Ingressando no laboratório: o vírus

Gráfico mostrando a freqüência dos sintomas prodrômicos da

icterícia nas quatro categorias de casos investigados por Fox,

Manso, Penna e Pará.

Coc/Fiocruz

Ingressando no laboratório: o vírus

Data desse período o esforço no sentido de padronizar a técnica de preparação da vacina e, até mesmo, os procedimentos a adotar em caso de modificação dessa técnica. Com certo atraso, determinado, sem dúvida, pelos contra-tempos que descrevemos acima, codificou-se no Laboratório de Febre Amarela aquela lógica taylorista de controle de tarefas, hierarquização de atribuições e maximização de resultados que regia as outras rotinas do programa de combate à febre amarela.

Segundo J. Austin Kerr e Henrique de Azevedo Penna, os autores do Manual da vacina, elaborado em fevereiro de 1941, a descrição detalhada das etapas de preparação da vacina tinha por objetivo "permitir a todos conhecer exatamente qual técnica foi usada na produção de cada lote". Mudanças podiam se tornar necessárias, mas não devia haver desvio, "ainda que ligeiro, da técnica padrão aprovada ... sem prévia aprovação por escrito do diretor do laboratório". Sempre que se efetuassem mudanças, elas teriam de ser descritas como revisão da técnica existente. As páginas do manual tinham a data de janeiro de 1941. As páginas revisadas receberiam os números correspondentes às páginas substituídas,

anotando-se no topo a data de revisão.2

Este documento constitui, assim, uma excelente via para ingressarmos no laboratório e examinarmos mais de perto o modo como era fabricada a vacina. Os problemas e as soluções que se sucedem em encadeamento tão límpido nos trabalhos publicados, a posteriori, pelos técnicos e dirigentes do serviço e pelos historiadores da medicina, aparecem de forma mais desordenada, ou menos estável, nos registros elaborados por aqueles que suavam a camisa para manter as partes do complexo sistema funcionando adequadamente.

Verificamos, então, a partir das sucessivas revisões feitas entre janeiro de 1941 e agosto de 1942, que nesse período coexistiram técnicas diversas em certas etapas do processo e coexistiam, inclusive, três tipos de vacina: aquela ainda com soro, filtrada e sem filtragem, e a vacina sem soro e sem filtragem, em vias de prevalecer.

Tentaremos recuperar a história do processo de produção da vacina, combinando os dados fornecidos pelo manual de 1941 com trabalhos similares que nos fornecem 'cortes' relativos ao processo em curso em 1956 e na atualidade. Relatórios, diários e artigos publicados pelos técnicos que lidaram com a vacina, especialmente Henrique de Azevedo Penna, nos mostram a dinâmica da implementação de novas soluções, com os ensaios e erros, os becos sem saída, no tempo decorrido entre a fixação das sucessivas técnicas padrão.

Até a implantação definitiva do sistema de lotes semente, em 1944, a seleção, importação e replicação das cepas, também chamadas estirpes, raças ou amostras, do vírus 17D; o cuidadoso registro das subculturas passadas e presentes usadas no preparo da vacina constituíam não uma etapa do processo produtivo, mas um conjunto de operações trabalhosas e, problemáticas. O 17D referido nos textos destinados ao público externo ao laboratório era uma abstração: as subamostras do vírus formavam uma galhada complexa e, nos meios de cultura onde esses ramos se perpetuavam e multiplicavam, os vírus constituíam microcosmos vivos nem sempre estáveis ou previsíveis. Toda vez que aparecia uma discrepância no comportamento esperado, tornava-se necessário remontar aos ascendentes dos espécimes usados na fabricação dos lotes problemáticos, e se enveredava por uma teia cada vez mais densa de pessoas, artefatos, laboratórios, variáveis condições e meios de cultura...

O Manual da vacina apresentava a genealogia das diversas subamostras empregadas no preparo de vacinas no Brasil. Essas derivações da cepa original do 17D eram identificadas por símbolos que designavam a origem e a técnica de manutenção do vírus, assim como o número aproximado de subculturas ou passagens

que havia sofrido.3 O quadro que vemos a seguir, e as informações complementares contidas no manual começaram a ser elaborados em janeiro de 1941 e sofreram revisões em 16 de abril e 27 de novembro de 1942. O quadro de derivações de subamostras ficou pronto em 17 de abril de 1943. As revisões refletem as mudanças efetuadas em decorrência da baixa da potência da vacina, do surto de icterícia e das encefalites, que levaram à implantação do sistema de lotes semente.

