Preparação do inóculo

Em janeiro de 1942, Henrique Penna escreveu em seu Diário (p. 1): "Durante as últimas semanas, tenho dedicado todo o meu tempo a modificações da técnica de preparação da vacina tendentes a aperfeiçoá-la". Coexistiam, então, no laboratório do Rio de Janeiro técnicas que estavam prestes a ser suprimidas e técnicas novas, que ainda não tinham suplantado completamente as antigas. O sistema de lotes semente ainda não desalojara o sistema de replicação contínua, que acabava de ser responsabilizado pelas encefalites pós-vacinais.

Cultivava-se o vírus em ovos embrionados, mas as passagens em série por culturas em tecido, in vitro, ainda constituíam fonte constante de material fresco ou dessecado para inocular em ovos e produzir vacina, requerendo, neste caso, o uso de soro humano (supostamente) normal.

O vírus necessita de células vivas para se multiplicar. Nas culturas in vitro, provinham de embriões de galinha. Depois de oito a dez dias de incubação, eram retirados dos ovos e lavados em solução isotônica de cloreto de sódio (NaCl). Eliminava-se o sistema nervoso, removendo-se a cabeça e a espinha dorsal, e cortava-se o resto do embrião em pedaços pequenos.

O vírus provinha de uma subcultura anterior. O material já infectado existente nos frascos onde ela fora feita (frascos de Erlenmeyer de 50 c.c.) era centrifugado para que os fragmentos de tecido fossem ao fundo, e se pudesse aspirar o líquido sobrenadante, repleto de vírus.

Os pedaços de embrião que iam servir à nova cultura eram imersos

num líquido formado pela mistura de solução de Tyrode 9 e 10% de soro humano normal, previamente aquecido a 56ºC, por duas horas, e em seguida filtrado através de discos de Seitz, supondo-se que isso "inativasse" qualquer microrganismo contaminante. O soro devia, ainda, ter prova de proteção negativa; não podia conter anticorpos da febre amarela, o que significa que não devia oferecer proteção alguma ao camundongo ou macaco injetado com este soro e, em seguida, com material virulento.

Filtro Seitz grande para soro ou vacina. Rio de Janeiro, 1941-

1943.

Manual da Vacina/LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz Imediatamente antes de iniciar-se o cultivo in vitro do vírus, a mistura de soro-Tyrode era filtrada através de disco de Seitz e distribuída em volumes de 4 c.c., em seis a oito frascos de cultura numerados. Com uma pipeta Pasteur, depositava-se o tecido em cada frasco e se adicionava o inóculo: 1 c.c. do líquido sobrenadante do frasco de número correspondente da subcultura anterior. Os frascos da nova subcultura eram postos na estufa de incubação, a 38ºC. Obtinha-se a maior concentração de vírus 48 horas depois, mas, na prática, as passagens duravam de três a

quatro dias.10

Quando se iniciou a produção de vacinas em grande escala no laboratório do Rio de Janeiro, adotou-se outro método de cultivo do vírus – em ovos embrionados, que descreveremos adiante. Os dois métodos coexistiam em 1942, predominando, no entanto, o segundo, que permitia obter maior quantidade de material virulento e maior concentração de vírus no líquido vacínico. Tinha muitas outras vantagens em relação ao método anterior, que além de proporcionar menor rendimento, exigia numerosas e complexas manipulações de toda a vidraria mobilizada para o cultivo do vírus, o que favorecia, inclusive, as contaminações

Em abril de 1942, data de revisão da parte do Manual da vacina correspondente a esta operação, ainda se usava "com freqüência, embora sem regularidade", vacinas não diluídas, cultivadas por ambos os métodos, como inóculos para a obtenção de novas vacinas. Para evitar que ocorressem outras mutações no vírus em decorrência das passagens seriadas em embrião, tomava-se agora o cuidado de evitar cadeias com mais de cinco passagens.

O sistema de lotes 'semente' já estava sendo implementado. Como dissemos, as múltiplas passagens, nesse caso, ficavam adstritas a apenas três patamares. O chamado "lote primário" era feito com uma vacina que envolvera o uso de soro humano nas subculturas ascendentes, mas que tivera este componente eliminado nas subculturas posteriores à escolha do lote para servir de inóculo em ovos que geravam lotes semente secundários. Estes eram usados exclusivamente como fonte de vírus para os lotes efetivamente destinados à vacinação humana. Muitos lotes secundários — no caso do 17 dd-low EP, correspondentes à 42ª passagem em embrião de galinha e às 285ª subcultura da cepa 17D original — podiam ser preparados a partir do lote primário, correspondente à passagem e subcultura imediatamente anterior. Além de evitar o uso de vírus cultivado em tecido com soro, era possível preparar um número quase ilimitado de lotes de vacina com vírus do mesmo nível de subcultura, reduzindo ao mínimo a possibilidade de que ocorressem mutações. Os lotes semente eram — e são ainda —

preparados da mesma maneira que os lotes vacina.11

Atualmente, os lotes semente secundários são submetidos aos mesmos testes que se aplicam aos lotes de vacina, e a um controle suplementar: o teste de neurovirulência e viscerotropismo em macacos suscetíveis à febre amarela, de acordo com a norma técnica estabelecida pela Organização Mundial de Saúde em

1998. 12

Durante os oito ou nove dias que antecedem a inoculação, os

ovos são analisados por transiluminação, num procedimento

chamado ovoscopia, em três oportunidades: assim que são recebidos no laboratório, no quinto dia e ao final do período de

incubação. A finalidade do exame é verificar o estado geral do

ovo e do embrião que, se não for satisfatório, resulta em descarte. Os ovos aprovados estão aptos para receber o

inóculo. Rio de Janeiro, RJ, década de 1970.