Titulação

Cuba de vidro com frascos de pesada utilizada para

determinação da água residual presente em amostras da vacina

dessecada. Rio de Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Titulação

"Além das provas bacteriológicas para controle de esterilidade", — lê-se em Bicca (1988, pp. 162-3) — "procediase à titulação de cada lote de vacina para prova de concentração de vírus mediante a inoculação intracerebral em camundongos brancos. Uma amostra de cada lote também era inoculada ainda em macaco rhesus, para se verificar qualquer possível aumento do seu viscerotropismo ou neurotropismo".

Em três momentos do processo de fabricação da vacina, — por ocasião da abertura dos ovos para a retirada dos embriões, após a distribuição do líquido vacínico pelos tubos e ampolas e imediatamente após a dessecação — e em sete momentos durante a armazenagem — um, três, seis, nove, doze, dezoito e vinte e quatro meses — era preciso verificar em que estado se encontravam os vírus, que deviam permanecer vivos e com potência suficiente para suscitar no indivíduo vacinado a produção de anticorpos. As operações manuais, químicas e mecânicas, e as condições ambientais podiam danificar a população de vírus existente no meio líquido ou dessecado da vacina.

Chamava-se dosagem ou titulação o controle da vitalidade e potência dos vírus. Em função dela, calibrava-se a diluição em que a vacina ia ser empregada, de maneira a não conter vírus vivos a menos, tornando-se, assim, incapaz de produzir a imunidade, nem vírus demais, que pudessem suscitar reações danosas no homem.

A dosagem ou titulação consistia, essencialmente, no estabelecimento de uma correlação entre determinada diluição do material viral e determinada percentagem de mortes de camundongos inoculados com este material. Havia uma técnica padrão a seguir, mas o rigor de sua execução, por si só, não garantia a qualidade do resultado. A habilidade e intuição do operador eram essenciais, tanto que o Manual da vacina (pp. 47A-48) especificava: "dosagens ... só serão feitas por pessoas designadas pelo chefe da seção, porque não se conseguem resultados uniformes com essa técnica senão com bastante experiência".

Usava-se o conteúdo de uma ampola ou dois tubos com vacina dessecada. Os recipientes eram abertos, com precauções de assepsia, e se reidratava a vacina com solução salina fisiológica, em temperatura ambiente, e de novo, com muita rapidez, para que o pó não absorvesse umidade atmosférica. Adicionava-se a solução fisiológica em volume tal que desse uma diluição inicial de 1:10. Somente depois que se obtinha uma mistura bem homogênea, começavam a ser feitas as diluições em série. Em 1941-42, isso era feito com soro humano normal ou de rhesus diluído a 1:10 em solução salina fisiológica; em 1956, só se usava o soro fisiológico (NaCl).

Adicionavam-se, então, nove partes desse diluente à vacina reidratada, obtendo-se a proporção 1 para 10. Tomava-se esse material diluído uma vez como unidade, e se acrescentavam nove partes iguais de diluente: obtinha-se agora a proporção 1:100. A operação era repetida cinco ou seis vezes, chegando-se às diluições um (de material virulento) para cem mil ou um milhão (de partes de diluente). Certa quantidade de cada diluição era injetada em camundongos — em 1942, três grupos de seis camundongos; em 1956, 12 animais. No primeiro patamar de diluição, com o vírus ainda bem concentrado, morriam todos. No patamar seguinte, morriam menos. Segundo o Manual da vacina (p. 48), o end point devia ser bem ultrapassado, sobrevivendo todos ou, pelo menos, quase todos os camundongos na última diluição.

Em acacos rhesus são testadas vacinas preparadas no laboratório. A inoculação de vacina, cerca de 0,5 c.c., é

realizada em plena massa encefálica após a anestesia do

animal, a raspagem da região frontal e sua desinfecção. Munido

de um bisturi, o operador abre passagem para a agulha, nessa

parte do crânio. Ao final do procedimento, o orifício é fechado com uma gota de colódio. Rio de Janeiro, RJ, década de 1940.

Filme Preparação da vacina de febre amarela/Cinemateca Brasileira

Importava-se da Índia centenas de rhesus (Macaca Mullata), muito caros. Em 1935, Henrique Aragão obteve a cessão da ilha

do Pinheiro, fronteira ao Instituto, para uma colônia desses

animais e de espécies brasileiras como Cebídeos e Hapalídeos.

Na "ilha dos Macacos", absorvida depois pela do Fundão,

funcionou uma Estação de Hidrobiologia. Com o progressivo

aterramento e a ocupação desordenada daquele trecho da Baía

de Guanabara, os macacos foram transferidos para as gaiolas

da Primatologia, no campus de Manguinhos, em 1980. Rio de

Janeiro, RJ, 1972.

Foto: Luís Alberto e Pedro Paulo Koellreutter. "Manguinhos: a luta

contra os inimigos invisíveis". Manchete, 19.08.1972, p. 93-8.

