As técnicas de diagnóstico retrospectivo e as vacinas da Rockefeller

• fechar bem o frasco e colocar num agitador durante duas

horas;

• deixar durante a noite na frigidaire;

• agitar, filtrar novamente em gaze e distribuir em ampolas de 2

c.c.47

As técnicas de diagnóstico retrospectivo e as

vacinas da Rockefeller

A técnica da soro-vacinação utilizada por Theiler e Sellards e também Aragão em 1928, e Davis, em 1930, era o correlato daquele método para diagnóstico retrospectivo ao qual já nos referimos, que consistia em injetar no rhesus soro da pessoa suspeita de haver tido a febre amarela e, em seguida, sangue contendo vírus. Se o macaco sobrevivia, o soro provinha de pessoa que tivera a doença e, em conseqüência, adquirira os anticorpos que agora protegiam o animal. A única diferença entre esta técnica de diagnóstico e a de soro-vacinação é que, no último caso, utilizava-se soro sabidamemente imune.

Aragão reivindicou para si o mérito de haver estabelecido, em 1928, o método para diagnóstico retrospectivo, que "imprimiu um grande impulso às investigações epidemiológicas e que tomou depois o nome de prova de proteção ... sendo o rhesus um animal muito caro, foi substituído pelo camundongo branco desde que, graças a Theiler, foi reconhecido esse animal como igualmente sensível à febre amarela, quando o vírus lhe era inoculado por via intracerebral" (Aragão, 1958, p. 558).

Em 1928, quando os estudos sobre febre amarela incorporaram o rhesus como seu principal modelo animal, já havia uma lista de mais de 65 doenças imputadas aos chamados "vírus filtráveis", isto é, microrganismos inacessíveis aos microscópios óticos mais potentes da época, e capazes de atravessar filtros que retinham as menores bactérias conhecidas. Em meados dos anos 1920, fora reconhecida mais uma característica importante desta classe ainda obscura de microrganismos: sua dependência exclusiva de células vivas para se reproduzir, o que constituía, ao mesmo tempo, uma limitação e um estímulo para as investigações nesta área, que se diferenciava cada vez mais dos objetos e técnicas tradicionais da bacteriologia (Hughes, 1977, pp. 93-108). As técnicas de cultivo em tecidos conhecidas (Steinhardt, Israeli e Lambert, 1913; Levaditi, 1913) ainda não permitiam contornar os complexos problemas relacionados à replicação dos vírus em animais vivos. Em 1931, Alice Woodruff e Ernest W. Goodpasture, patologistas da Universidade de Vanderbilt, conseguiram cultivar o vírus da varíola das aves na membrana cório-alentóide de embriões de galinha em crescimento. Esta técnica logo se disseminou pelo laboratórios de virologia, já que os ovos embrionados eram um hospedeiro mais barato e fácil de manipular que os animais de experiência. Possuíam várias membranas suscetíveis a infecção por diferentes vírus. Como veremos, constituiriam o substrato orgânico para a fabricação de diversas vacinas, inclusive a da febre amarela. Mas antes de isso acontecer, foi preciso superar complexos problemas em campo e em laboratório.

A descoberta de Theiller, publicada em 1930, representou inovação fundamental para todas as linhas de investigação concernentes à febre amarela. Libertou, parcialmente, os laboratórios mais pobres do dispendioso investimento na compra dos macacos indianos. O camundongo branco era mais fácil de conservar, manipular, reproduzir e transportar. E graças ao novo "modelo animal", ou a esse novo meio de cultura, obtiveram-se novas raças do vírus da febre amarela, com propriedades que ainda não tinham sido observadas nos hospedeiros humanos e animais até então conhecidos.

Utilizando cepa de vírus isolada pelos franceses Mathis, Sellards e Laigret em 1928, de um caso humano de febre amarela em Dacar, Theiller mostrou que o camundongo branco, habitualmente refratário à infecção, era capaz de contraí-la quando inoculado por via intracerebral. Os camundongos morriam de encefalite, sem apresentar lesão em outro tecido que não fosse o do sistema nervoso central. O vírus "fixado" em cérebro de camundongo ficou conhecido como "neurotrópico", por se comportar de forma diferente do vírus conhecido como viscerotrópico, isto é, do causador das lesões em vísceras como o fígado, que serviam para o diagnóstico da doença nos cadáveres de humanos e primatas (Soper, 1937, p. 381). Verificou-se que o vírus submetido a repetidas passagens em cérebro de camundongo perdia a capacidade de produzir lesões viscerais em macacos rhesus, ainda que adquirisse maior faculdade de atacar o seu sistema nervoso central.

Além de permitir o uso maciço da "prova de proteção", a descoberta de Theiler inaugurou uma nova etapa no desenvolvimento e controle da vacina contra a febre amarela.

