Dessecação e selagem dos tubos e ampolas

Envase da vacina. Rio de Janeiro, RJ, década de 1970.

LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

 

Dessecação e selagem dos tubos e ampolas

A rápida sucessão de técnicas experimentadas no período 1941-42 para extrair a água da vacina mostra que essa era uma das etapas mais problemáticas do processo de fabricação. Em linhas gerais, um dessecador era um recipiente fechado no qual se colocava a substância a dessecar e uma substância higroscópica — anidrido fosfórico, ácido sulfúrico concentrado, hidróxidos de potássio e sódio ou outro material que tivesse grande afinidade pelo vapor de água, sendo capaz de retirá-lo de uma atmosfera ou eliminá-lo de uma mistura gasosa. O processo era acelerado fazendo-se o vácuo no recipiente, já que num ambiente com pressão inferior à atmosférica e ausência de oxigênio, a água contida na substância a dessecar entra em ebulição mais rapidamente e numa temperatura mais baixa do que a requerida no ambiente externo. No caso da vacina, a necessidade de preservar o vírus vivo, protegendo-o do calor e de variações térmicas, exigia que a dessecação fosse feita a frio.

A técnica original descrita por Sawyer, Lloyd e Kitchen (1929, p.1-13) utilizava ácido sulfúrico e imersão em mistura de sal e gelo.

Havia uma preparação prévia. Uma hora antes, colocava-se o dessecador de vidro tipo Hempel num banho refrigerante de sal grosso e gelo. Na tampa do aparelho introduzia-se o agente de dessecação: aproximadamente 130 c.c. de ácido sulfúrico concentrado. Os tubos com vacina, por sua vez, eram congelados em banho de álcool-CO tendo-se o cuidado de movimentá-los 2,

circularmente de maneira a espalhar o material e formar uma camada uniforme. Os tubos com a vacina congelada eram arrumados num suporte e mergulhados numa camada de glicerina posta no fundo do dessecador, para que mantivessem a mesma temperatura da mistura de sal e gelo. Tampava-se o dessecador e acionava-se a bomba elétrica, até que se escutasse "a pancada característica que se nota quando o vácuo é quase perfeito" (Manual da vacina, p. 44).

 

Aparelho de dessecação da vacina, usando vácuo e ácido

sulfúrico em mesa refrigeradora. Rio de Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/ LAFA/ Bio-Manguinhos/Fiocruz

O dessecador, ainda banhado em gelo e sal, permanecia no quarto frio por 18 a 20 horas, com a bomba funcionando ininterruptamente para "compensar os pequenos vazamentos do sistema". Depois era descongelado por simples exposição à temperatura ambiente. Antes de abri-lo, introduzia-se ar previamente dessecado por passagem através de cloreto de cálcio (CaCl ). Os tubos com vacina eram 2 retirados e selados.

Para evitar o penoso trabalho de se colocar gelo e sal à volta de tantos dessecadores, construiu-se uma mesa refrigeradora, cujo tampo continha solução de cloreto de cálcio mantida a -10ºC por meio de corrente elétrica. As bases dos dessecadores ficavam imersas no líquido frio, por 24 a 48 horas. Esse método não deu resultados muito bons, porque o ácido depositado na tampa de cada aparelho ficava exposto à temperatura relativamente alta do ambiente. Quando se demonstrou que a evaporação da vacina era suficientemente rápida para que ela se mantivesse congelada durante as primeiras etapas da dessecação, abandonaram-se as tentativas de manter as bases dos aparelhos em temperatura abaixo do ponto de congelação. Pelo novo método, o material a dessecar era congelado da maneira descrita acima e colocado no dessecador, que recebera o ácido sulfúrico mas não a glicerina. Com a bomba Megavac, obtinha-se bom vácuo em vinte minutos. Os dessecadores eram levados ao quarto frio, onde ficavam expostos a-5ºC, até a hora de serem abertos. As etapas subseqüentes eram as mesmas.

