Preparação do suco de embrião

 

Coleta dos embriões. Rio de Janeiro, RJ, década de 1960.

LAFA/Bio-Manguinhos/ Fiocruz

O problema só foi resolvido em 1982, quando a oferta de ovos SPF tornou possível seu uso exclusivo, fazendo-se desnecessárias muitas das precauções relacionadas acima.

 

Preparação do suco de embrião Hoje, os embriões retirados dos ovos são depositados em copos de trituração de aço inoxidável — 44 por copo — aos quais se adicionam 50 ml de água destilada estéril, antes de tritura os embriões a 12.000 rotações por minuto (rpm), durante cinco minutos, com interrupção de um minuto, durante a qual os copos são colocados em banho de gelo para neutralizar o aquecimento do material, que pode ser prejudicial ao vírus. A cada seis meses, é feito um teste de potência no lote semente secundário usado para inocular os ovos que darão lotes de vacina.

O Manual da vacina (p. 23-b) registrava duas revisões na parte concernente à preparação do suco de embrião: em 14 de agosto de 1941 e em 24 de agosto de 1942.

Na preparação da vacina com soro humano e filtragem, os embriões retirados dos ovos eram triturados durante uma hora em moinho de

bolas ou em grandes grais com alundum.16 À pasta resultante adicionava-se o soro humano normal, em proporção tal que o tecido embrionário não excedesse 10% da suspensão, já que concentrações mais altas dificultavam a filtragem do material. A suspensão era transferida para tubos de 250 c.c. e centrifugada por uma hora, a 2.000 rpm. O líquido sobrenadante era filtrado através de grandes discos de Seitz, sob pressão de dez libras, constituindo o filtrado a vacina, pronta para ser envasada e dessecada.

Esse método tinha sérias desvantagens. A concentração de embriões esbarrava no limite de 10%; e mesmo com a adição do soro, perdia-se grande parte do vírus durante a filtragem. Muitos lotes acabavam sendo descartados por causa de titulação insuficiente (Penna, 1956, p. 15).

Uma primeira inovação consistiu na vacina ainda com soro, mas sem filtragem. Depois de triturados os embriões, adicionava-se o soro humano normal de maneira a formar uma suspensão com 20% de tecido embrionário. O soro podia ser diluído a 1:2 em solução salina fisiológica. Após a centrifugação, o líquido sobrenadante era aspirado para um frasco Kitasato: a vacina estava pronta para ser envasada.

As primeiras tentativas de eliminar o soro consistiram no uso de goma arábica a 2% ou, simplesmente, água destilada para produzir o meio em que era suspenso o tecido embrionário. Em 23 de abril de 1942, passou-se a usar suco embrionário não diluído. Assim, na preparação da vacina sem soro e sem filtragem, a trituração dos embriões, a transferência da polpa resultante para os tubos de centrifugação eram feitas da mesma maneira sem, no entanto, adicionar-se o soro ou qualquer outro líquido. Centrifugava-se do mesmo modo o material, aspirando-se em seguida o líquido sobrenadante — a vacina — para o frasco Kitasato (em geral, correspondia a um terço do volume original de polpa).

 

Moinho de bolas com o frasco onde eram triturados os

embriões, modelo adotado até 1941. O procedimento incluía a

adição de soro humano para obter-se à suspensão viral. Rio de

Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Vista do laboratório principal localizado no Pavilhão

 

Rockefeller, em Manguinhos, num momento de pausa dos

trabalhos. Note-se no chão, à esquerda, o moinho de bolas

usado para a trituração dos embriões e, acima dele, três filtros

Seitz, utilizados na filtragem de soros ou da vacina. Rio de

Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Frasco Kitasato usado para aspirar o sobrenadante (a vacina)

de dentro dos tubos de centrifugação. Produzia-se o vácuo no

frasco, pouco antes de ser utilizado. A velocidade de aspiração

era controlada por uma pinça ajustável, aplicada no tubo de

borracha de entrada. A distribuição da vacina era feita

diretamente desse frasco para os tubos com 200 doses. Rio de

Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/ LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Como dissemos, o soro humano foi suprimido da formulação da vacina, em virtude da contaminação de muitos lotes com um vírus patogênico ainda desconhecido, e que só mais tarde seria reconhecido como o agente da hepatite B. Em 1939, quando irrompeu a epidemia de icterícia no Espírito Santo, as vacinações foram interrompidas e o Laboratório de Febre Amarela do Rio de Janeiro iniciou estudos visando a alterar a composição da vacina. Curiosamente, no Manual da vacina de 1941-42 (p. 23), a eliminação do soro é atribuída principalmente a razões econômicas. Propiciava considerável redução do custo de produção por eliminar as despesas com a obtenção e controle do soro e, também, por permitir maior diluição do extrato de embrião. As vacinas com soro não podiam ser diluídas em proporção superior a 1:20. As sem soro, por causa de seu alto título, admitiam maior diluição e, conseqüentemente, poderiam ser distribuídas em volumes menores nos tubos ou ampolas, o que reduziria ainda mais o preço por dose. Como vimos, a diluição não pôde ultrapassar 1:100, pois se verificou que a concentração de suco de embrião inferior a 1% acelerava demais a deterioração do vírus em campo.

