A biologia molecular e a vacina contra a febre amarela

Isso teve implicações sérias para a tecnologia da cultura de tecido, porque a albumina humana, ainda que usada em quantidade mínima, é essencial para obter-se a estabilidade do vírus no meio líquido, ainda durante a cultura celular. Sem este estabilizador, não se alcança rendimento compatível com a produção em escala. Não se pode retroceder ao soro fetal bovino, hoje condenado também. O projeto encontra-se novamente diante de um impasse. Marcos Freire busca um laboratório que produza albumina humana recombinante, mesmo que experimentalmente, para ver se tem o mesmo efeito da natural.

A biologia molecular e a vacina contra a febre

amarela

A cultura de tecido in vitro, que ainda não substituiu o cultivo do vírus vacinal em ovos embrionados, imbrica-se com outra tecnologia em desenvolvimento, que promete revolucionar não apenas os métodos de produção da vacina antiamarílica como a prevenção de outras doenças virais e parasitárias.

O vírus da febre amarela pertence à família dos Flaviviridae, composta por cerca de setenta vírus que, em sua maioria, têm como hospedeiros os artrópodes, sendo transmitidos a vertebrados por mosquitos ou carrapatos. São divididos em oito subgrupos sorológicos, com base em testes de neutralização cruzada, havendo membros destes grupos na maioria dos continentes, onde produzem doenças humanas que constituem sérios problemas de saúde pública, destacandose, além da febre amarela, o dengue, com seus quatro sorotipos, e a encefalite japonesa.

Só há vacinas disponíveis, por enquanto, para a febre amarela. Vacinas para as duas últimas doenças foram desenvolvidas recentemente por passagens seriadas dos vírus em células de

vertebrados, mas até agora nenhuma foi licenciada.103

A vacina para o dengue era, como vimos, um dos pontos da agenda preparada na passagem dos anos 1970 para os 1980, quando a febre amarela voltou a representar um problema candente para as ciências biomédicas e a saúde pública. No simpósio internacional promovido pela Organização Mundial de Saúde em Belém, em abril de 1980, foram demarcadas diversas incógnitas para pesquisas futuras. Muitas diziam respeito aos mecanismos da virulência viral e da resposta imunológica do organismo invadido, problemas que os acidentes pós vacinais recentemente ocorridos tornam de uma atualidade pungente.

A morte por febre amarela, no homem e em animais, está associada a lesões específicas no fígado ou no cérebro. Sabia-se que o viscerotropismo, característico do vírus selvagem, e o neurotropismo dos vírus atenuados tinham relação com propriedades "intrínsecas ou genéticas" tanto do vírus como do hospedeiro vertebrado. Mas não se tinha nenhuma explicação para isso. Que propriedades do hospedeiro e do vírus determinavam seu tropismo? Sua virulência fora modificada por passagens em animais, tecidos e ovos embrionados, mas o que operava a mudança? Sendo grande a preocupação, na época, com a substituição dos ovos embrionados pela cultura de tecidos, buscava-se saber em que sistemas celulares poderia ser cultivado o vírus sem que sofresse modificações.

As respostas imunológicas que suscitava também envolviam numerosas questões sem solução. Desde 1961, se conhecia a existência de duas frações hemaglutinantes diferentes, e se verificara que o vírus continha determinantes antigênicos específicos e do grupo dos flavivírus. Parecia haver diferenças entre os tipos sul-americano e africano, mas de natureza imprecisa. Em ambos os casos, os anticorpos protegiam o organismo contra a febre amarela, mas não se sabia qual era o papel da célula como mediadora de imunidade. A longa persistência dos anticorpos em convalescentes e pessoas vacinadas era um fenômeno comprovado, mas que ninguém sabia explicar.

Tinham-se evidências de que as respostas imunológicas à doença no homem podiam ser alteradas por exposição anterior a outros flavivírus, e que havia certa proteção cruzada entre viroses correlatas, como a febre amarela e o dengue. Essa, aliás, é uma das hipóteses, ainda não confirmadas experimentalmente, para explicar o fato surpreendente de não se ter urbanizado, ainda, a febre amarela nas Américas, apesar de serem tão propícias as

condições para isso. 104

Na época em que eram formuladas estas questões, estava em curso o boom da biologia molecular. O desenvolver de suas ferramentas conceituais no período 1940-65, possibilitava, agora, a abordagem e manipulação dos fenômenos biológicos por ângulos e com instrumentos diferentes daqueles usados pelas disciplinas mais antigas. Segundo Morange (1998, pp. 2, 231-2 ), "a biologia molecular nasceu quando os geneticistas, não mais satisfeitos com a visão quase abstrata do papel dos genes, voltaram-se para o problema da natureza dos genes e seu mecanismo de ação. Foi também conseqüência das tentativas feitas pelos bioquímicos de compreender como as proteínas e enzimas — agentes essenciais da especificidade orgânica — são sintetizados, e como os genes intervêm neste processo".