Verificou-se, porém, que, na fase final, a eficiência do ácido sulfúrico era prejudicada pela diluição que sofria com a primeira água desprendida pela vacina. Fez-se, então, outra modificação na técnica. A dessecação passou a ser interrompida depois de 24 horas para que o ácido semidiluído fosse substituído por ácido novo, concentrado. Tampavam-se os dessecadores, refazia-se o vácuo e os aparelhos eram levados de volta ao quarto frio, por mais 24 horas. Esse processo dava bons resultados quando os volumes a dessecar não ultrapassavam 40 c.c. por dessecador. Para quantidades maiores, era necessário usar tantos aparelhos que se tornavam inevitáveis as variações, às vezes grandes, no grau de dessecação num mesmo lote de vacina.

Após a filtragem e distribuição da vacina em ampolas, processa-se o congelamento num banho de álcool em

temperatura muito baixa, obtida com neve carbônica. As

ampolas com a vacina congelada são transferidas para os dessecadores que operam com vácuo e ácido sulfúrico na mesa exibida na página anterior. A dessecação, imperfeita,

demora de 24 a 48 horas.

Filme Preparação da vacina da febre amarela/Coc/Fiocruz

Em 1940, foi adotado, com algumas modificações, o método descrito por Bauer e Pickles (1940, pp. 83-8) — dessecação com condensador de baixa temperatura e óxido fosfórico (P O )— que 2 5 permitia processar grandes volumes de vacina uniformemente, utilizando-se um único aparelho.

Modelo de dessecador que substituiu o anterior, de alumínio

invertido, medindo 38 x 39 cm, com tampa torneada em

duralumínio, contendo as ampolas com vacina e os tampões de

algodão. Do lado de fora, vê-se o suporte que recebe a

substância higroscópica (óxido fosfórico). Rio de Janeiro, RJ,

1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

O novo dessecador era um caldeirão de alumínio medindo 38 x 39 cm, com tampa torneada em duralumínio. O fechamento hermético era obtido por pressão atmosférica, quando se fazia o vácuo no seu interior. As ampolas eram arranjadas em bandejas de cobre, radialmente, com as aberturas voltadas para o centro. O dessecador comportava dez bandejas superpostas, com cerca de trinta ampolas cada, perfazendo trezentas ampolas. Os tubos de 16 x 100 também eram dispostos radialmente, mas em bandejas diferentes, cabendo 450 no dessecador. Tubos de 75 x 10 mm eram montados verticalmente no fundo do aparelho, e neste caso cabiam quinhentos.

No interior do dessecador, as ampolas são dispostas

radialmente em bandejas de cobre, com a abertura dirigida para

o centro. Para tubos de 16 x 100 mm, como os mostrados na

imagem, a capacidade do dessecador é de 450 tubos. Rio de

Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/ Bio-Manguinhos/Fiocruz

No centro dos anéis com tubos ou ampolas era introduzido um suporte especial com seis tampas de placas de Petri superpostas contendo óxido fosfórico (P O ), substância usada no final da 2 5 dessecação.

Para tubos de 10 x 75 mm, a capacidade de dessecação

aumentava para quinhentas unidades, montadas verticalmente

no fundo do dessecador. Rio de Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

O condensador desempenhava papel importante. Era um cilindro metálico (63 x 10 cm), com tubos de entrada e saída, que ficava mergulhado numa grande "garrafa térmica" tampada contendo mistura de álcool e neve carbônica. Sua função era reter a umidade dos gases que atravessavam aquele cilindro, já que ela condensava, ao entrar em contato com suas paredes geladas. Isso valia tanto para o vapor de água despreendido pela vacina como para os gases que tinham de ser introduzidos no dessecador, na hora de desfazer o vácuo, em substituição ao ar atmosférico carregado de umidade.

