A vacina em cultura de tecido

O projeto de Souza Lopes, na realidade, era mais ambicioso. Procurou desenvolver a nova tecnologia de produção da vacina antiamarílica, substituindo o cultivo do vírus em ovos embrionados pelo cultivo em células, in vitro. Contou com o apoio financeiro e material da Organização Pan-Americana de Saúde e do International Development Research Centre, uma instituição pública criada pelo Parlamento do Canadá em 1971 com o objetivo de "auxiliar pesquisadores e comunidades no mundo em desenvolvimento a encontrar soluções para seus problemas sociais,

econômicos e ambientais" (www.idrc.ca).

Segundo Halstead (1998, p. 237), as agências internacionais de saúde faziam forte pressão para que os produtores mudassem para o novo substrato biológico.

Como vimos, a adaptação das subamostras em uso do vírus 17D à cultura de células foi uma das principais recomendações feitas pelo Simpósio Internacional sobre Febre Amarela, realizado em Belém, em abril de 1980, e o tema central da reunião de especialistas realizada em Washington, em fevereiro de 1984. Previa-se que a nova tecnologia teria diversas vantagens sobre a tradicional. Seria mais segura, pois permitiria eliminar os vírus da leucose e de outras doenças aviárias, e as proteínas animais presentes no ovo, que provocavam reações alérgicas em certas pessoas. Seria também mais barata (um ovo embrionado S.P.F., por exemplo, custava aproximadamente um dólar) e mais veloz, permitindo, assim, grande

aumento na produção da vacina a um custo muito menor. 78

Os especialistas presentes em Washington reconheciam, no entanto, que o desenvolvimento da nova tecnologia enfrentaria problemas complexos. Estavam em curso estudos visando a obter uma vacina contra o dengue, e eles mostravam que a adaptação de vírus atenuados e já caracterizados a novos substratos celulares (neste caso, pulmão de fetos de rhesus) podia resultar em significativas mudanças em sua biologia e comportamento. O vírus da rubéola, que não era reatogênico para crianças, após 77 passagens em células primárias de rim de macaco verde africano (Cercopithecus callitrichus), readquirira sua virulência com apenas algumas passagens em células primárias de rim de cachorro (Halstead, 1988, pp. 236-7). A própria experiência brasileira com a vacina contra a febre amarela tinha demonstrado, em 1939-42, quão instável era o vírus antes da adoção do sistema de lotes semente.

Outra dificuldade residia na inadequação dos "marcadores biológicos" usados para aferir a segurança e imunogenicidade das vacinas antiamarílicas. As novas sementes desenvolvidas a partir da cultura em células teriam de ser extensamente testadas em rhesus e camundongos, mas as reações clínicas, sorológicas e de comportamento desses animais à ação do vírus, e as lesões post mortem já não constituíam critérios tão precisos para especialistas que abordavam a questão do ponto de vista da biologia molecular, histoquímica e genética dos anos 1980. Assim, concomitantemente ao desenvolvimento de vírus semente adaptados à cultura em células, seria necessário explorar o potencial de novos marcadores in vitro e in vivo, confiáveis e reprodutíveis, menos onerosos técnica e financeiramente, para monitorar mudanças que pudessem ocorrer na virulência e neurotropismo do vírus a cada passagem pelo novos substratos.

Os investigadores que iam se dedicar ao desenvolvimento da nova tecnologia teriam de levar em conta certas recomendações. O substrato devia consistir em células de embrião de galinha sem cabeça, com nove a doze dias de idade, ou células diplóides de outra procedência, desde que atendessem às exigências da OMS no tocante à contaminação e que já houvessem sido utilizadas na preparação de vacinas feitas com vírus vivos atenuados. O inóculo original seria uma derivação do 17D livre do vírus da leucose aviária.

Os protocolos de pesquisa teriam de especificar os procedimentos usados para desagregar as células e convertê-las em placas; os nutrientes, meio e ph que permitiram manter as placas celulares, o tempo de incubação até se inocular nelas o vírus, as características de seu crescimento naquele substrato, especificando-se multiplicidade da infecção, temperatura de incubação, tempo e número de colheitas de vírus.

