre muitas outras atividades.

No campo da medicina regenerativa, com a descoberta das células-tronco, abriram-se novas perspectivas para a utilização do cultivo celular, sendo a produção de linhagens celulares específicas para transplantes uma das aplicações terapêuticas mais promissoras. As células-tronco podem ser de origem embrionária (células-tronco embrionárias) ou de tecidos adultos (células-tronco adultas). As células-tronco embrionárias têm alta capacidade de replicação e de diferenciação; no embrião, todo o organismo complexo será formado a partir dessas células. As células-tronco adultas são células de proliferação modulada, quiescentes, que se mobilizam para estabelecer a reposição de células que morreram ou que se ativam e proliferam intensamente no momento necessário à regeneração de um tecido danificado, reparando tecidos doentes ou injuriados, como células do músculo cardíaco, pancreáticas para a produção de insulina, hepáticas e neurais.

 

Figura 10.8 Imagens de células tumorais mamárias com marcação proteica pela técnica imunocitoquímica. A. Anti-VEGF, marcador angiogênico. B. Anti-ROCK, marcador metastático. C. Anticaspase 3, marcador apoptótico. D. Anti-RE, marcador hormonal estrógeno. E. Anti-RP, marcador hormonal progesterona. F. Anti-HER-2neu, marcador de proliferação celular. Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

 

Outra área de atuação crescente da cultura de células envolve a sua aplicação no desenvolvimento de biomateriais a serem utilizados para a produção de tecidos artificiais, permitindo avaliar o comportamento celular e a citotoxicidade dos materiais in vitro, restringindo os testes pré-clínicos que utilizam animais.

Especialmente na clínica oncológica, a contribuição de vários estudos utilizando a cultura de células tem sido uma ferramenta importante. Este modelo experimental tem permitido o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na carcinogênese e a identificação de marcadores de diagnóstico e prognóstico, úteis na determinação da co nduta terapêutica. Além disso, a cultura de células tem contribuído para o entendimento dos processos que causam perturbações nas interações celulares, levando ao crescimento neoplásico, assim como da identificação de agentes carcinogênicos e nos

testes de novos fármacos que poderão ser utilizados no tratamento (Figura

10.9).

 

Cultura em formato tridimensional e cocultivo celular

Alexis Carrel notou que a região central das colônias celulares apresentava elevado índice de necrose, impedindo a interação de células dessa região com o meio de cultura, relação diretamente associado à viabilidade celular e maior taxa de proliferação. Assim, iniciou-se um cultivo celular, em formato de scaffolds biodegradáveis, que permitisse o rearranjo espacial das células, aumentando a superfície celular, a fim de explorar a biologia celular e tumoral e avaliar o interior celular em resposta à difusão de diferentes tratamentos.

Figura 10.9 Fluxograma das diferentes aplicações em estudos com cultivo celular.

 

A cultura celular tridimensional é o modelo que viabiliza a heterogeneidade e a fisiologia das células, pela formação de esferoides multicelulares in vitro, mimetizando o microambiente celular, as interações célula-célula e a célula-matriz. Uma vez que quase todos os tecidos são estruturas tridimensionais (3D) de vários tipos de célula e matriz extracelular (ECM) integrada e a sinalização intercelular é importante para a manutenção das funções biológicas, vários fatores podem influenciar pesquisas aplicadas à cultura celular.

Os esferoides formados apresentam exposição diferencial a fatores como nutrientes, oxigênio e gás carbônico, permitindo a interação desses com o exterior e interior celular, e consequente melhor resposta a ensaios radiológicos e de quimioterápicos. A cultura tridimensional visa a mimetizar a morfologia tecidual no câncer, uma vez que os esferoides formados são fidedignos à estrutura celular do organismo vivo, permitindo o estudo das alterações celulares nos tecidos e a compreensão do microambiente tumoral, bem como a regulação da comunicação/sinalização celular, resposta a fármacos e, ainda, a avaliação da atividade metastática em células cancerosas, sendo portanto considerado o modelo tecidual in

vitro (Figura 10.10).

Vários substratos têm sido utilizados no cultivo celular tridimensional in vitro, como géis de colágeno tipo I, membrana basal reconstituída (Matrigel®), laminina/entactina, alginato, hidrogéis ou macroscaffolds, formando assim uma superfície gelatinosa, permitindo que as células explorem as três dimensões do espaço, aumentando as interações com o ambiente e entre as células.

A tecnologia de imunofluorescência permite a análise dos esferoides

celulares formados, a partir da marcação proteica (Figura 10.11), em resposta à bioatividade de fármacos, que muito se assemelha às encontradas em alguns tumores sólidos.

A cocultura é outra aplicação da cultura celular que permite a associação de células com diferentes origens ou, ainda, de células tumorais com componentes do microambiente e células do sistema imune. Esta técnica de cocultura tem sido estabelecida com o propósito de compreender o “estudo da interação de células do sistema imune” e avaliar a “interação mesênquima-estromal”.

A técnica de cocultura direta é constituída por duas camadas de dois tipos de células diferentes, uma em cima da outra, em contato direto, podendo ser efetuada em quase todas as placas de cultura de células. Este contato direto entre uma célula e outra desempenha um papel importante nos mecanismos de invasão do câncer por meio de ações de moléculas de adesão, como a N-caderina.

Por sua vez, a cocultura indireta é realizada em insertos específicos com membranas de poliéster com 0,4 μm de porosidade, separando as

populações de células cocultivadas isoladas (Figura 10.12), mantendo comunicação bidirecional entre as diferentes populações pelo meio de cultivo, reproduzindo de maneira confiável os resultados in vitro.

 

Figura 10.10 Esquema ilustrativo dos diferentes aspectos da cultura tridimensional e possibilidades de estudo com ênfase na pesquisa em câncer. O = oxigênio; CO = gás 2 2 carbônico.

 

Figura 10.11 Imagens de esferoides tumorais mamários cultivados em matrigel com marcação proteica pela técnica de imunofluorescência com o anticorpo caspase clivada-3 (A) e marcação nuclear (B). Imagens sobrepostas (C). Imagens cedidas pelo Laboratório de Investigação Molecular do Câncer (LIMC/FAMERP).

Figura 10.12 Esquema de cocultivo entre duas populações de células distintas (amarelas e vermelhas) cultivadas em inserto com membrana de porosidade de 0,4 μm de espessura para comunicação entre os dois lados do inserto.

 

 

Perspectivas futuras

O cultivo celular tem sido realizado há mais de um século, e as perspectivas de estudo nesse modelo são promissoras. Apesar de este cultivo ser próximo do modelo real, não é possível reproduzir a interação entre as células e os outros componentes que estão interagindo em um organismo, o que pode ser observado no modelo in vivo. No entanto diversas técnicas têm sido empregadas para minimizar esses efeitos, buscando mimetizar os processos orgânicos. Além disso, a compreensão da resposta celular in vitro, como por exemplo o teste de fármacos entre outros agentes, consegue reduzir a utilização de animais de laboratório nestes estudos, o que torna o cultivo celular uma técnica imprescindível na atualidade, permitindo que os modelos in vivo sejam utilizados apenas na validação dos resultados. Referências bibilográficas

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