Inoculação dos ovos

Inoculação dos embriões no ambiente à prova de poeira.

Perfura-se a casca com estilete, através de uma gota de tintura

de iodo posta sobre a câmara de ar, e injeta-se, próximo ao

embrião, 0,06 cc do material que serve de fonte de vírus. Após

o procedimento, faz-se a selagem do orifício. Rio de Janeiro,

RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/ LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Inoculação dos ovos

Começava a segunda etapa do processo, a inoculação dos ovos, no ambiente mais protegido do laboratório, o "quarto à prova de poeiras". Os ovos eram colocados em suportes rotativos com capacidade para quatro unidades em pé, com a extremidade mais larga — aquela marcada a lápis — para cima. Pingava-se aí uma gota de tintura de iodo, para esterilizar o local onde a casca era perfurada por meio de um estilete. Feito isso, era introduzida no mesmo orifício uma agulha que se aproximava do embrião, após ter perfurado a membrana interna da câmara de ar, injetando-se 0,06 c.c. de um dos inóculos descritos acima.

O Diário de Henrique Pena nos revela os esforços que fazia em 1941-42 para aperfeiçoar este método, que tinha inconvenientes: morriam muitos embriões atingidos pelo iodo ou contaminados por bactérias, o que Penna atribuía à inadequada desinfecção dos ovos e ao pó contaminado da casca que penetrava durante a perfuração.

Ele buscava uma maneira de fazer a inoculação que dispensasse o uso do desinfetante, assegurando, porém, a assepsia da casca antes da introdução da agulha. Fez diversas experiências com um maçarico antes de chegar ao procedimento padrão. Primeiro, usou a chama para perfurar a casca, sobre a câmara de ar, efetuando a injeção através desse orifício, mas com freqüência o aquecimento do ar contido na câmara que envolvia o embrião fazia a casca estalar. Tentou, então, diminuir a pressão interna fazendo antes um furo no lado oposto àquele onde aplicava a chama do maçarico e, em seguida, a agulha de inoculação. Verificou que o pó de casca resultante do primeiro furo penetrava na câmara de ar pelo orifício da agulha, contaminando o embrião. Penna tentou, ainda, afinar a casca em determinado ponto, com esmeril de dentista, até que a membrana ficasse quase exposta. A chama do maçarico podia ser aplicada mais rapidamente, para eliminar essa frágil barreira,

evitando, assim, que o calor danificasse o ovo.13

A técnica vigente a partir de 31 de março de 1942 consistia no uso da chama do maçarico de oxi-acetileno para perfurar a casca (Manual da vacina, p. 10). O segmento queimado esboroava-se com facilidade, permitindo a penetração da agulha de inoculação de 1/4 de cc, acoplada à seringa originalmente desenhada para aplicar tuberculina. O orifício era fechado com uma mistura de parafina e breu.

O relato de 1956 (Penna, pp. 69-70) revela outras mudanças relacionadas à preocupação com a assepsia e a produtividade.

Cada sublote com cerca de cem embriões era processado independentemente, até que os testes bacteriológicos comprovassem sua esterilidade. Os ovos eram arrumados em suportes de madeira, agora com capacidade para sustentar oito unidades, na mesma posição. Uma pequena área da casca era pintada com tintura de mertiolato, e os suportes eram impelidos através de uma porta dupla que se abria na altura de uma mesa comprida, na sala à prova de poeiras, onde seis pessoas executavam as operações manuais em fluxo contínuo. Uma queimava com o maçarico a oxigênio uma área de alguns milímetros na parte da casca do ovo pintada com mertiolato. Outro perfurava a casca com um instrumento pontiagudo que, de oito em oito ovos, era mergulhado num recipiente com álcool e flambado. O terceiro operador introduzia a agulha de inoculação, montada numa seringa de aplicar tuberculina, e injetava na cavidade amniótica, nas proximidades do embrião, os mesmos 0,06 c.c. de inóculo. A cada oito ovos, a seringa era substituída. Dois operadores selavam os ovos com cera quente, e o sexto preenchia as seringas.

Hoje, as operações são as mesmas, com idêntica feição manufatureira, ainda que transcorram em ambiente provido de dispositivos tecnologicamente mais sofisticados e sujeito a regras de conduta e indumentária muito mais rigorosas, visando a obter o máximo de assepsia.

