Fragmentação do DNA Espermático

 

A análise da fragmentação do DNA do esperma é um teste amplo para

determinar o dano específico sobre a estrutura e a integridade da sequência

de DNA no esperma.

 

Técnicas

 

Diferentes técnicas avaliam aspectos e características de danos no DNA

espermático, sendo esses ensaios divididos ou categorizados sob diferentes

perspectivas, relacionadas com a base molecular do teste, o tipo de dano, o

parâmetro ou o indicador de medida, além das técnicas de biologia

molecular empregadas.

Os testes disponíveis incluem a avaliação direta de danos no DNA

espermático por meio de testes como TUNEL, COMETA e ISNT; ou

avaliação indireta, por FISH, SCD, SCSA e SDFA.

Testes como COMETA, ISNT e TUNEL detectam rupturas dos

filamentos de DNA circulante, enquanto os testes por SCSA e SCD medem

principalmente a integridade da cromatina e a susceptibilidade de

desnaturação do DNA. Estes últimos avaliam as extremidades das rupturas,

que podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, originadas pela

desnaturação do DNA. Os principais são:

• TUNEL está baseado na quantificação dos intervalos de quebra da

cadeia de DNA que pode dar origem a fragmentos de cadeia dupla ou de

cadeia simples (nicks). Ambos os tipos de quebra podem ser detectados

pela marcação das zonas hidroxilo-terminais 3’ recorrendo a

nucleotídeos modificados, numa reação enzimática. A enzima

responsável por esse passo é a deoxynucleotidyl transferase (TdT), que

catalisa a polimerização de desoxirribonucleotídeos nas zonas 3’ em

cadeias simples ou duplas. Os espermatozoides são fixados e

permeabilizados, e subsequentemente incubados em uma mistura

contendo a enzima TdT e TMR-dUTP. Após a marcação, com a

montagem em meio com contraste nuclear (DAPI), é possível a

observação ao microscópio de fluorescência

• COMET é utilizado para detectar a quebra de DNA de cadeia simples ou

dupla dos espermatozoides, conforme a migração por uma corrente

elétrica. Nesta técnica, os espermatozoides são mergulhados em um gel

de agarose e em seguida corridos por eletroforese em uma câmara

durante um curto período de tempo em condições alcalinas (pH = 13) ou

neutras (pH = 8,4). Além disso, as análises podem ser realizadas por

meio das imagens obtidas por microscopia de fluorescência utilizando

um software, sempre quando os espermatozoides forem corados com

Brometo de etídio ou SYBR green, por exemplo. A distância em que os

fragmentos de DNA danificado migram para a cauda do cometa

depende do tamanho e das informações a respeito da cauda, que podem

ser obtidas. Em resumo, os espermatozoides com maior dano no DNA

apresentam uma migração aumentada.

• SCD (teste de dispersão da cromatina espermática) permite estabelecer a

proporção de espermatozoides com DNA fragmentado no total de uma

amostra analisada. Considerada a técnica mais simples e conveniente,

devido ao custo/benefício, envolve o uso de microscópio de

fluorescência ou microscopia de campo claro, para estimar a quantidade

de dano ao DNA, avaliando a formação de um halo sob determinadas

condições de desnaturação e após remoção das proteínas nucleares com

o uso de uma solução de lise. Dessa forma, o ensaio é baseado no

princípio segundo o qual o espermatozoide que apresenta maior

quantidade de fragmentos de DNA não consegue produzir o halo

característico após a desnaturação e a remoção das proteínas nucleares.

As amostras são avaliadas (um mínimo de 500 espermatozoides) no

âmbito de uma objetiva de 100x do microscópio, com base na produção

ou não de tal halo.

• SCSA (análise da estrutura da cromatina do espermatozoide) utilizando

as propriedades metacromáticas da laranja de acridina, esta técnica

mede a susceptibilidade do DNA do espermatozoide e a desnaturação in

situ, quantificando essa mudança metracromática de verde

(espermatozoides com DNA normal) para vermelho (espermatozoides

com DNA desnaturado) após o tratamento com ácido ou calor e o uso

da citometria de fluxo. Dessa forma, o SCSA estima a porcentagem de

dano na cromatina do esperma.

Indicações

 

As evidências sugerem que os danos do DNA do espermatozoide estão

associados a pacientes que apresentam redução nas taxas de fertilidade.

Além disso, o aumento dos níveis de danos no DNA tem sido associado a

um maior risco de perda gestacional após ciclos de fertilização in vitro

(FIV) e injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), além de

haver evidências que sugerem uma alta relação com repetidas falhas de

implantação (RIF) em tratamentos de FIV. Também são afetados pacientes

com fator masculino severo (oligospermia severa, varicocele, entre outros),

por apresentarem um grande aumento do estresse oxidativo que acaba

causando alterações no fluxo correto da espermatogênese e,

consequentemente, alterações cromossômicas embrionárias. Pacientes que

fazem uso de agentes tóxicos, como tabaco e pesticidas, assim como

pacientes obesos, também podem estar prejudicados.

 

Conduta

 

Inúmeras estratégias estão sendo adotadas para diminuir as taxas de dano ao

DNA.

Recomendamos:

• Quando há presença de varicocele clínica, a cirurgia é a opção de escolha

no tratamento que apresenta melhor resultado e pode vir a possibilitar

uma gestação natural.

• A utilização de antioxidantes orais e antibióticos também deve ser

considerada. Contudo, após o tratamento e a melhora nas taxas, o mais

indicado é a utilização do ICSI, devido ao favorecimento para as taxas

de gestação, e a discussão de eventual diagnóstico genético pré-

implantacional (PGS), com a análise de aneuploidias para os 24

cromossomos.

• Também é importante o cessar do tabagismo, a perda de peso superior a

20% do atual, a retomada de atividades físicas e a melhora na qualidade

de alimentos ingeridos, priorizando alimentos frescos e com menor teor

de açúcar e gorduras nocivas.