O condensador, cilindro metálico medindo 63 x 10 cm, é

mergulhado numa grande "garrafa térmica" tampada, contendo

a mistura de álcool e neve carbônica. Os tubos de entrada e saída do condensador são ligados ao dessecador e à bomba de

vácuo. Sua função é condensar a humidade do gás introduzido

no desse cador. Rio de Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/ Bio-Manguinhos/Fiocruz

Dessecador, condensador, duas bombas de vácuo Cenco-Megavac e outros componentes do aparelho estavam montados num carro de madeira para facilitar o transporte nas diferentes etapas do processo. Este principiava com o congelamento da vacina. À medida que se enchiam os tubos e ampolas, eram colocados em suportes especiais para imersão em banho congelante de álcool-CO , a -75ºC. Não existia, ainda, a máquina com rolos para girar as 2

ampolas, e assim o operador tinha de agitá-las, circularmente, para que o conteúdo solidificasse em camada fina. Isso facilitava depois a reidratação. Enquanto outro operador arrumava os tubos ou ampolas com a vacina congelada no dessecador, este era mantido em neve carbônica dentro de uma caixa de madeira insulada, para que o material não degelasse.

O dessecador era retirado da caixa insulada, tampado e conectado ao condensador. Acionavam-se as duas bombas de vácuo, que produziam a pressão desejada em uma hora, permanecendo ligadas até o dia seguinte. Enchia-se, então, o dessecador com ar que antes atravessava o condensador, deixando nas paredes grande parte de sua umidade, retiravase a tampa e se introduzia aquele suporte com os recipientes que continham o óxido fosfórico. O aparelho era fechado de novo — tudo isso com muita rapidez — e as bombas voltavam a funcionar. Ao cabo de seis horas, renovava-se o óxido fosfórico, e só na manhã do segundo dia o processo chegava ao fim. Antes de abrir pela última vez o dessecador, injetavase nele azoto dessecado por lenta passagem através do condensador, que cumpria sua função por estar imerso na mistura gelada de álcool-

CO 19 . 2

Hoje, introduz-se nitrogênio ultrapuro e estéril nos liofilizadores industriais de alto vácuo, ao final do processo de desidratação da vacina, por congelação brusca a baixa temperatura seguida de rápida evaporação no vácuo. Os frascos, que contêm o pó fino, muito higroscópico, em que "vegetam" os vírus vivos são tampados com as rolhas de borracha butílica revestidas de silicone, e lacrados com selo de alumínio, antes de serem armazenados em câmara fria, entre 2ºC e 8ºC.

Montagem dos aparelhos — bomba Megavac, dessecador e

garrafa térmica que contém o condensador — para o início da

operação de dessecação. Rio de Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/ LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Caixa termicamente isolada para evitar o degelo da vacina

antes do início da dessecação. Rio de Janeiro, 1940.

The Organization and Detailed Procedures of the Vaccine Division of

the Yellow Fever Laboratory/LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Ampolas com vacina arrumadas para a dessecação. Década de

1970.

Álbum LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

A selagem dos tubos e ampolas com vacina que acabava de ser dessecada era um processo muito complicado e vulnerável nos anos 1940. Dois ou três operadores tinham de trabalhar muito rápido para que a vacina, altamente higroscópica, não absorvesse a umidade do ar durante o tempo decorrido entre a abertura do dessecador e o fechamento dos tubos ou ampolas. Primeiro, eram arrolhados com cortiça, mas sem se retirarem as mechas de algodão colocadas logo em seguida à distribuição da vacina pelos recipientes. Arrumados em suportes com capacidade para cinqüenta tubos ou 42 ampolas, passavam para as mãos de outro operador, que aplicava a chama de gás-oxigênio. Antes de obturar o recipiente, tinha de remover a rolha de cortiça e puxar a mecha de algodão, mas só até a extremidade, de modo a bloquear a entrada de ar com oxigênio e umidade.

Fechamento ou selagem das ampolas com maçarico. Com um

esmeril, grava-se em cada recipiente a data e o número do lote da vacina correspondente. Rio de Janeiro, RJ, década de 1940.

Filme Preparação da vacina da febre amarela/Cinemateca Brasileira

Tubos e ampolas eram marcados com o número e letra do sublote a

que pertenciam. 20 Antes de serem armazenados no "quarto frio", separavam-se o primeiro e último recipiente fechado para se fazer o teste que determinava a presença de água residual.