O soro humano logo seria completamente eliminado da preparação da vacina, mas em 22 de abril de 1942 — data de revisão deste item específico do manual — o laboratório do Rio de Janeiro continuava a consumir quantidades relativamente grandes desse líquido orgânico na produção dos dois tipos de vacina mencionadas atrás — como diluente da polpa de embrião e protetor do vírus durante a filtragem, e como componente do líquido sobrenadante nas culturas em tecido, in vitro. As precauções na coleta do soro haviam sido redobradas, supondose que isso bastasse para evitar a transmissão da icterícia.

O laboratório mantinha um grupo de 188 doadores, cujo soro sangüíneo não possuía anticorpos para o vírus da febre amarela. Eram chamados quando necessário para fornecer entre 200 e 400 c.c. de sangue, dependendo do peso do doador, resguardando-se um intervalo de mais de trinta dias entre as sangrias. Os frascos com sangue eram mantidos no frio durante 24 horas, para que as partes sólidas decantassem e o soro, ou grande parte dele, fosse aspirado. O resíduo era extraído por centrifugação. O soro de três a oito doadores era misturado e mantido em banho-maria em água a 56ºC, por duas horas, para a "inativação". Depois, era filtrado em disco de Seitz. Submetia-se ainda uma amostra à prova de proteção, para confirmar a ausência de anticorpos ao vírus da febre amarela. As misturas de soro eram numeradas em série, registrando-se num livro os dados relativos a cada uma: datas de sangria, doadores, inativação, resultados da prova de proteção e destino dado ao material.

 

Aparelho usado para sangrias humanas e obtenção do soro

usado na preparação da vacina. O sangue era recolhido em frascos Kitasato graduados por sucção obtida por meio do

aparelho mostrado na imagem. Consistia numa bomba

pneumática com ação invertida, um reservatório cilíndrico para

baixa pressão e um manômetro de mercúrio. Rio de Janeiro,

RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Após a crise de 1939-40, algumas providências foram tomadas com o objetivo de "diminuir a possibilidade de contaminação dos soros com o agente da icterícia pós-vacinação". Passou-se a extrair dos doadores, primeiro, uma amostra de 5 c.c. de sangue para se verificar, imediatamente, o "índice icterício". Se fosse maior do que cinco, era dispensado. Se estivesse dentro de limites aceitáveis, sangravam-no. Após uma primeira filtragem, o soro era guardado por sessenta dias sem ser misturado aos outros. A mistura, inativação e a nova filtragem só ocorriam se, no fim desse período, o doador não houvesse tido nenhuma doença intercorrente, e se novas provas de índice ictérico fossem normais (Manual da vacina, pp. 61-3).

No começo de 1942, a preparação do suco de embrião foi modificada com o objetivo de reduzir as contaminações, adotando-se aquele sistema de "sublotes" a que nos referimos. Ao serem retirados dos ovos, os embriões passaram a ser reunidos em grupos de cinqüenta a oitenta em copos Pyrex. Cada grupo era levado separadamente ao moinho coloidal que, em dezembro de 1941, substituiu o de bolas, o que resultou em melhor e mais rápida trituração. O aparelho era lavado com solução salina antes de cada trituração, processando-se cerca de trezentos embriões. As pastas resultantes eram recolhidas em frascos de Erlenmeyer e congeladas por imersão em álcool refrigerado com neve de dióxido de carbono. A armazenagem se fazia em marmitas térmicas contendo neve carbônica.

O aperfeiçoamento dessa operação foi uma das decorrências da supressão da filtragem, feita antes mesmo de suprimir o soro. A problemática das contaminações forçou o deslocamento da centrifugação dos embriões triturados para momento posterior, como veremos.

O teste para verificar a contaminação bacteriana do material triturado tornou-se mais rigoroso. Para cada grupo de embriões, reservavam-se, agora, dois balões com caldo estéril, nos quais se pingavam três gotas da pasta triturada; 48 horas depois, os balões eram examinados para ver se havia proliferado algum microrganismo. As pastas estéreis eram degeladas por imersão dos frascos em água tépida (37ºC), caso fossem servir para o preparo imediato de vacinas, ou continuavam na câmara fria para serem usadas quando necessário.

