Coleta dos embriões

Terminado o segundo período de incubação, destruíamse os ovos com embriões mortos e transportavam-se os outros para o quarto à prova de poeiras, para serem abertos. Pelo processo primitivo, associado à produção da vacina com soro humano e filtragem, as cascas eram abertas com tesoura, perto da margem da bolsa de ar, depois de lavadas com iodo e álcool. Os embriões eram retirados com pinça, colocados em placas de Petri para serem pesados e, em seguida, triturados.

O soro humano era necessário para a filtragem do vírus, feita através de disco de Seitz. Quando se decidiu suprimir o soro, o primeiro problema que se apresentou foi a eliminação do processo de filtragem e, por conseqüência, o desenvolvimento de um método de colheita mais asséptica dos embriões inoculados com o vírus.

Na verdade, a filtragem tinha, por si mesma, alguns inconvenientes. Além de reter contaminantes e partículas indesejáveis, retinha quantidades variáveis de vírus e entupia quando a proporção de tecido de embrião dissolvido em soro ultrapassava 15% da solução.

Em trabalho publicado em agosto de 1939 (pp. 589-92), Henrique Penna descrevia a técnica e o aparelho que desenvolvera para diminuir a contaminação dos embriões na hora de retirá-los de dentro do ovo. A casca passou a ser cortada com a chama do maçarico oxi-acetilênico, em dois tempos: aplicava-se inicialmente a chama na parte superior do ovo, bem no centro da bolsa de ar, para abrir um furo que desse vazão ao ar aquecido durante a aplicação subseqüente da chama ao redor do ovo, logo abaixo da margem da bolsa de ar, enquanto girava o suporte adaptado a um motor elétrico, na vertical. Removia-se, então, a calota que cobria o pólo do ovo e se extraía o embrião com um gancho de arame especial.

Em 27 de janeiro de 1942, foi utilizada uma versão modificada do aparelho, que imprimia rotação mais lenta e uniforme ao ovo, permitindo que se aplicasse tangencialmente a chama do maçarico para queimar a circunferência da bolsa de ar.

 

Ovo no suporte, pronto para ser aberto com a chama do

maçarico. O aparelho usado desde 9 de janeiro de 1942 é uma

modificação do original descrito em American Journal of

Tropical Medicine (1939). Consta de um suporte para o ovo,

montado sobre um eixo vertical, capaz de entrar em rotação lenta por meio de motor elétrico a ele ligado por transmissão de

atrito. A velocidade de rotação é de 60 rpm. A casca de ovo é

cortada abaixo da inserção da câmara de ar. Modelo utilizado

no laboratório até o final da II Guerra Mundial. Rio de Janeiro,

RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

A descrição de 1956 nos mostra uma linha de montagem um pouco mais sofisticada. Depois que se fazia a triagem dos embriões mortos, os ovos eram colocados num freezer a -20ºC, e lá permaneciam por meia hora, no mínimo (Penna, 1956, p. 73). Em seguida, eram colocados em bandejas metálicas providas, agora, de quatro anéis de borracha móveis, acionados por um mecanismo de

rotação. 14 À medida que giravam os anéis com os ovos, um de cada vez, o operador aplicava a chama do maçarico tangencialmente, queimando um círculo na margem da bolsa de ar, sem aquecer demais o interior do ovo. Outro operador levantava os tampos das cascas e expunha os embriões com uma espátula esterilizada por flambagem. O operador seguinte removia os embriões com fórceps também esterilizados e os despejava dentro dos recipientes metálicos dos trituradores chamados warring blendors (ibidem).

 

Ovo no suporte (modelo em uso até abril de 1942) pronto para

ser aberto com a chama do maçarico. 1940.

The Organization and Detailed Procedures of the Vaccine Division of

the Yellow Fever Laboratory/LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

Coleta de embriões na sala à prova de poeira. Com um

 

maçarico, o operador, no primeiro plano, queima um círculo ao

redor de cada ovo, na máquina Pickels, que substitui os

aparelhos mostrados nas imagens anteriores. O próximo

operador abre a calota do ovo com espátula esterilizada e

expõe o embrião. O terceiro coleta os embriões com fórceps

esterilizados e os deposita num contêiner de metal que será

acoplado à máquina trituradora. A abertura dos ovos é a parte

do processo que oferece maiores oportunidades para a

contaminação por bactérias; por isso, além de trancorrer numa sala especial, uma coifa de vidro recobre a mesa com a função de proteger as matérias orgânicas manipuladas das partículas

em suspensão no ar. Rio de Janeiro, RJ, 1956.

Penna, 1956, p. 73

Atualmente, desde que os ovos ingressam na área biolimpa através do pass through, a coleta dos embriões se processa de maneira quase idêntica. A operação é realizada sob exaustão do ar, para que sejam retirados os resíduos resultantes da queima das cascas e quaisquer outras partículas contaminantes, e a pinça esterilizada que se usa para retirar os embriões é substituída a cada quatro ovos.