Derivação de subamostras do vírus 17D usadas no Brasil 4

Símbolo Descrição

17D Vírus trazido de Nova York em 1937, por H. baixa H. Smith, sob a forma de subcultura 150 da s.c. série 17D. No Rio de Janeiro, o cultivo

prosseguiu até a subcultura 243. As

subculturas 235 a 243, em tecido, foram

usadas em vacinas. Duas derivações dessa série, partindo das subculturas 200 e 190, prosseguindo em embrião, foram designadas como 17D2 Rio e 17D3 Rio.

17D2 Derivação da 17D baixa s.c. na subcultura baixa 200. Considerada especialmente s.c. interessante, porque parecia ser bastante

diferente da 17D baixa s.c.

17D3 Ramo que se desprendeu na subcultura 190. baixa Só prepararam vacina com as subculturas s.c. 196 a 219.

17DD- Importação em janeiro de 1940, de Nova NY 102 York, sob a forma de lote 102. Preparado

com a subcultura 212 (em tecido) do 17DD. As culturas em série prosseguiram no Rio de Janeiro até a s.c. 249.

17-NY Importado também em janeiro de 1940, de 104 Nova York, como lote 104, preparado com a

subcultura 223 (em tecido) de 17D. No Rio, houve quatro ou cinco passagens adicionais em embriões para produção de vacinas.

17D-NY Importado de Nova York em novembro de 310 1941, sob a forma de lotes 310, 312 e 318.

Derivação em pequeno número de

passagens seriadas em embrião de galinha da s.c. 225 do 17D.

17DD A subamostra 17DD foi trazida de Nova baixa York, em 1937, pelo dr. H. H. Smith, sob

s.c. forma de subcultura 229 da série 17DD, e de

vacina NY 41, preparada com essa mesma subcultura. No Rio de Janeiro, prosseguiram as culturas em tecido, considerando-se

como pertencentes à raça 17DD baixa as culturas compreendidas entre 229 e 255. Foi feita uma ou outra passagem por embriões em desenvolvimento, não mais do que cinco, em série, em 1937 e 1938. Mas a linha

principal foi através de culturas de tecido. Com material da mesma origem, (vacina NY 41, diretamente ou depois da passagem por embriões em desenvolvimento), foram

iniciadas, a partir de 1940, várias séries de culturas que receberam a identificação de 17DD1 a 17DD8. Toda vez que uma delas atingia a proximidade da subcultura 250, era interrompida, iniciando-se a série seguinte, com material de subcultura

aproximadamente 230. Todas essas

derivações eram consideradas como sub-raça de 17DD baixa.

17DD Os vírus das subculturas acima de 300 alta s.c. foram considerados da raça 17DD alta.

Alguns lotes de vacina foram preparados a partir de pequenas derivações (uma ou duas passagens) em embriões de galinha.

EP Vírus trazido de Nova York, sob forma de baixa material seco da subcultura 229 da série pass. 17DD. Foi mantido no laboratório do Rio de

Janeiro, in vitro, em tecido embrionário

desnervado por 14 subculturas, e depois por passagens em embriões de galinha. Vacinas começaram a ser preparadas com material proveniente da 35ª à 40ª passagem em ovo. Essa é a subamostra em uso ainda hoje em Bio-Manguinhos, já que neste intervalo, e

com esse material, foi implantado

definitivamente o sistema de lotes semente.

EP alta Material com mais de 76 passagens por pass. embriões de galinha. A série de passagens

foi interrompida na subcultura nº 150.

Quadro demonstrativo das derivações das subamostras do

vírus 17D em uso no Brasil, diferenciando as passagens feitas

em cultura de tecido das realizadas em embrião de galinha.

1941-1943. Manual da Vacina/LAFA/ Bio-Manguinhos/Fiocruz De acordo com a descrição elaborada por Penna em 1956 (pp. 70-2), há vários anos o Laboratório do Rio de Janeiro vinha usando a subcepa "EP baixa pass" ou "17 dd-low EP", devido à sua alta "imunogenicidade", ao fato de não apresentar propriedades encefalitogênicas e de não estar associada à produção de icterícia.