 

Moinho coloidal usado na trituração dos embriões, adotado a

partir de 1942 em substituição ao moinho de bolas. A nova

máquina era capaz de triturar melhor e em menos tempo. Rio de

Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Copos metálicos com capacidade de receber cerca de

 

cinqüenta embriões para trituração, realizada por peça metálica

provida de palhetas de bordas cortantes, capazes de girar em

alta velocidade, quando acionado o motor na base que as

sustenta. Rio de Janeiro, RJ, 1946.

Manual de Instruções Técnicas e Administrativas do Serviço

Nacional de Febre Amarela/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Não havia gelo seco no Rio de Janeiro nos anos 1940. Era preciso fabricá-lo no laboratório, com cilindros de gás carbônico (CO ) 2 comprimido. A descrição de 1956 já faz menção à refrigeração mecânica — uma máquina industrial da Deepfreeze International Corporation (Chicago, Illinois), capaz de manter uma temperatura de-85ºC. A máquina fora adaptada a bomba e tubos para permitir a

distribuição do fluido de convecção 17 — cerca de duzentos litros de álcool — a todos os aparelhos que necessitavam de refrigeração.

Penna encomendou essa máquina durante uma visita aos Estados Unidos, em junho de 1945, para "verificar os aperfeiçoamentos de técnica introduzidos recentemente no preparo da vacina no laboratório de Nova York e adquirir aparelhagem moderna" ("Relatório de atividades da Seção de Vacina". jan./dez. 1945).

A Deepfreeze chegou ao laboratório em abril de 1946 e deu problema já no primeiro dia: parte da carga de gás Freon escapara durante a viagem e a máquina gelava mal. Recarregada, trabalhou satisfatoriamente por alguns dias, até notar-se que o gás continuava escapando. O funcionamento da máquina foi novamente interrompido, enquanto se tentava descobrir o vazamento. Em outubro de 1947, o preparo da vacina teve de ser interrompido, para que fosse consertado o aparelho de refrigeração. "O estoque da vacina é suficiente para atender qualquer pedido, possibilitando, assim, essa parada de trabalhos" ("Resumo de atividades do laboratório" em 1947). A Deepfreeze parou outra vez em agosto de 1949, interrompendo a preparação da vacina durante quase todo o mês.

Após a centrifugação do suco embrionário, colheita, por

aspiração, do líquido sobrenadante. Rio de Janeiro, RJ, década

de 1960.

LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

"O maior acontecimento no laboratório durante o ano de 1949" — anotou Penna em seu Diário — "foi a instalação de um quarto frigorífico destinado à conservação dos lotes de vacina em temperatura de cerca de 30ºC abaixo de zero. A montagem do aparelhamento feita pela GE não foi considerada, entretanto, satisfatória, principalmente por não se fazer o degelo como deveria, o que resultava no acúmulo de gelo nos evaporadores. O mecânico do SEPFA alterou a instalação nos pontos onde se fazia necessário,

conseguindo funcionamento adequado". 18

Em 1952, ano de maior produção de vacina desde a fundação do laboratório, o refrigerador Deepfreeze não suportou a carga, e foi preciso recorrer à neve carbônica ("Relatório anual da Seção de Febre Amarela", 1952). Em abril de 1955, foram instaladas novas máquinas de refrigeração. Menos de um ano depois, a produção foi interrompida de novo, dessa vez por quase dois meses (fevereiro e março de 1956), por ter havido escapamento de gás Freon, que não se achava no Rio de Janeiro, e que teve de ser importado dos Estados Unidos. Os problemas com a aparelhagem de refrigeração prosseguiram por pelo menos duas décadas ainda, acarretando não apenas constantes interrupções no processo produtivo, como queda na titulação da vacina e conseqüente perda de lotes, devido às oscilações de temperatura ("Resumo das atividades da Divisão de Vírus", 1959).

