3 Bioquímica do Câncer | Promessas da Metabolômica

Introdução

Os processos vitais que incluem desde as reações de síntese até contração muscular, condução do impulso nervoso e transporte ativo de membrana compartilham a energia gerada no acoplamento das reações. A energia total de um sistema permanece constante, entretanto pode-se transferir energia de uma parte do sistema para outra ou pode-se transformá-la em outra forma de energia. Os termos exergônico e endergônico são utilizados para indicar que um processo é acompanhado por perda ou ganho de energia, respectivamente, em qualquer forma, não necessariamente como calor.

Os sistemas biológicos são essencialmente isotérmicos e usam seu potencial químico para impulsionar os processos vitais. Para que se possa entender a importância da nutrição no metabolismo normal, é essencial entender como um animal obtém, por meio de seus alimentos, o combustível necessário para absorção dessa energia. As reações metabólicas raramente ocorrem de forma isolada; elas são, em geral, organizadas em sequências de múltiplos passos, denominadas vias. Em uma via, o produto de uma reação serve como substrato para a reação subsequente. Diferentes vias também podem formar intersecções, estabelecendo uma rede integrada de reações químicas com propósitos definidos. Essas redes de reações são coletivamente denominadas metabolismo, que é caracterizado pela soma de todas as modificações químicas que ocorrem nas células, nos tecidos e no organismo como um todo.

Ao se estudar o metabolismo, examinam-se suas vias e seus componentes. Cada via é composta de sequências multienzimáticas, e cada enzima, por sua vez, pode apresentar importantes características catalíticas ou regulatórias. Além disso, as vias metabólicas para produção de energia (vias catabólicas) ou a síntese de produtos finais (vias anabólicas) são reguladas de acordo com as necessidades da célula. Para manter os processos necessários para a vida, todos os organismos devem obter suprimentos de energia livre. Os organismos autotróficos utilizam processos exergônicos simples. Por sua vez, os organismos heterotróficos obtêm a energia livre ao acoplarem seu metabolismo à clivagem de moléculas orgânicas complexas do ambiente.

Entre os processos metabólicos que ocorrem em uma célula, será enfatizada a respiração celular, que tem importância no metabolismo da célula tumoral e é responsável pela produção de energia. A glicose é a principal fonte de energia para essas células e sua quebra (glicólise) pode ocorrer de forma aeróbica (na presença de oxigênio) ou anaeróbica (na ausência de oxigênio), fornecendo um saldo diferente de energia para a célula. Já no século 19, Louis Pasteur, durante seus estudos sobre a fermentação da glicose por leveduras, descobriu que tanto a velocidade quanto a quantidade total de glicose consumida são muitas vezes maiores em condições anaeróbicas do que aeróbicas.

A glicólise ocorre no citoplasma das células a partir da oxidação completa da molécula de glicose a CO 2, produzindo piruvato (ou ácido pirúvico), que, na presença de oxigênio, entra na mitocôndria e é utilizado no ciclo do ácido cítrico para produção de 36 moles de adenosina trifosfato, nossa moeda corrente, ATP. Diferentemente da forma aeróbica, o rendimento da glicólise em condições anaeróbicas gera apenas duas moléculas de ATP, levando à conversão do piruvato em lactato. Portanto, para produzir a mesma quantidade de ATP, é necessário consumir aproximadamente 15 vezes mais glicose em condições anaeróbicas do que

aeróbicas (Figura 3.1).

Em outras palavras, a via glicolítica é utilizada em todos os tecidos para a quebra da glicose, com o objetivo de fornecer energia, na forma de ATP e intermediários, para outras vias metabólicas. Em todos os organismos, o ATP desempenha um papel fundamental na transferência de energia livre dos processos exergônicos para os processos endergônicos.

 

Metabolismo do câncer

Uma das principais características que diferenciam tecidos normais dos tumorais é o comportamento metabólico, sobretudo em relação ao metabolismo da glicose. O metabolismo celular do câncer foi descrito pela primeira vez na década de 1920 pelo bioquímico Otto Warburg. Ele observou que, diferentemente das células normais, as células tumorais podem converter glicose em lactato, mesmo na presença de oxigênio.