A adoção desta subamostra está relacionada à implantação do sistema de lotes semente, cuja finalidade, como dissemos, era manter o vírus vacinal o mais uniforme possível, limitando a um mínimo o número de passagens e, com isso, o risco de possíveis mutações. O sistema era constituído de um lote fonte, também chamado master, que, após uma passagem em ovos embrionados, dava origem a vários lotes primários, os quais, por mais uma passagem, engendravam muitos mais lotes secundários que serviam como fonte de vírus para a produção da vacina, numa última passagem pelos embriões de galinha. Assim, de 1944 até hoje, vem sendo mantido o mesmo número de passagens. Os lotes semente primário e secundário atualmente em uso correspondem, respectivamente, à 41ª e 42ª passagem em embrião de galinha, e conseqüentemente às 284ª e 285ª subculturas da cepa 17D original. Todos os lotes de vacina antiamarílica produzidos em Bio-Manguinhos correspondem à 43ª passagem em embrião de galinha e à subcultura 286 do vírus 17D original. Ver Sistema de lotessemente de febre amarela 17DD.

Se os leitores observarem o quadro das derivações das subamostras do vírus 17D usadas no Brasil, observarão que as passagens do vírus foram mantidas, durante certo tempo, dentro daqueles limites fixados em 1939 (entre subcultura 229 e 255), formando a série de oito seguimentos paralelos que o quadro identifica como "17DD low''. Dessa faixa despreendeuse a série de passagens em ovos embrionados (EP) que foi 'imobilizada' pelo sistema de lotes semente nesse novo patamar de subculturas. Até chegar-se à definitiva implantação desse sistema, durante as crises de 1939 a 1942, testaram-se várias outras subamostras trazidas de Nova York. Em janeiro de 1940, vieram os lotes 102 e 104, que foram usados em provas de campo e como 'semente' para preparar vacinas. O quadro de "Derivação de subamostras do 17D usadas no Brasil", na versão consolidada em 17.4.1943, registra como 17D-NY 310 o vírus recebido de Nova York em 21 de novembro de 1941, sob forma de lotes vacina 310, 312 e 318, preparados a partir de material derivado da vacina 88 da Colômbia. Em 1941 e 1942, os técnicos dos laboratórios nova-iorquino e carioca trocaram diversas cartas com o intuito de determinar a origem dos lotes recém-

importados.5 Pedimos licença aos leitores para resgatar detalhes desta história, para que vejam como era complexa a genealogia dos vírus utilizados no Brasil, antes de cristalizarse o sistema de lotes semente.

O lote 310 — testado, como vimos, em Guaxupé — descendia de uma subamostra do 17D denominada 17D 204. Depois de formada, continuaram a se fazer sucessivos cultivos em tecido; a 221ª passagem foi usada para inocular ovos, e o vírus colhido nestes embriões deu origem ao lote NY 75, e a uma vacina constituída de 20% de suco de embrião de galinha e 80% de soro humano normal, não diluído. Em maio de 1938, o laboratório de Nova York enviou a Bogotá 340 tubos dessa vacina. O vírus passou por mais quatro subculturas. A partir da 225ª (isto é, a 4ª na série Bogotá), foi inoculado num lote de ovos, originando-se o lote Bogotá 70, o qual, por sua vez, serviu de semente para os lotes Bogotá 88 e 90, em cuja produção foram usados 10% de embrião de galinha em suspensão e 90% de soro humano normal inativado, sem filtragem.

Em agosto de 1940, os dois lotes foram enviados a Nova York e, em janeiro de 1941, o Bogotá 88 foi semente para a produção da vacina Nova York lote 147-1, constituída de 20% de embrião de galinha e 80% de soro humano normal inativado. Este lote deu origem a diversos outros, inclusive os de número 310, 312 e 318, enviados ao Rio de Janeiro em 1941 (Manual da vacina, p. 4-B-b).