A trituração dos embriões, em 1956, era feita em aparelhos elétricos chamados warring blendors, muito parecidos com os liqüidificadores de uso doméstico que conhecemos. Funcionavam muito melhor do que os refrigeradores, executando a trituração em apenas seis minutos (Penna, 1956, p.74). Retiravase uma amostra (1,0 ml) de cada triturador para teste de esterilidade, e se transferia o restante do material para garrafas Pyrex de um litro, que eram hermeticamente fechadas, numeradas e, em seguida, colocadas dentro de uma caixa provida de rolos que um motor elétrico fazia girar. Álcool gelado na máquina frigorífica era bombeado para dentro dessa caixa e escoava de volta para o refrigerador, em circulação contínua. As garrafas, apoiadas horizontalmente sobre os rolos, giravam por alguns minutos, expondo seu conteúdo ao banho em álcool a -80ºC, até que a polpa de embrião congelasse uniformemente, formando um cilindro oco aderido à parede interna. Além de acelerar a congelação e o descongelamento, este método, ainda em uso, contribuiu para a conservação do título do vírus. A unidade frigorífica e, às vezes, outra sobressalente, possuíam um compartimento em que as garrafas com polpa congelada eram armazenadas à mesma temperatura, por 48 horas ou período maior, que podia chegar a dez dias, até que saíssem os resultados dos testes de esterilidade e se descartassem as polpas contaminadas. (ibidem, p.75-6) As 'saudáveis' eram descongeladas, imergindo-se as garrafas em água a 30ºC. No quarto à prova de poeiras, uma bomba aspirava as polpas para dentro de um grande frasco de filtragem, de onde eram distribuídas para recipientes de 250ml, que descreviam duas mil revoluções por minuto, durante uma hora, numa centrífuga refrigerada (2º a 5ºC). O límpido líquido sobrenadante, equivalente, em geral, à metade do volume da polpa, era a vacina.

Aparelho para a retirada da suspensão ou suco de embriões do

frasco triturador. Após a adição de soro humano à massa

embrionada, a suspensão é distribuída em tubos para

centrifugação. A transferência é realizada por meio de pressão

de ar obtida com o auxílio de uma pêra insufladora, a qual expele o líquido através de um tubo que atinge o fundo do

frasco. Rio de Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/ LAFA/Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Dispositivo especial que imprime aos vidros contendo polpa

embriônica um movimento de rotação lento, enquanto

permanecem parcialmente imersos em álcool refrigerado a uma

temperatura de cerca de 70ºC abaixo de zero. O objetivo da

operação é formar, nas paredes laterais dos frascos, uma fina

camada de pasta congelada que será armazenada em

refrigerador especial. Rio de Janeiro, RJ, 1946.

Manual de Instruções Técnicas e Administrativas do Serviço

Nacional de Febre Amarela/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Aspecto interno da máquina centrífuga, cuja função é realizar a

separação, na pasta embrionária contida nos frascos, do

material descartável constituído por fragmentos de tecido que

vão ao fundo, e da suspensão viral propriamente dita, o líquido

sobrenadante. Rio de Janeiro, RJ, Década de 1970.

Álbum LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Centrífuga em funcionamento. Rio de Janeiro, RJ, 1939.

Vídeo Preparação da vacina de febre amarela/Cinemateca Brasileira

O processo atual é basicamente o mesmo. Após a trituração dos embriões, o conteúdo de cada dois copos é transferido para um frasco centrífugo de 1.000 ml, e centrifugado durante uma hora a uma temperatura de 4ºC a 8ºC. O sobrenadante é aspirado, por pressão negativa, para um frasco de vidro de 1.000 ml. A principal novidade reside na inclusão de estabilizadores, em quantidade proporcional ao volume recolhido. Como todo imunizante constituído de vírus vivo, a vacina contra a febre amarela era extremamente vulnerável ao calor e às variações térmicas em geral. Este problema crônico só foi minimizado nos anos 1980, quando se incluiu na formulação da vacina um complexo estabilizador concebido pelos técnicos do Laboratório de Desenvolvimento de Bio-Manguinhos.

De cada frasco, são retiradas amostras para testes de potência e para se verificar contaminação com vírus, fungos e bactérias, especialmente a Micobacterium tuberculosis. Os frascos são hermeticamente fechados e identificados com um número de série, registrando-se o volume final de cada um. A suspensão viral estabilizada é, então, congelada em banho de álcool e gelo seco, num aparelho idêntico àquele que descrevemos acima. Em vinte minutos de rotação, forma-se o cilindro oco, aderente às paredes dos frascos, que são armazenados a –70ºC até serem liberados pelos técnicos do Controle de Qualidade.

Congelamento do bulk vacínico. A técnica consiste em imergir

parcialmente os frascos contendo o caldo embriônico em

solução de álcool refrigerado e mantê-los em rotação, para que

o congelamento se dê por finas camadas que vão aderindo à

parede interna do frasco. Década de 1970.

Álbum LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

O descongelamento se faz ainda em banho-maria, a 31ºC. Depois de sofrerem assepsia externa com álcool 70% iodado, os frascos são levados à área biolimpa, onde a suspensão viral contida em cada um é transferida para um único recipiente, retirando-se amostras para novos testes de esterilidade e potência. O pool formado nesse recipiente é a vacina a granel, pronta para ser envasada ou, como se dizia, "distribuída".