Após a Segunda Guerra Mundial, com a normalização do comércio internacional e a reconversão da indústria norteamericana para fins pacíficos, foram introduzidos vários melhoramentos na aparelhagem utilizada pelo laboratório. Durante o ano de 1947, foi adquirida uma geladeira para preservação do vírus a -30ºC, uma autoclave para esterilização da vidraria e ferramental utilizado na preparação da vacina. A preparação de solução fisiológica tornou-se uma "seção", com sala própria. Dos Estados Unidos importou-se ainda um dispositivo para abrir maior número de ovos na hora de retirar os embriões infectados, e um novo dessecador, que entrou em operação já em agosto de 1946. Um ano depois, começou a ser usado aquele sistema de distribuição que enchia ampolas a cada "pedalada". A instalação, em 1948, de uma câmara frigorífera para preservação da vacina, depois de preparada, à temperatura de-25ºC completou "a série de medidas idealizadas com o fim de melhorar a técnica de preparo da vacina. ... Com esses dois melhoramentos, a secagem mais perfeita da vacina e sua conservação a temperatura mais baixa, acredita-se seja possível no futuro fabricá-la somente durante a época do ano em que há menos dificuldade de obtenção de ovos embrionados, formando assim um estoque que será utilizado até que chegue novamente à época favorável, que é durante os meses menos quentes do ano" ("Resumo das atividades do laboratório" em 1948).

"A partir do lote nº 970, a vacina está sendo dessecada por processo diferente do que vinha até aqui sendo adotado" — escreveu Penna em outubro de 1948 (ibidem). Com o equipamento utilizado a partir de então, certamente aquele descrito em 1956, o vácuo produzido mais eficientemente constituía o principal agente físico do processo de dessecação, subdivido, agora, em dois estágios, que não requeriam mais o uso de dessecante químico.

Dessecador da vacina, fechado com tampa de alumínio e ligado

 

por meio de grosso tubo metálico ao condensador que está

mergulhado em álcool refrigerado no segundo recipiente. Rio

de Janeiro, RJ, 1946.

Manual de Instruções Técnicas e Administrativas do Serviço

Nacional de Febre Amarela/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Suporte contendo tubos de vacina para os introduzir em uma

câmara metálica que contém álcool mantido em baixa

temperatura graças a um refrigerador elétrico especial. O

objetivo da operação é dessecar a vacina em estado congelado,

para garantir a concentração e eficiência do vírus vacínico. Rio

de Janeiro, RJ, 1946.

Manual de Instruções Técnicas e Administrativas do Serviço

Nacional de Febre Amarela/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Vista geral da sala de dessecação, onde se observa um lote de

vacina no estágio final do processo (à esquerda), enquanto as

ampolas de outro lote estão sendo congeladas para serem

colocadas no dessecador resfriado. Rio de Janeiro, RJ, 1956.

Penna, 1956, p. 84

O dessecador era de ferro e bem maior: 45 cm de diâmetro e 75 cm de profundidade. Álcool gelado na unidade frigorífica circulava numa serpentina de cobre pela parte externa da câmara dessecadora, garantindo o frio necessário para a conservação do vírus vivo. Uma camada de isolante térmico coberta por fina folha metálica ajudava a conservar ambiente propício àquela operação bioquímica. O dessecador era conectado por um tubo de metal ao condensador, muito parecido com aquele usado em 1942: um cilindro de latão, fechado na base, com duas aberturas na parte superior, uma para a conexão com o dessecador; a outra dando passagem a um tubo que ligava o condensador à bomba de vácuo, uma Hypervac fabricada pela Central Scientific Company, de Chicago.

Detalhe da mão do operador no momento em que fecha as

 

ampolas nas "árvores" ou "cachos", com maçarico de fogo

cruzado. Rio de Janeiro, RJ, 1956.

Penna,1956, p. 86

A temperatura do dessecador era regulada para -10ºC, mas quando se obtinha o vácuo e não havia mais risco de degelar a vacina, podia subir vagarosamente. A dessecação prossseguia noite adentro, funcionando a bomba de vácuo sem parar. O condensador — no texto de 1956 chamado também de cold trap, armadilha fria — era mantido a -80ºC por imersão no álcool proveniente da unidade frigorífica (Penna, 1956, pp. 82-4).