A inoculação dos camundongos, por via intracerebral, requeria cuidados muito especiais. Era nesse momento, sobretudo, que contava a experiência do operador. Pequenas variações de técnica, relacionadas principalmente ao lugar e à profundidade da inoculação, podiam causar diferenças muito grandes no tempo de incubação ou na mortalidade dos camundongos inoculados. Quando estudava a susceptibilidade comparativa de camundongos recém-nascidos, micos e pintos à infecção com o vírus da febre amarela, a dra. Mary B. Waddell ressaltou a importância desse "fator pessoal", que era "de conhecimento geral, mas não no grau manifesto. Verificou-se, com surpresa, que o bom inoculador pode perder o dom, e que aparentemente esse caso de mudança do local escolhido para a inoculação poderá resultar na manifestação de mais alto teor de vírus" ("Relatório anual do Laboratório de Transmissão da Seção de Febre Amarela").

Segundo a técnica padrão descrita em 1942, usava-se uma seringa tipo tuberculina com agulha de meia polegada e calibre 25. Enrolava-se arame fino de cobre na agulha, até exatamente 2 mm da ponta, para assegurar profundidade uniforme de inoculação. Com uma das mãos, o operador segurava o camundongo previamente anestesiado com éter; a seringa, na outra mão, perfurava o crânio perpendicularmente, num ponto situado precisamente a 2mm da linha mediana e 3mm para trás do olho. O volume inoculado era sempre 0,03 c.c., "cuidadosamente medidos". Num cartão, era registrada a evolução do estado do camundongo, desde a paralisia até a morte por encefalite, que em geral ocorria 21

dias após a inoculação. 22

Inoculação intracerebral em camundongos. Cada amostra de

vírus é injetada em seis camundongos. Nas três semanas

seguintes à inoculação, os camundongos adoecem, tornam-se

paralíticos e morrem dependendo da virulência do produto

injetado. Rio de Janeiro, RJ, década de 1940.

Filme Preparação da vacina de febre amarela/Cinemateca Brasileira

"O título duma vacina é a recíproca da diluição que mataria 50% dos camundongos inoculados", segundo o método estatístico de Reed e Muench (1938, pp. 493-7). Como se calculava a dose letal para esses 50% dos camundongos? Suponhamos que estivesse entre um para cem e um para mil. Suponhamos, então, que fosse um para quinhentos. Assim, dividindo-se o concentrado viral em quinhentas partes de diluente, morriam 50% dos camundongos, o que significava dizer que aquela quantidade de concentrado continha quinhentas doses. Mas o cálculo não terminava aí, pois o volume inoculado em cada camundongo era sempre 0,03 c.c.

Para chegar-se ao título da vacina para uso humano, era preciso multiplicar o título baseado nesse volume por um fator matemático, que dava o número de DML — letal doses for mouse, ou doses letais para o camundongo — por centímetro cúbico de vacina. E se multiplicava pelo fator 16,6 para calcular-se o número de DML por tubo com capacidade para 0,5 cc de vacina dessecada. Posteriormente, passou-se a usar a sigla LD — que significa 50 doses letais para 50% dos camundongos.

Segundo os padrões internacionais estabelecidos em 1944 para a

fabricação e controle da vacina contra a febre amarela, 23 a quantidade mínima de vírus ativo para a imunização satisfatória do homem era de 500 LD — depois passaria a ser 1.000 LD . No 50 50 laboratório do Rio de Janeiro, adotou-se como dose mínima aquela que continha 1.000 LD , quando se usavam vacinas com diluição 50

de 1:100. Empregavam-se apenas duas diluições em campo 1:100 ou 1:50, que reduzia à metade o número de doses no tubo (de duzentas para cem), para compensar eventual queda na concentração de vírus vivos em conseqüência de exposição excessiva à temperatura ambiente. Se o título não permitisse que um lote fosse usado nessa diluição, ele era considerado impróprio para uso em campo. As concentrações de vírus obtidas pelos

métodos usados no laboratório eram no entanto muito superiores.24 Segundo tabela apresentada por Penna, na descrição de 1956 (p. 87), vinte lotes "típicos" de vacina preparados no Instituto Oswaldo Cruz davam, em média, títulos de 1:232,000 e 1:126,000, antes e depois da dessecação, que reduzia quase à metade a potência da vacina.

A decisão de manter elevada a titulação da vacina tinha relação com os danos que os vírus sofriam durante o tempo de armazenagem, com os freqüentes desarranjos do sistema de refrigeração, e especialmente com as dificuldades de transporte e a ausência de uma cadeia de frio para sustentar a titulação até as longínquas regiões interioranas onde grassava a febre amarela silvestre.

Em dezembro de 1949, por exemplo, Penna registrava:

Desde algum tempo vem se notando que a imunidade

produzida pelo vírus 17DD era tão baixa que na maioria dos

casos não podia ser revelada pela prova de proteção em uso

corrente no laboratório em amostras colhidas trinta dias após a