Figura 3.1 Esquema simplificado da respiração celular. A molécula de glicose é quebrada no citoplasma da célula, gerando ácido pirúvico. Por meio do processo aeróbico, a respiração ocorre em três fases: a glicólise (no citoplasma); o ciclo do ácido cítrico (na matriz mitocondrial); e a cadeia respiratória (nas cristas mitocondriais), produzindo 36 ATP. Na ausência de oxigênio, as células utilizam a respiração anaeróbica pela conversão do ácido pirúvico em lactato, produzindo duas moléculas de 2 ATP.

 

Essa importante diferença metabólica foi denominada “efeito Warburg”

(Figura 3.2), e desde então foi reconhecida como uma importante característica no processo neoplásico. Seguindo esta teoria, as células tumorais priorizam a respiração anaeróbica em seu metabolismo, enquanto a maioria das células normais utiliza a respiração aeróbica para gerar energia a partir da glicose e só produz lactato em condições anaeróbicas.

Mas por que as células tumorais, que precisam de uma grande quantidade de energia, preferem realizar a respiração anaeróbica, que produz apenas 2 ATP, em vez da aeróbica, que permite a produção de 36 ATP?

Muitas hipóteses foram levantadas para justificar a preferência das células tumorais pela glicólise anaeróbica. Inicialmente, o próprio Warburg sugeriu que as células tumorais apresentam um defeito na mitocôndria que impossibilitaria ou dificultaria a respiração aeróbica e tornaria as células dependentes do metabolismo anaeróbico. No entanto, posteriormente, foi demonstrado que a função mitocondrial está intacta na maioria das células tumorais. Hoje, acredita-se que essas células preferem realizar a respiração anaeróbica porque o processo traz diversas vantagens que resultam no crescimento do tumor.

 

Figura 3.2 Esquema representativo do efeito de Warburg. Tecido normal produz lactato em grandes quantidades somente na ausência de oxigênio (O ). Em contraste, células 2 tumorais tendem a metabolizar a glicose em lactato mesmo na presença de oxigênio (glicólise anaeróbica). CAC = ciclo de ácido cítrico.

 

Após a glicólise anaeróbica, os animais com neoplasia convertem parte do lactato em glicose novamente, para a obtenção de mais energia com gasto enérgico de seis fosfatos. O resultado final é o tumor ganhar energia e o paciente perder, o que gera perda acelerada da massa corpórea, denominada caquexia. A caquexia é resultado de profundas alterações no metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios que desencadeiam sérias debilidades e até mesmo a morte. Essas alterações metabólicas podem persistir nos pacientes com remissão do tumor e recuperação clínica. As consequências da caquexia são: resposta e toxicidade aumentadas à radiação, à cirurgia, à quimioterapia e aos fármacos ou procedimentos auxiliares. Assim, é fundamental o conhecimento desse processo metabólico para escolher estratégias terapêuticas eficientes.

Alterações no metabolismo celular permitem a

■ sobrevivência em condições adversas Durante o crescimento de tumores sólidos, ocorre a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese), visando ao fornecimento de oxigênio e nutrientes para dar suporte ao metabolismo das células tumorais. Quando a angiogênese é insuficiente, essas células precisam sobreviver em hipoxia (ambientes com baixa disponibilidade de oxigênio). Essas condições adversas levariam à morte celular, mas, curiosamente, as células tumorais são capazes de se adaptar a ambientes desfavoráveis, gerando, por exemplo, aumento do metabolismo celular e captação de glicose a seu favor. Fisiologicamente, a angiogênese é em geral regulada por fatores pró e antiangiogênicos, mas, no tecido tumoral, ocorrem aumento dos fatores pró-angiogênicos e diminuição dos antiangiogênicos, o que resulta na ativação do “interruptor angiogênico” (angiogenic switch).