Inoculação de ovos na sala à prova de poeira, verificando-se

algumas inovações, como o fluxo contínuo dos ovos, que são

manipulados por diferentes operadores. Rio de Janeiro, RJ,

1956.

Penna, 1956, p. 70

Os suportes com os ovos desinfetados com tintura de iodo são transferidos para a chamada "área biolimpa" através de um pass through, que funciona de modo parecido com a porta dupla mencionada acima, barrando, porém, mais eficazmente os contaminantes do ambiente externo, graças sobretudo à pressão negativa mantida na sala onde se efetua a inoculação. O estilete usado para perfurar a casca é limpo a cada dez ovos, em solução de álcool iodado. A seringa tuberculínica, substituída a cada 16 ovos, introduz diretamente na cavidade vitelina mais ou menos 1000 PFU de suspensão viral, preparada a partir do lote semente secundário diluído em solução salina a 0,85% (PFU ou Plaque Forming Units é o método de titulação em cultura de células que substituiu, nos anos 1980, o antigo método de doses letais em camundongos, como mostramos no final do capítulo quatro). O material usado para selar o orifício é cola plástica misturada com gotas de fenol.

Os ovos a inocular são dispostos em blocos de madeira,

contendo cada qual oito unidades, na posição vertical, com a

parte mais larga para cima. Uma pequena área da casca, no

topo do ovo, é marcada com tintura de mertiolate e os blocos

de madeira são conduzidos através da porta dupla para a sala à prova de poeira, onde se processa a inoculação. Rio de Janeiro,

RJ, década de 1970.

LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Preparação dos ovos para inoculação. A chama do maçarico

fragiliza a casca no ponto onde penetrará a agulha de

inoculação.

Rio de Janeiro, década de 1960.

Álbum LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Preparação das seringas que são preenchidas com o vírus

vacinal a ser inoculado nos ovos. Rio de Janeiro, RJ, década de

1970.

LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Da suspensão de inóculo é retirada amostra para teste de esterilidade bacteriana e fúngica. Em 1941-42, quando os níveis de contaminação eram muito mais altos, o operador depositava 1c.c. do material utilizado como fonte de vírus num balão contendo caldo glicosado, antes de encher a primeira seringa para inocular os ovos, e repetia a operação com o material restante, depois de encher a última seringa.

LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Os ovos inoculados eram levados de volta à câmara ou quarto de incubação e lá permaneciam por mais três ou quatro dias, à mesma temperatura (37,8ºC). Existia uma relação entre a concentração (título) de vírus no inóculo e o dia em que ela atingia o máximo nos embriões. A relação variava conforme a amostra de 17D utilizada e, por isso, só era possível determiná-la empiricamente, de acordo com o lote que fornecia o inóculo (Manual da vacina, pp.10-11). Após a adoção da cepa EP, a técnica padrão incorporou uma regra mais precisa: "Não menos que 5.000 LD devem ser injetados em 50

cada ovo, se o período de incubação pós-inoculação for de três dias. Em alguns laboratórios, admitem-se quatro dias ... Neste caso, a concentração de vírus no inóculo deve ser menor, para evitar excessiva mortalidade, e o período de incubação pré-inoculação não deve exceder oito dias, de modo a manter a idade dos embriões, à época da colheita, abaixo de 12 dias" (Penna, 1956, p.72).

À esquerda, inoculação direta na cavidade amniótica, na

direção do embrião, mas sem tocá-lo. Morriam cerca de 25%

dos embriões por traumatismo causado pela agulha de

inoculação. Em 1961, Alberto Romeu Nicolau adotou nova

técnica e passou a inocular o vírus na cavidade vitelina, com

agulha de menor tamanho. A mortalidade caiu para 5 a 10%, e

se obteve título viral mais uniforme na polpa embriônica. Os

ovos eram carimbados com a data do início da incubação, e

formavam sublotes, que tinham o número do lote seguido de

uma letra. Na imagem acima, vê-se um ovo com carimbo da

data da sua incubação, 04 de novembro de 1939. A cola selando

o orifício resultante da perfuração da agulha mostra que se

trata de ovo já inoculado, em fase de incubação, visando obter

a maturidade do embrião e o momento adequado para se

proceder à sua coleta, com maior concentração de vírus para a

confecção da vacina. Rio de Janeiro, RJ, 1939.

Filme Preparação da vacina de febre amarela/Cinemateca Brasileira Coleta dos embriões