Os protocolos de produção deviam especificar métodos usados para incrementar o rendimento das colheitas e controlar a estabilidade genética do vírus, assim como as técnicas destinadas a assegurar a estabilidade térmica do produto durante as etapas de clarificação,

armazenagem do 79 bulk e liofilização da vacina.

Na comunicação apresentada ao Simpósio Internacional sobre Febre Amarela e Dengue, realizado na Fiocruz, em maio de 1988, Souza Lopes (1988, p. 253) declarou que "basicamente, as etapas de produção seguiram as linhas determinadas pela produção da vacina contra o sarampo". A tecnologia transferida pelos japoneses facilitara "em muito a obtenção das células necessárias, assim como seu controle".

Naqueles vidros em forma de garrafa deitada, de fundo chato e boca inclinada que se vêem nos laboratórios de cultura de células, Souza Lopes (1988, p. 253-4) cultivou o vírus daquela subamostra do 17 D fornecida pela OMS, isenta de leucose aviária — lote semente 213/77 Br. — em monocamada de fibroblastos primários de embrião de pinto, que são células primárias, ou jovens, muito plásticas do tecido conjuntivo, responsáveis pela formação de tecido fibroso e de material intercelular amorfo.

A primeira etapa da pesquisa consistiu na obtenção do meio de manutenção adequado para as células e o vírus. O soro fetal bovino, usado a princípio, foi substituído pelo meio 199, acrescido

de uma mistura de insulina, transferrina e selenito de sódio. 80 A incubação do vírus no substrato celular deu resultados variáveis conforme a temperatura. A 37ºC, a titulação mais elevada ocorria no terceirodia; a 29ºC, o melhor resultado se alcançava somente no quinto ou sexto dia; a 25ºC, a titulação era muito baixa. A estabilidade do produto foi testada em três ciclos de congelamento e descongelamento. O uso do meio 199 sem estabilizador resultava em queda acentuada no título; com estabilizador feito à base de sacarose e glutamato de sódio, se obtinha resultado similar ao daquele meio combinado com soro fetal bovino.

Souza Lopes produziu três lotes experimentais de vacina. Os resultados foram homogêneos quer em relação às titulações feitas por plaqueamento em células vero, quer no tocante às perdas observadas durante a liofilização. Os lotes satisfizeram os padrões internacionais em todos os testes, inclusive o de termoestabilidade e umidade residual.

Renato Marchewsky, do Departamento de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos, fez os testes de neurovirulência usando macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) recebidos do Hazleton Research Primates nos Estados Unidos — dez macacos por teste. Depois de serem inoculados intracerebralmente com a vacina experimental e

com as vacinas controle,81 cada animal foi observado por trinta dias, registrando-se, diariamente, a temperatura retal e o escore clínico, graduado segundo quatro níveis correspondentes à gravidade da lesão causada pelo vírus: fraqueza, paralisia parcial, paralisia incompleta e, por fim, quando o animal já se achava no fundo da gaiola, totalmente apático, "paralisia completa e flácida", podendo chegar à morte. Ao trigésimo dia, se isso não houvesse acontecido, era sacrificado. Faziam-se vários cortes e se preparavam as lâminas para a avaliação histopatológica das lesões produzidas no sistema nervoso central. Marchewski (1988, p. 251) observou

soroconversão satisfatória em todos os experimentos. As

vacinas em cultivo celular apresentaram níveis mais altos de

viremia que as vacinas controle. Nenhum sinal clínico de

encefalite foi observado nas vacinas experimentais, assim como

hipertemia. A temperatura retal jamais excedeu 40ºC. A

interpretação dos resultados histopatológicos revelou que as Segundo Guillermo Contreras (1988, p. 239), chefe da Divisão de Produtos Virais do Department of Health and Welfare do Canadá, os aspectos relativos ao controle da vacina feita em cultura de tecido foram debatidos por representantes da OPAS, do IDCR e de Bio-Manguinhos numa reunião na Fiocruz, em março de 1985. Ficou estabelecido que os testes de neurovirulência e de marcadores genéticos seriam confirmados por laboratórios externos. Amostras dos lotes preparados por Souza Lopes chegaram a ser enviados para o National Institute of Health, em Bethesda, Estados Unidos, onde foram testados pelo dr. Paulo Albrecht. A informação foi dada por Fonseca da Cunha, na época do Simpósio Internacional sobre Febre Amarela e Dengue, que também debateu as possibilidades de uma vacina contra o dengue, doença que constituía assunto novo no Brasil.

vacinas experimentais em cultivo celular apresentaram índices

de severidade satisfatórios, diante das vacinas controles.