Em condições de hipoxia, ocorre aumento dos níveis do fator de transcrição induzido por hipoxia, denominado HIF-1α, que é mantido em baixos níveis em condições normais de oxigênio nos tecidos. Por sua vez, o HIF-1α induz o aumento da expressão de genes que promovem a sobrevivência celular, como proteínas angiogênicas que ativam a formação de novos vasos sanguíneos, melhorando o fornecimento de nutrientes e oxigênio para o tumor.

O HIF-1α também induz o aumento da expressão de genes responsáveis pela captação de glicose, como os transportadores de glicose, além de proteínas envolvidas na glicólise anaeróbica. É importante destacar que os genes relacionados com o metabolismo são os mais expressos por células tumorais e denunciam a relação com a agressividade do tumor. Além disso, a superexpressão do HIF-1α já foi descrita em muitos tipos de câncer, e este é considerado um marcador de prognóstico desfavorável na espécie humana e também na canina.

Em resumo, a baixa disponibilidade de oxigênio e nutrientes no microambiente tumoral pode levar ao aumento da captação de glicose, bem como de proteínas que promovem a glicólise na busca da sobrevivência e no crescimento do tumor.

 

■ Respiração anaeróbica promove alterações vantajosas no

microambiente tumoral

Como descrito anteriormente, o produto final da glicólise anaeróbica é o lactato e os íons de hidrogênio. Assim, o acúmulo dessas moléculas no meio intracelular acidificaria de forma acumulativa o pH, resultando em morte celular. No entanto, a célula tumoral consegue eliminar o lactato produzido, recuperando seu pH. O microambiente ácido resultante conferirá vantagens ao tumor, pois muitos fármacos utilizados como tratamento quimioterápico tendem a se acumular no meio ácido, ficando concentrados

fora da célula (Figura 3.3).

Um microambiente ácido também torna difícil a sobrevivência de células normais, estimulando o potencial invasivo das células tumorais. O meio ácido estimula a liberação de enzimas proteolíticas, como catepsina B, e gera degradação da matriz extracelular e consequente migração dessas células tumorais para outros tecidos. Além disso, em áreas hipóxicas, o lactato transportado para o meio pode ser utilizado por células vizinhas como fonte de carbono para continuar a proliferação.

 

■ Alterações metabólicas mantêm o equilíbrio redox dentro

da célula

Todas as células geram espécies reativas de oxigênio (ERO) no seu metabolismo. Quando estão em baixos níveis, essas espécies reativas aumentam a proliferação e a sobrevivência por meio da modificação pós-traducional de quinases e fosfatases. Em níveis moderados, inibem a expressão de genes que respondem à hipoxia e ao estresse oxidativo, como o HIF-1α, que pode induzir diferentes respostas celulares, conforme descrito anteriormente. Por fim, altos níveis de espécies reativas de oxigênio causam danos na membrana, nas macromoléculas e no DNA, culminando em morte celular.

Fisiologicamente, essas ERO são neutralizadas por moléculas antioxidantes, garantindo a homeostase. Quando ocorrem aumento das espécies reativas de oxigênio e diminuição de moléculas antioxidantes, caracteriza-se uma condição denominada estresse oxidativo, que, em células normais, resulta em danos oxidativos e morte celular. Seria interessante para o organismo que as células tumorais fossem destruídas pelas ERO, como ocorre na resposta imune a microrganismos. Entretanto, as células tumorais aumentam a síntese de moléculas antioxidantes, como a glutationa, e o estresse oxidativo é minimizado e responde em sobrevivência celular.

A glutationa é uma das mais importantes proteínas do sistema antioxidante, e sua atividade redutora é dependente da presença de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH). Assim, células tumorais podem metabolizar a glicose pela via das pentoses fosfato, o que gera NADPH e garante o aumento da atividade antioxidante. A NADPH também é produzida em células de mamíferos por meio da conversão de isocitrato em α-cetoglutarato, pela ação da enzima isocitratodesidroge-nase, dependentes de NADP, como a IDH1 e a IDH2.