Esse era o primeiro estágio do processo. No dia seguinte começava o segundo: tratava-se de remover qualquer umidade que pudesse ser absorvida da atmosfera pela vacina seca desde a abertura do dessecador até a selagem das ampolas. Eram usadas, então, estruturas tubulares verticais também chamadas de 'árvores' ou manyfolds, um tubo de cobre de 7,5 cm de diâmetro e 75 cm de comprimento, montado numa base pesada de metal para ter estabilidade, com 204 saídas dispostas radialmente. Cada saída era um segmento de tubo de cobre soldado à abertura perfurada no tubo principal. As ampolas eram afixadas a essas saídas por meio de tubos de borracha lubrificados com óleo de rícino. Cinco "árvores" davam conta de um lote de vacina usual, isto é, cerca de mil ampolas.

Através de tubos de metal e juntas de borracha, as estruturas tubulares eram conectadas ao condensador, à bomba de vácuo e a um manômetro de McLeod, processando-se a dessecação em escala menor, em cada recipiente de vacina, através das mechas de algodão que não haviam sido removidas dos gargalos das ampolas. O processo era concluído somente no dia seguinte. O vácuo era interrompido pela introdução de nitrogênio seco, e as estruturas tubulares, removidas para o lugar onde as ampolas eram seladas

com um maçarico de oxigênio de dupla chama.21 Depois de inspecionadas e numeradas, eram armazenadas a -25ºC.

No novo processo, são usadas ampolas de feitio diferente —

escrevia Penna em 1948 — que permite serem elas seladas

com maçarico enquanto ainda ligadas ao aparelho de

dessecação ... Pelo processo até então empregado, embora

fosse facilitada a secagem da vacina distribuída em grande

número de ampolas contendo pequeno volume em cada uma,

não era possível obter água residual abaixo de 1%, medida pelo

processo do P O no vácuo. Muitas vezes mesmo essa unidade 2 5

residual chegava até 2% ... Pelo novo método, consegue-se

com facilidade um teor de água residual de 0,5 %, na maioria

das vezes, chegando-se mesmo a obter valores bem abaixo

desse.

Fechamento das ampolas nas "árvores" ou "cachos". Rio de

Janeiro, 1966.

Álbum LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Um dos testes de rotina do laboratório de febre amarela tinha por objetivo determinar a água residual presente na vacina após a dessecação, já que ela encurtava o tempo de conservação do vírus, especialmente quando a vacina era levada a campo. O teste era feito com o material contido no primeiro e último tubo ou ampola selados de cada lote que se fabricava. Em linhas gerais, consistia em verificar-se o peso perdido por essas amostras quando submetidas à temperatura de 110ºC durante certo tempo. Em 1941-42, as vacinas feitas com 100% de soro davam de 1% a 11,2% de umidade. Aquelas feitas com 50% de soro ou com suco de embrião não diluído apresentavam umidade residual de 2% a 2,5%. Lotes feitos com 40% de extrato aquoso de embrião deram 5% a 6% de umidade. Os motivos para estas variações não eram bem conhecidos na época. Supunha-se que estivessem relacionados à "quantidade de material gorduroso volátil que é proporcionalmente maior nos extratos de embrião do que no soro humano" (Manual da vacina, p. 70).

O primeiro cuidado a tomar-se era evitar a presença de água residual nos frasquinhos usados no testes. As amostras de vacina seca eram desagregadas, transferindo-se rapidamente o conteúdo do tubo ou ampola para os frascos de teste, que eram tampados e pesados. A diferença entre o peso atual e o do frasco vazio era o peso inicial da amostra. Os frascos, destampados, eram postos em cubas de vidro e introduzidos no forno de secagem, por 18 horas. Esperava-se que o material atingisse a temperatura ambiente para se pesar novamente os frascos, "o mais depressa possível". A perda ocorrida durante o aquecimento representava o peso da água expelida, e era usada para calcular a percentagem de umidade contida originalmente na amostra. Durante o teste, as manipulações tinham de ser feitas com muita rapidez, e sempre com pinças protegidas com borracha, para evitar a interferência da umidade do ar e dos dedos. Era preciso, inclusive, determinar, verificar a todo momento a umidade relativa da atmosfera, pois variações acentuadas podiam comprometer os resultados.