 

Corte da calota para retirada do embrião com maçarico oxi-

acetilênico. Rio de Janeiro, RJ, década de 1970.

Álbum LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Ovo com calota pronta para ser removida após a aplicação da

 

chama cortante. Suporte usado em combinação com os

aparelhos rotativos mais primitivos mostrados atrás. Rio de

Janeiro, RJ, 1941-1943.

Manual da Vacina/ LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

A coleta dos embriões era, no passado, a parte do processo mais vulnerável à contaminação por bactérias. O uso da chama do maçarico e o quarto à prova de poeiras faziam parte do elenco de medidas destinadas a neutralizar este risco. Os operadores usavam máscaras e aventais esterilizados, lavavam as mãos com água, sabão e ainda álcool.

A princípio, os embriões eram colocados dentro de balões com caldo; passado um tempo, o caldo era retirado e incubado. Esse procedimento favorecia a contaminação, pois a cada embrião colocado, a tampa do recipiente tinha de ser removida e recolocada. Depois, os embriões bloqueavam a passagem do caldo na hora em que se fazia a retirada com a ajuda de uma pipeta. Para evitar a possibilidade de se perder todo um lote de vacina, devido à permanência de embriões contaminados, Penna separou-os em grupos de 15 e os colocou em frascos Kitasato, com tubo soldado para baixo. Os frascos eram agitados, escoando-se o caldo para dentro do balão onde ia ser incubado.

Mesmo assim, os embriões colhidos no laboratório do Rio de Janeiro mantiveram índices de contaminação muito superiores aos de Nova York. Lá, os sublotes eram de cem embriões e, segundo o Annual Report de 1940, praticamente não havia contaminação. No Rio, quase sempre se tinha um a dois frascos contaminados em cada cem embriões colhidos. Penna chegou a testar sublotes de cem, mas voltou atrás. Em 1956, a colheita se fazia não apenas numa sala à prova de poeiras, mas debaixo de uma coifa de vidro provida de lâmpada de esterilização ultravioleta (Penna, 1956, p.74). Os embriões mortos eram descartados e os restantes eram separados em grupos de 10 ou 15, em frascos de Erlenmeyer, com 500 c.c. de caldo glicosado. Agitava-se o frasco, transferia-se o caldo para um balão estéril, marcado com o número correspondente ao grupo. Os balões eram incubados a 37ºC e examinados no dia seguinte. Se houvesse crescido alguma bactéria, aquele grupo era

destruído. 15 Os embriões não contaminados eram reunidos e triturados. Tais precauções causavam uma redução de mais de 50% no título de vírus da vacina. E, às vezes, germes de crescimento lento só se tornavam aparentes nos meios de cultura depois de 48 horas de incubação. Quando isso acontecia, a perda do lote era total.

Vê-se aqui, à esquerda, o aparelho desenvolvido por Penna, em

1939, num período em que a produção não tinha ainda o ritmo

da linha de montagem. À direita, operador remove embriões

para o frasco onde serão triturados. Os operadores usam

máscaras e aventais esterilizados, e, antes da operação,

escovam as mãos com água e sabão e as lavam com álcool,

seguindo os padrões assepsia da época. Rio de Janeiro, RJ,

1941-1943.

Manual da Vacina/ LAFA/ Bio-Manguinhos/ Fiocruz

Os relatórios do Laboratório de Febre Amarela indicam que até recentemente as contaminações da vacina em diversas fases de sua preparação foram um problema constante, de difícil solução, sobre o qual estiveram permanentemente debruçados Henrique Penna e outros membros de sua equipe. Em 1939, ao descrever a nova técnica para a remoção "asséptica" dos embriões, Penna explicou que a concebera com o intuito de eliminar a infiltração de microrganismos residentes na casca do ovo. "Repetidos testes mostram que o embrião de galinha raramente é contaminado enquanto está no interior do ovo. Por outro lado, métodos de cultivo indicam que uma elevada percentagem de cascas ... contêm bactérias vivas, mesmo depois de terem sido pintadas com tintura de iodo e lavadas com álcool. Isso sugere que grande parte da contaminação de vacinas não filtradas se deve à presença de microrganismos na casca".

Contudo, as modificações feitas entre 1939 e 1942 nas etapas de inoculação dos ovos e de colheita dos embriões já virulentos não resolveram o problema. Continuaram a ser encontrados, com muita freqüência, tanto nos embriões como na polpa resultante de sua trituração microrganismos diversos mas, principalmente, "germes gram-negativos de forma bacilar (bastonetes), às vezes móveis, que não fermentam os açúcares mais usuais," e que os bacteriologistas do Instituto Oswaldo Cruz classificaram como Alcaligenes faecalis em 1943. Ocorria com tanta freqüência nos meses quentes e chuvosos do verão que o laboratório era obrigado a interromper a produção nesse período.