Para realizar o seu anabolismo, a célula necessita de outras fontes de energia além do ATP; sendo assim, precisa de um poder redutor, na forma de NADPH. Embora NADH e NADPH sejam semelhantes estruturalmente, eles têm funções diferentes. O NADH usa a energia livre proveniente da oxidação de metabólitos para sintetizar ATP pela fosforilação oxidativa, enquanto a NADPH utiliza energia para a biossíntese redutora de ácidos graxos e colesterol. Essa diferenciação é possível porque as enzimas envolvidas nas etapas de redução e oxidação são altamente específicas para suas coenzimas. Assim, mutações nas enzimas envolvidas nesse processo estão relacionadas com a tumorigênese e estão sendo investigadas como possíveis alvos terapêuticos.

 

Figura 3.3 A célula em condições normais faz respiração aeróbica, ao contrário das células tumorais, que apresentam altas taxas metabólicas, obtendo energia pela glicólise anaeróbica. Esse processo gera aumento da produção de lactato e íons H+, o que produz um meio extracelular ácido que favorece o crescimento e a invasão tumoral. Finalmente, o lactato liberado pelas células tumorais é metabolizado pelo estroma tumoral.

 

■ Células tumorais realizam glicólise anaeróbica para

permitir que reações anabólicas aconteçam

Na maioria dos tumores, a captação e a degradação de glicose ocorrem cerca de 10 vezes mais rápido do que em tecidos normais. A preferência das células tumorais pela glicólise anaeróbica é uma opção à rápida divisão celular, prioridade no tecido tumoral. É importante lembrar que antes de cada divisão uma célula precisa duplicar seu DNA e todos os seus componentes, incluindo membranas, proteínas e organelas. Assim, além da energia, a célula tumoral requer muitos outros metabólitos para duplicação de seus componentes, gerados na conversão de glicose em lactato.

Se a glicose é completamente catabolizada em CO , como ocorre na 2 respiração aeróbica, os metabólicos intermediários não ficam disponíveis para as reações de biossíntese que devem ocorrer para proliferação celular. Assim, ao parar a quebra da glicose em piruvato, os carbonos, em vez de entrarem no ciclo do ácido cítrico, são desviados para as vias anabólicas, como produção de lipídios de membrana e nucleotídios do DNA.

Portanto, de forma resumida, as células tumorais alteram seu metabolismo realizando glicólise anaeróbica para permitir atividade anabólica necessária para a rápida divisão celular e o consequente crescimento do tumor.

 

■ Alterações genéticas envolvidas na modificação do

fenótipo metabólico

Células tumorais com frequência apresentam mutações que promovem o desenvolvimento e a progressão tumoral. Em todos os tipos de câncer, a regulação normal da divisão celular se torna disfuncional pelos defeitos em um ou mais genes. Por exemplo, genes que codificam proteínas que emitem sinais intermitentes para divisão celular, chamados proto-oncogenes, tornam-se oncogenes, originando proteínas sinalizadoras constitutivamente ativas. Outros genes que codificam proteínas que reprimem a divisão celular (genes supressores tumorais) estão mutados e originam proteínas que exercem esta função de controle. Esses tipos de mutação podem ocorrer na maioria dos tumores.

Portanto, as mutações em proto-oncogenes e genes supressores de tumor afetam o metabolismo celular, acarretando alterações em múltiplas vias de sinalização, o que promove a sobrevivência e a progressão tumoral.

 

■ Via PI3 K/AKT/mTOR em células tumorais Em células tumorais, a via PI3 K/AKT/mTOR está constitutivamente ativa e promove o aumento da captação de glicose, glicólise e biossíntese de macromoléculas necessárias para a divisão celular descontrolada.

Mutações que levam à ativação da via PI3 K são frequentemente observadas em muitos tipos de câncer. Ela pode ocorrer, por exemplo, por mutações no gene supressor tumoral PTEN, um regulador negativo de PI3 K. Uma vez ativada, a via PI3 K não só promove sinal de crescimento e sobrevivência às células tumorais, mas também altera o fenótipo metabólico.