Em maio de 1931, Sawyer, Kitchen e Lloyd (1931, 1932) iniciaram as experiências de imunização com o vírus neurotrópico combinado com soro imune humano, obtido de indivíduos que haviam sobrevivido a um ataque recente da doença. A adição de soro imune se devia ao receio de que esse vírus, por seu neurotropismo, fosse potencialmente perigoso para o homem: "a presença do soro impediria o vírus de penetrar na circulação do indivíduo inoculado, assegurando assim proteção contra qualquer atividade patogênica

do vírus". 48 Experiências feitas com rhesus no laboratório de Nova York mostraram que essa vacina não era segura (Theiler e Whitman, jul. 1935, pp. 1.342-7). Ainda que fossem reduzidas as chances de ocorrer uma febre amarela típica, havia o risco da encefalite e, para minimizá-lo, aumentouse de 0.3 para 0.6 cc a quantidade de soro imune por quilo de peso total. Injetava-se a mistura de vírus vivo dessecado e soro humano imune, inoculando-se depois mais soro, de modo a completar a quantidade necessária para a proteção. A grande quantidade de soro requerida por este método de imunização tornava-o muito caro e inviável para uso em larga escala. Ainda assim, permitiu o controle das infecções em laboratório, que cessaram em 1931. Nos quatro anos seguintes, foram vacinadas cinqüenta pessoas na América do Sul, sendo 34 no Brasil (Rio de Janeiro, Bahia e Recife), 11 na Colômbia e 5 na Argentina (Soper, 1937, p. 382).

No começo dos anos 1930, os virologistas do laboratório de Nova York perseguiam dois objetivos. Por um lado, tentavam modificar o vírus da febre amarela, alterando os meios e as condições em que era cultivado, de modo a obter uma cepa com menos efeitos adversos e maior poder imunizante. Por outro lado, procuravam obter soros mais ricos em anticorpos, de maneira que doses muito pequenas fossem suficientes para proteger o indivíduo vacinado do risco da própria vacina (ibidem, p. 383). T. P. Hughes obteve um soro 'hiperimune', injetando semanalmente, por vários meses, altas doses de soro de rhesus infectados em cabras, até obter concentração de anticorpos 31 a 60 vezes maiores do que os do soro humano padrão. Em 1935, Loring Whitman verificou que ocorria um rápido e temporário aumento de anticorpos no sangue dos animais de experiência quando se administrava uma segunda dose de vírus semanas após a imunização. Este passou a ser o método para se obter soro hiperimune: inoculavam-se doses elevadas de vírus em macacos, seis a oito semanas após a vacinação; nove dias após a inoculação da dose hiperimunizante, colhiam-se soros com títulos de anticorpos vinte a sessenta vezes

superiores ao do soro humano padrão.49

Concomitantemente, faziam-se experiências visando a atenuar o vírus por passagem em diversos meios de cultura. Em 1936, Lloyd, Theiller e Ricci conseguiram cultivar o vírus da febre amarela in vitro, em tecido de embrião de camundongo. O vírus que utilizaram não era a estirpe ou cepa neurotrópica francesa, que havia sido empregada na soro-vacinação humana. Era um vírus pantrópico dotado de elevada virulência, que proviera de um caso benigno de febre amarela num africano chamado Asibi, em Kpeve, Gana. O sangue deste doente fora inoculado em macaco rhesus por Mahaffy e Bauer, em 30 de junho de 1927, e nos seis anos e meio seguintes, até o cultivo em tecido de embrião de camundongo, o vírus foi transferido a mosquitos e sofreu 53 passagens em macacos rhesus, alternando períodos de vitalidade com a preservação no estado

liofilizado.50 Foi na 17ª série de experiências com cultura em tecidos que Lloyd, Theiler e Ricci utilizaram a cepa Asibi (Bica, 1988, pp. 158-9). Vinham acrescentando letras aos números das experiências para distinguir os meios de cultura testados. A cultura do Asibi em polpa de tecido embrionário de camundongo com 10% de soro de macaco normal em solução de Tyrode foi denominado 17E. A raça assim obtida era quase inteiramente destituída de viscerotropismo para o macaco, e não apresentava aumento do neurotropismo para o camundongo. Esse vírus, que se encontrava já na 130ª passagem, foi então usado na vacinação humana, mas a redução do viscerotropismo não era suficiente para se prescindir do soro imune. Ele ainda produzia em macacos grave infecção sistêmica. Em 1934, Lloyd e colaboradores adotaram outro curso nas experiências com meios de cultura, que viria a dar resultado mais promissor. Depois de 18 passagens do vírus em meio contendo tecido de embrião de camundongo, passaram a cultivá-lo em meio com embrião de galinha completo, efetuando aí 58 passagens. A mudança se deveu à preocupação de impedir a contaminação acidental por outro vírus de mamíferos que pudesse ser patogênico para o homem. Em seguida, o vírus foi transferido para meio contendo polpa de embrião de galinha, tendo-se agora o cuidado de retirar o sistema nervoso central do embrião para ver se diminuía a afinidade neurotrópica do vírus. Dando prosseguimento aos

trabalhos de Lloyd, que faleceu em 193651, Theiller e Smith (1937a, 1937b) observaram que a cultura prolongada neste meio — onde já se tinham feito 39 passagens — ocasionava grande redução das afinidades víscero e neurotrópica do vírus pertencente à série de experiências 17D. Após 114 subculturas realizadas desde 1934, chegou-se a uma cepa que produzia reações totalmente benignas quando inoculada subcutaneamente em macacos rhesus, revelando-se um imunizante eficaz contra inoculações subseqüentes de material altamente virulento. Ainda mais, o 17D deixou de causar encefalite fatal quando injetado no cérebro de macacos, não obstante conservasse esse efeito em camundongos.

Por essas qualidades foi chamado de vírus "camarada".52