Para retirar-se os embriões inoculados, queima-se um anel

perto do pólo maior do ovo com a chama muito quente de um

maçarico oxi-acetilênico. A chama não só corta a casca, como também a esteriliza. Um dispositivo movido por motor elétrico,

chamado de máquina Pickles, com velocidade graduável, faz

girar suportes de borracha em que são colocados os ovos a

serem abertos. O primeiro aparelho foi desenvolvido por

Henrique Penna, no Rio de Janeiro, e os demais, aperfeiçoados

por E. G. Pickels. O modelo ao lado, para abertura de maior

número de ovos, foi introduzida no laboratório logo após a II

Guerra Mundial. Rio de Janeiro, RJ, 1946.

Manual de Instruções Técnicas e Administrativas do Serviço

Nacional de Febre Amarela/ LAFA/Bio-Manguinhos/Fiocruz

As modificações feitas com o intuito de neutralizar a contaminação danificavam também o vírus, diminuindo a eficácia da vacina. Em 1943, Penna alterou o procedimento adotado na passagem do vírus pelos embriões: "Estou preparando vacina com embriões guardados 24 horas à temperatura de 3ºC a 5ºC, tempo esse suficiente para que as provas culturais preliminares acusem contaminação por A. faecalis. Somente os sublotes ... satisfatórios entram na preparação ... da vacina. Brevemente saberei quanto se perde em concentração de vírus por esse proceder" ("Resumo de atividades da Seção de Vacina" 1.1 - 31.12.43). Em março de 1944, já sabia que vacinas preparadas dessa forma apresentavam título mais baixo, tendo, portanto, validade por tempo menor do que as vacinas chamadas "diretas", feitas sem prévia conservação dos embriões. Em compensação, as perdas por contaminação bacteriana, que, no primeiro caso, eram reduzidas "praticamente a zero", nas vacinas diretas, usando-se lotes de aproximadamente trezentos embriões, era considerável: ultrapassavam 50% ("Report of the Vaccine Section", 1943).

A flora bacteriana existente na atmosfera da sala onde se preparava a vacina foi estudada, verificando-se que não coincidia com os contaminantes habituais encontrados nela, os tais "bastonetes gram-negativos". Em maio de 1944, Penna já não sabia ao certo se os ovos chegavam contaminados ao laboratório, e se a contaminação provinha da casca ou do interior do ovo. Não se podia adicionar à vacina nenhum "desinfetante ou preservativo" para não prejudicar o vírus vivo. A instalação da coifa com irradiação ultravioleta no local onde trabalhavam os operadores não deu cabo do problema. Em março de 1947, Penna registrava desalentado: "a porcentagem de contaminações bacterianas ... apesar das diversas medidas postas em prática, aumentou consideravelmente durante os últimos tempos, o que resultou na impossibilidade de serem feitas vacinas durante o mês" ("Resumo de atividades do laboratório" em 1947).

Para esclarecer a origem dos germes "provisoriamente classificados como Alcaligenes faecalis, decidiu estabelecer uma pequena colônia de galinhas leghorn nos terrenos do laboratório. Em dezembro de 1947, ainda não tinham encontrado nos ovos da granja experimental o microrganismo, nem mesmo quando o inoculavam artificialmente nas galinhas. O problema persistiu, apesar da chegada naquele mês de novo equipamento para abertura asséptica de ovos, em grande escala, importado de Nova York (ibidem).

Rebate das calotas para retirada dos embriões. A parte da

casca que cobre a câmara de ar é retirada; a membrana,

removida e o embrião, retirado com fórceps esterilizado. O

trabalho contínuo sob luz ultravioleta causava queimaduras e

dermatites nos operadores. Rio de Janeiro, RJ, década de 1960.

LAFA/Bio-Manguinhos/ Fiocruz

A técnica padrão descrita em 1956 incluía a lavagem dos ovos com solução de hipoclorito de cálcio a 1% e uma escova suave de mão. (Penna, 1956, p. 69). Depois passou-se a usar solução a 2% de ácido clorídrico. Nos anos 1960, Alberto Romeu Nicolau, o sucessor de Penna na chefia do laboratório, determinou a supressão desta prática, pois ela destruía o verniz que protegia o ovo, aumentando as chances de contaminação externa. Em 1959, se tinha verificado que o contaminante mais pertinaz da vacina provinha de dentro do ovo. A única maneira de minimizar o problema era efetuar provas bacteriológicas em pequenos grupos de embriões, separadamente. Isso permitia obter "melhores resultados quanto ao número de embriões estéreis, sem, contudo, nos permitir uma produção normal da vacina" ("Resumo das atividades da Divisão de Vírus", 1959).