O metabolismo da glicose em mamíferos é limitado pela sua taxa de captação pelas células e sua fosforilação pela hexoquinase. A captação da glicose no sangue é mediada pela família de transportadores de glicose, denominados GLUT. Nas células tumorais, a PI3 K ativa a proteinoquinase AKT, que aumenta a expressão de GLUT1 e a atividade de enzimas da via glicolítica, como hexoquinase e fosfofrutoquinase. Por sua vez, a AKT ativada estimula mTOR, que atua como ponto-chave do metabolismo, estimulando também a biossíntese de proteínas, lipídios e o consequente crescimento celular.

Outra proteinoquinase, denominada proteinoquinase ativada por AMP (do inglês, AMPK), atua como ponto de checagem metabólico, regulando a disponibilidade de energia nas células. Como ela é ativada principalmente pela redução no conteúdo energético celular (ou seja, aumento na relação AMP-ATP), seu maior efeito é desligar vias metabólicas que consumam ATP (vias anabólicas) e, ao mesmo tempo, estimular vias metabólicas que produzam ATP (vias catabólicas).

Em uma célula normal, AMPK se opõe ao efeito de AKT e funciona como potente inibidor de mTOR, inibindo a produção de biomoléculas e crescimento celular quando as condições não estão adequadas. No entanto, células tumorais apresentam mutações que reduzem a sinalização de AMPK, o que, por consequência, permitirá a ativação de mTOR, resultando na divisão celular mesmo quando as condições energéticas não forem adequadas.

Alguns medicamentos comumente utilizados em pacientes diabéticos, como a metformina, parecem ter efeitos antitumorais, por ativarem a via

AMPK, o que resulta na diminuição do crescimento celular. A Figura 3.4 mostra a cascata intracelular decorrente da inativação de PTEN e AMPK.

Além disso, a ativação constante de mTOR também aumenta a expressão do HIF-1α mesmo em condições adequadas de oxigênio (normóxia). Outros eventos, como mutações em enzimas que participam do ciclo do ácido cítrico, denominadas succinato desidrogenase (sDH) e fumarato hidratase (FH), também podem resultar na ativação do HIF-1α em normóxia. Assim, como já descrito anteriormente, a ativação do HIF-1α aumenta a transcrição de fatores que promovem a glicólise anaeróbica.

Entre as outras vantagens conferidas à ativação do HIF-1α, ocorre ativação da piruvato quinase desidrogenase (PDK), a qual inativa o complexo mitocondrial piruvato desidrogenase, reduzindo o fluxo de piruvato derivado de glicose para o ciclo do ácido cítrico. Esse processo reduz a taxa de fosforilação oxidativa e o consumo de oxigênio, o que reforça o fenótipo glicolítico e poupa oxigênio em condições de hipoxia. Em outras palavras, a PDK diminui a oxidação do piruvato na mitocôndria e aumenta a conversão do piruvato em lactato. Mutações no proto-oncogene MYC também podem colaborar com o HIF-1α na ativação de transportadores de glicose e enzimas glicolíticas, como a lactato desidrogenase A, que converte o piruvato em lactato.

Agentes terapêuticos que podem inibir HIF-1α ou PDK levam à reversão dessas alterações metabólicas. O ácido dicloroacético é um agente altamente eficaz na redução de lactato em organismos sadios, bem como em uma série de causas congênitas e adquiridas de acidose láctica, em virtude da sua capacidade de inibir a PDK. Recente estudo demonstrou que a atividade da PDK em linhagens tumorais pode ser regulada pelo ácido dicloroacético em virtude da capacidade de este se ligar à PDK e inibir de forma atenuada a atividade da piruvato descarboxilase. O aumento da atividade desta subunidade enzimática modifica o metabolismo da glicose e diminui o potencial de membrana mitocondrial. Isso permite a translocação de ERO e citocromo c da mitocôndria para o citoplasma, posteriormente induzindo apoptose pela ativação da enzima caspase.