Os lotes de vacina 102 e 104, importados um ano antes, originaram-se de sementes diferentes. O primeiro proviera da subamostra 17DD-212-1E (de one egg, um ovo, em inglês). A série 17DD em cultura de tecido foi iniciada em 9 de julho de 1936, usando-se como inóculo a 196ª subcultura da amostra 17D cultivada em tecido e reidratada. As primeiras culturas do 17DD foram denominadas "17DD — 197ª subcultura" e assim sucessivamente. Essa série continuou a ser cultivada em paralelo à série original do 17D. Em 3 de setembro de 1936, a 212ª subcultura do 17DD foi congelada e dessecada. Três anos depois (13.10.1939), parte dela foi reidratada e inoculada em embriões de galinha. O vírus assim obtido chamou-se 17DD212-1E. Este lote foi dessecado e armazenado até 8 de janeiro de 1940, quando serviu como semente para a inoculação de embriões que deram origem ao lote 102.

A "vacina lote 104" ou 17D-NY 104, testada no 10º Regimento de Infantaria em Belo Horizonte, pertencia à série original de culturas do 17D. Em 18 de setembro de 1936, a 223ª subcultura foi congelada e dessecada. Em 13 de outubro de 1939, parte dela foi reidratada e inoculada em embriões de galinha. O vírus originário dessa passagem recebeu o rótulo 17D-223-1E. Em 22 de janeiro de 1940, serviu de semente para a inoculação de embriões que geraram o lote 104 (p. 4-B-b).

A adoção do sistema de lotes semente simplificou isso tudo, criando um sistema mais estável, mais fácil de controlar, com apenas duas gerações sempre ancoradas numa matriz estável por tão longo tempo que podia ser considerada quase imutável. Adotado universalmente na produção de outras vacinas, o sistema de lotes semente possibilitou muito maior controle das mutações genéticas dos vírus vacinais, da imunidade e das reações que induzem, facilitando a padronização de metodologias de produção e de controle em laboratório e em campo. Mas foi só em 1944 que a subamostra 17DD E.P passou a ser "a única empregada em vacinações", depois de novos estudos de antigenicidade feitos no Espírito Santo e no sul da Bahia, na zona do cacau, às margens da estrada de ferro que dava acesso a Ilhéus ("Relatório de atividades da Seção de Vacina", 1.1- 30.6.1944). No relatório correspondente ao período de janeiro a junho de 1945, consta que estava em curso um programa experimental em tropas do Exército, visando a comparar a antigenicidade da amostra 17D utilizada pelo laboratório de Nova York com a de um lote produzido no Rio de Janeiro pelo

sistema de lotes semente. 6 Em junho de 1946, Aguiar e Fonseca da Cunha partiram para Santos com as vacinas do Rio de Janeiro e de Nova York. Recolheram amostras de sangue de trezentas pessoas antes de vacinar duzentas com o imunizante brasileiro e cem com o norte-americano. Um mês depois, voltaram àquela cidade para colher sangue e comparar os anticorpos presentes nas duas amostras ("Resumo de atividades do laboratório" em 1946). Tudo indica que os resultados não foram muito bons, ou foram contraditórios, e em meados de 1947 amostras do soro colhido em Santos foram submetidas a novas provas de proteção no Rio de Janeiro e em Nova York, verificando-se que a imunidade obtida não era satisfatória, "tendo sido, portanto, confirmadas as conclusões a que já se havia chegado de que o vírus 17D modificou-se na sua

antigenicidade". 7

A deficiência se verificara tanto na subamostra local como naquela do laboratório da Fundação Rockefeller. Supondo que isso se devesse às passagens efetuadas durante tantos anos com o objetivo de reproduzir o vírus, os técnicos do Rio de Janeiro decidiram reviver material dessecado e preservado desde 1937. As propriedades imunizantes dessa subamostra do 17D foram testadas em Araraquara, em 150 pessoas, tendo-se colhido amostras de sangue antes e depois da vacinação para compará-las quanto ao teor em anticorpos capazes de neutralizar a ação do vírus não atenuado em camundongos e macacos ("Resumo de atividades do laboratório" em 1947).

Em junho de 1948, o laboratório do Rio de Janeiro recebeu de Nova York duas ampolas de vacina preparadas com vírus neurotrópico francês do dr. Peltier, e outras duas preparadas por Theiler, em Nova York, inoculando o mesmo vírus em embriões de galinha. Com este material, chegou a ser feito um lote de vacina "para emprego

eventual no Brasil, caso haja indicação". 8 Não consta que tenha havido.