Concluímos que os lotes experimentais ... estão aprovados

quanto à imunogenicidade e neurovirulência, em comparação

com os padrões internacionais.

Marcos Freire (entrevista, 22.03.2001) considera que o desempenho do produto desenvolvido por Souza Lopes foi superior ao da vacina tradicional de Bio-Manguinhos. O dr. Scott B. Halstead, da Fundação Rockefeller, que temia mutações perigosas no vírus vacínico, recebeu com alívio os resultados apresentados por Marchewsky. Considerou, também, notável o resultado da comparação entre as vacinas produzidas em ovos embrionados e

em cultura de tecido de embrião de galinha.82

O rendimento da nova técnica foi 15 vezes superior ao da técnica tradicional: enquanto esta gerava trezentas doses de vacina por cada ovo inoculado, Souza Lopes (1988, pp.253-4). conseguiu 4.500 doses por fibroblastos extraídos de cada embrião. Contudo, o consumo de inóculo era muito alto. Este foi o grande problema da técnica desenvolvida por Souza Lopes. Um lote semente secundário, que poderia alimentar por dez anos a produção de vacinas em ovos embrionados, acabaria em menos de um ano na cultura de células, porque esta requeria quantidade muito maior de vírus no inóculo inicial. Quando se testam os vírus de referência da vacina, têm de ser usados vinte macacos rhesus, que custam hoje, aproximadamente, três mil dólares cada. Com uma técnica de baixa produtividade por lote semente, o investimento se torna proibitivo (Maria da Luz F. Leal, entrevista, 04.02.01, fita 2, lado A).

George French, consultor da OMS, chamado para avaliar o projeto, confirmou que seria economicamente inviável a produção industrial da vacina por aquela técnica. Suas potencialidades anularam-se temporariamente, em virtude da morte prematura de Souza Lopes, em 1988, sem deixar assistente que estivesse em condições de dar continuidade ao projeto.

O mais importante parceiro de Bio-Manguinhos nesta série de inovações ocorridas no Laboratório de Febre Amarela durante os anos 1980 foi o já mencionado International Development Research Centre, do Canadá. O projeto nº 820225, que começou a dar apoio, material e financeiramente, a partir de 5 agosto de 1983, fundamentava-se na suposição de que na "América Latina, as condições ecológicas são tais que uma epidemia [de febre amarela] ... devastadora pode irromper a qualquer momento". Os recursos destinavam-se à modernização das vacinas produzidas pela Fiocruz e pelo Instituto Nacional de Salud. O laboratório colombiano não correspondeu às expectativas do projeto, interrompendo-se a ajuda do IDRC em outubro de 1986.

Na avaliação de Lawrence Gelmon, supervisor do IDRC, os pesquisadores brasileiros liderados por Souza Lopes concentraram-se na melhoria da estabilidade térmica da vacina, nos estudos sobre a vacina reconstituída e no desenvolvimento de técnicas de controle de sua qualidade. Verificaram que a sacarina e o glutamato de sódio protegiam a vacina e aumentavam seu tempo de estocagem. Também testaram a estabilidade do vírus em amostras de vacina reconstituída com vários diluentes. Verificaram que a água destilada era o diluente mais eficaz, conservando a potência da vacina por até seis horas depois que era reconstituída. Tinham conseguido desenvolver um método de titulação que aperfeiçoava o controle da qualidade da vacina (Lopes, Guimarães e Carvalho, 1987, pp. 323-9). Segundo Gelmon, ao elevar os níveis de produção e prolongar o tempo de estocagem e de vitalidade da vacina, os pesquisadores de Bio-Manguinhos tinham conseguido assegurar estoques suficientes para enfrentar as epidemias rurais e urbanas que todos temiam