 

Figura 3.4 Os mecanismos moleculares ativos no metabolismo do câncer são conduzidos por múltiplas vias de sinalização. O PTEN inibe a via PI3 K e o processo de glicólise, porém, no câncer, este não desempenha o seu papel. Dessa forma, a PI3 K ativa AKT, que estimula o processo de glicólise pela regulação de enzimas glicolíticas e ativa também a mTOR, enzima-chave do metabolismo celular. A proteinoquinase ativada por AMP (do inglês, AMPK) regula a disponibilidade de energia nas células, porém as células tumorais apresentam mutações que reduzem a sinalização de AMPK, permitindo a ativação de mTOR e resultando na divisão celular mesmo quando as condições energéticas não estão adequadas.

 

■ Mutação do gene supressor tumoral p53 O p53 é uma importante proteína supressora tumoral que atua na regulação do ciclo celular, na reparação do DNA e na manutenção da estabilidade do genoma e tem sido também vinculado à alteração do fenótipo metabólico. Mutações no p53 levam à perda de suas funções e, portanto, associam a alteração com a tumorigênese.

Quando não está mutado, o p53 regula a expressão do PTEN, que inibe a via PI3 K e, por consequência, a glicólise, como descrito anteriormente. O p53 também ativa a hexoquinase 2 (HK2), que converte glicose em glicose-6-fosfato (G6 P), o principal substrato para as vias metabólicas. A G6 P entra na glicólise para produzir ATP, ou na via das pentoses, para biossíntese de macromoléculas pela produção de NADPH e da ribose, utilizada para síntese de nucleotídios.

O p53 inibe a via glicolítica, promovendo a superexpressão de um fator denominado TIGAr (do inglês TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator), uma enzima que diminui os níveis do ativador glicolítico frutose-2,6-bisfosfato.

 

■ Glicose não é o único substrato energético para células

tumorais

Nem todas as células tumorais dentro de um mesmo tumor fazem respiração anaeróbica; algumas continuam realizando fosforilação oxidativa (respiração aeróbica). Além disso, a glicose não é o único substrato utilizado pelas células tumorais para fosforilação oxidativa. Tem sido proposto que alguns tipos de câncer podem utilizar outros nutrientes como fonte primá-ria de energia, como o aminoácido glutamina. A glutamina entra na célula e é convertida em glutamato, que pode, então, ser convertido diretamente em glutationa, que controlará o estresse oxidativo na célula. O glutamato pode ser convertido em α-cetoglutarato e entrar no ciclo do ácido cítrico, abastecendo a função de biossíntese de ácidos graxos e aminoácidos necessários antes da divisão celular.

O metabolismo lipídico também está envolvido na sobrevivência e na progressão das células tumorais. No organismo, os lipídios são geralmente encontrados na forma de triacilgliceróis, no entanto outras formas fazem parte da dieta diária, como os fosfolipídios, o colesterol e as vitaminas lipossolúveis. A colina, principal precursor dos fosfolipídios, é uma amina quaternária, presente nas membranas celulares e mitocondriais, além de ser um nutriente essencial fornecido predominantemente pela dieta para a função normal de todas as células. A maior parte da colina no organismo é encontrada na forma de fosfolipídios, como a fosfatidilcolina e a esfingomielina.

Dados recentes na literatura mostram que a presença de altos níveis de fosfatidilcolina tem sido detectada em células tumorais. Esse fato ocorre principalmente pelo aumento da atividade da enzima colina quinase, que é responsável pela formação de fosfotidilcolina a partir da colina. Além disso, fatores de crescimento são capazes de aumentar a expressão e a atividade da colina quinase. Pesquisas demonstram que inibidores dessa enzima resultam no bloqueio da mitose e da proliferação celular.

Essa necessidade por diferentes nutrientes poderia estar associada à caquexia, comum em muitos pacientes com câncer, que é caracterizada pela perda de massa corporal, particularmente tecido adiposo e muscular, que não pode ser revertido pelo aumento da alimentação. Dessa forma, diferentes nutrientes além da glicose estariam sendo desviados para o desenvolvimento do tumor nesses pacientes.

 

Metabolômica | Principais métodos de estudo

para análise das alterações bioquímicas Doenças complexas como o câncer têm sido amplamente exploradas por análises “ômicas” (genômica, transcriptômica, proteômica), a fim de identificar novos biomarcadores, bem como complementar métodos diagnósticos usuais e avaliação de resposta a terapias. Recentemente, a metabolômica foi introduzida nesse grupo para fornecer uma visão global dos processos metabólicos. O conjunto de todos os metabólitos produzidos ou modificados por um organismo é denominado metaboloma e refere-se ao produto final de interações entre a expressão gênica, proteica e o ambiente celular. Dados recentes sugerem que o metaboloma humano consiste em aproximadamente 3 mil metabólitos endógenos (Projeto Metaboloma Humano).

A metabolômica consiste na caracterização desses fenótipos metabólicos em determinadas condições, por técnicas específicas. O estudo metabolômico surgiu recentemente, pelo fato de as alterações nos níveis de mRNA nem sempre resultarem em alterações nos níveis proteicos, e, uma vez traduzida, a proteína pode estar ou não ativa. Assim, as alterações observadas no transcriptoma e proteoma nem sempre correspondem a alterações fenotípicas. A metabolômica é direcionada à detecção de analitos (metabólitos) com baixo peso molecular (até cerca de 1000 Da ou menos) excluindo ácidos nucleicos como DNA, mRNA e proteínas. Portanto, as informações metabólicas complementam os resultados obtidos a partir de outras análises “ômicas”, adicionando uma parte final no sistema de estudos da fisiopatologia da doença e identificação de biomarcadores.

O objetivo da metabolômica é compreender os processos bioquímicos que estão alterados na doença, a progressão a terapêutica, recuperação e várias outras condições biológicas. Qualquer alteração ou característica molecular mensurável de uma célula tumoral, seja ela sobre o DNA, RNA, proteína ou o nível metabólico, pode ser considerada biomarcador do câncer. Embora a metabolômica seja pouco aplicada no campo do câncer, é a mais recente técnica de genômica funcional, e de grande promessa. Portanto, há uma necessidade eminente da descoberta de novos biomarcadores moleculares específicos, como indicadores do processo patológico ou da resposta a intervenção terapêutica, e de sua introdução na prática clínica.

 

■ Tecnologias utilizadas no estudo metabolômico A metabolômica é um tipo de análise que consiste em identificar metabólitos na composição de células, tecidos ou fluidos biológicos como urina, soro ou plasma sanguíneo, fluido cerebrospinal e saliva e quantificá-los. As principais tecnologias ou plataformas que foram desenvolvidas para detectar metabólitos baseiam-se principalmente em técnicas de separação, tal como cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês, HPLC), associada às técnicas de espectroscopia por ressonância nuclear magnética (do inglês, RMN) e espectrometria de massas (do inglês, MS).

Inicialmente, metabólitos e peptídios devem ser purificados antes das análises posteriores. A amostra altamente purificada é essencial para o exame detalhado de suas propriedades físicas e funcionais. As células têm milhares de metabólitos diferentes, cada qual em quantidades muito variadas. O isolamento de um metabólito específico em quantidades suficientes para a análise de suas propriedades representa, assim, um desafio formidável que pode exigir a aplicação sucessiva de múltiplas técnicas de purificação. O HPLC é a técnica de separação de moléculas mais utilizada; sua função é separar uma molécula de outra com base na diferença de seu tamanho, utilizando instrumentos sofisticados e automatizados. O aparelho denominado cromatógrafo a líquido é composto de três partes principais: injetor, dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na fase móvel; coluna cromatográfica, dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra; e, por fim, o detector, que tem a função de identificar os componentes eluídos das colunas cromatográficas.

Já a forma de análise da RMN na metabolômica tem como alvo a concentração de hidrogênio e carbono das amostras, com a vantagem de ser um processo não destrutivo e relativamente rápido. No entanto, a RMN apresenta baixa sensibilidade, porém sua maneira não invasiva torna possível a caracterização metabólica. Em geral, o maior problema na utilização da RMN é a presença de água nos tecidos, o que gera dificuldade da análise em relação ao sinal emitido e ao ruído captado. Infelizmente, todos os fluidos biológicos e, em particular, o corpo humano estão envoltos em grandes quantidades de água e têm outras fontes de interferência também, como a presença de lipídios.

Por sua vez, técnicas baseadas em MS são mais sensíveis do que técnicas de RMN, detectando pequenas concentrações de metabólitos no tecido. Essas técnicas são utilizadas geralmente associadas às técnicas de separação de analitos, como a cromatografia líquida. A MS é capaz de fornecer uma leitura altamente sensível, sendo mais tolerante às variações na qualidade da amostra. Além disso, como a massa e a carga são propriedades comuns de uma ampla gama de biomoléculas, a MS pode ser empregada para analisar os metabólitos, os carboidratos e as modificações pós-traducionais, como a fosforilação ou a hidroxilação. No entanto, tem pouca exatidão e precisão, pois funciona apenas para moléculas conhecidas e requer composto-padrão para optimização completa.

Os estudos metabolômicos resultam em um conjunto complexo de dados multivariados que necessitam de métodos de bioinformática para a interpretação. O objetivo desses procedimentos é produzir impressões digitais bioquímicas que são de grande valor diagnóstico ou prognóstico. A segunda etapa consiste em identificar as substâncias capazes de diagnosticar ou classificar, e isso permite a combinação desses biomarcadores que definem o contexto biológico ou clínico.

 

■ Futuras perspectivas

A integração do conhecimento obtido a partir das investigações “ômicas”, incluindo metabolômica, genômica e proteômica, pode ajudar na identificação e caracterização dos biomarcadores responsáveis pelo desenvolvimento de diversas doenças, inclusive o câncer. O estudo metabolômico é uma grande promessa para o avanço da compreensão, do diagnóstico e do tratamento do câncer. A abordagem é utilizada para verificar mecanismos da carcinogênese e da proliferação celular, identificar biomarcadores prognósticos em amostras sanguíneas e biopsia e até mesmo contribuir para a caracterização de tumores e escolha do melhor tratamento específico. Atualmente, as aplicações da metabolômica em patologias como câncer têm proporcionado uma melhor visão para o entendimento das vias metabólicas alteradas e da patogênese da doença.

Muitos esforços têm sido dedicados ao estudo do perfil genômico e proteômico das neoplasias, mas as informações sobre o perfil metabólico das células tumorais ou dos tecidos ainda são limitadas. O desenvolvimento e a aplicação da metabolômica no futuro dependerão de vários fatores, como o estabelecimento de bases de dados de metabólitos e identidades bioquímicas associadas, bem como a validação cruzada de metabólitos obtidos por RMN ou MS e correlação com outros testes quantitativos. Por fim, os resultados das avaliações metabolômicas são de suma importância para integração com outros estudos “ômicos”, caracterizando o fenótipo da doença. Dessa forma, mesmo que a metabolômica represente desafios tecnológicos em termos de equipamentos específicos, reprodutibilidade e análise de dados, este campo de estudo representa importante promessa ao possibilitar uma visão abrangente sobre a célula do câncer, contribuindo potencialmente para novas terapias personalizadas.

Assim, condições do microambiente tumoral e alterações genéticas podem alterar o metabolismo das células tumorais. A vascularização do tumor tem estrutura e função anormais e, quando combinada com metabolismo intrínseco alterado, cria um comportamento heterogêneo nos processos de oxidação, no pH, assim como na concentração de glicose e outros metabólitos. Essa extrema condição induz respostas celulares às condições adversas que induzirão a alterações do perfil metabólico das células tumorais, influenciando na progressão tumoral. As adaptações metabólicas devem equilibrar os três fatores cruciais requisitados pelas células neoplásicas: o aumento da produção de energia, a biossíntese suficiente de macromoléculas e a manutenção do equilíbrio redox. Só por meio de um profundo entendimento desses processos é que serão descobertos os pontos-chave das vias metabólicas tumorais e haverá a capacidade de desenvolver agentes terapêuticos específicos.

 

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