Dentre as técnicas de engenharia genética desenvolvidas no período, destaca o autor aquela descoberta em 1983 por Kary B. Mullis, a chamada Reação de Amplificação em Cadeia (Polimerase Chain Reaction, ou PCR), que permite amplificar e portanto caracterizar geneticamente qualquer fragmento de DNA contido nas menores amostras de material biológico.

Um esforço considerável de pesquisa foi então direcionado para o esclarecimento das bases moleculares da atenuação do vírus vacinal da febre amarela, considerado o melhor modelo para compreender a biologia dos flavivírus em geral. A identificação dos genes responsáveis por esta característica permitiria que se desenhassem "racionalmente" outras vacinas e drogas antivirais.

Segundo Monath (1996, pp. 176-9), uma das principais dificuldades para este estudo eram as acentuadas variações genéticas ocasionadas por longas séries de passagens realizadas empiricamente até se chegar às cepas vacinais em uso.

Vírus de RNA ou retrovírus, como o da febre amarela, apresentam taxa muito elevada de variação genética. Toda vez que um vírus invade uma célula, a maquinaria dela é levada a produzir proteínas virais, inclusive as que vão se encarregar de fazer a fita oposta — diz-se negativa ou complementar — da fita do RNA (positiva), com sua seqüência quimicamente definida. A proteína polimerase vai às extremidades dessa fita, interage com elas e seqüencia a cadeia complementar de bases nitrogenadas, pondo um G (guanina) na fita negativa no lugar correspondente ao C (citosina), na positiva; um A (adenina) na posição complementar ao U (uracila), e assim por diante. São feitas muitas fitas negativas, que servirão como moldes para os RNAs virais positivos. Em enxame, eles infectam outras células, num processo que cresce exponencialmente até ocasionar a chamada viremia no homem e em outros vertebrados, momento em que se observam até um milhão de partículas virais em 1 ml de sangue.

Quando a polimerase está em ação, ocorrem erros; bases nitrogenadas são inseridas na fita complementar em posição diferente daquela exigida pela fita molde, gerando assim pequenas mutações. Esse é o mecanismo básico da evolução que ocorre muito mais lentamente nos organismos com genoma DNA, como os humanos, que possuem mecanismo de reparo destas falhas genéticas. Em retrovírus como o amarílico, as mutações são aceleradas e, nas passagens seriadas em ovo, em células in vitro, ou mesmo nas passagens desordenadas pelas células do organismo infectado pode ocorrer uma seleção no pool de variantes, que faz prevalecer subpopulação diferente, alterando-se os fenótipos conhecidos do vírus.

Em 1983, empregando um método relativamente insensível (fingerprint), Monath e colaboradores encontraram pequenas diferenças entre os genomas de várias subcepas do vírus 17D usados na produção de vacinas. Num caso, chegou a observar uma diferença entre os vírus semente e vacina, indicando que a mutação (ou seleção de variante) podia ocorrer no decurso de um ou duas

passagens em embrião de galinha. 105

A seqüência completa dos 10.862 nucleotídeos que formam o genoma do vírus 17D foi decifrada em 1985 por Rice, Lenches e Eddy (pp. 726-33). Mais tarde, foram seqüenciadas outras

subcepas.106 Santos, Post, Carvalho, Ferreira e Galler, com a colaboração de Rice, revelaram, em 1995 (pp. 35-41), a seqüência completa do genoma do 17DD EP-low, a subamostra usada na fabricação da vacina de Bio-Manguinhos. As comparações efetuadas pela equipe brasileira entre as seqüências do 17DD e de outras subamostras atenuadas — a 17D-204 e a 17D-213 — mostrou que a média de mudanças por passagem do vírus era bem menor no 17DD, que seria, então, uma cepa geneticamente mais estável do que a outras (Galler, Post, Santos e Ferreira, 1998, pp. 1024-8).

Segundo Monath (1996, pp. p. 177), a comparação entre o primeiro 17D seqüenciado e o vírus do qual descendia, o Asibi, revelou 68 mudanças de nucleotídeos, que resultaram em 32 diferenças de aminoácidos espalhadas ao longo do genoma. Identificaram-se muitas substituições de aminoácidos na glicoproteína de envelope expressa pelo gene E. Das cinco mudanças de aminoácidos não conservadas ocorridas por mutações neste gene, uma ou mais estariam provavelmente implicadas na atenuação do vírus, pois já se tinha verificado que o tropismo pelas células hepáticas e neurais é determinada por esta gliproteína. A comparação posterior entre os genomas de diversas cepas do 17D reduziu de 32 para 20 o repertório de mudanças que poderiam ser responsáveis pela atenuação da virulência do vírus, destacando-se quatro mudanças não conservadas no gene E, que podem modificar consideravelmente a função de proteínas.

A representação tridimensional da estrutura cristalográfica da glipoteína por Rey e colaboradores, em 1995, significou, "um salto

quântico" 107 na compreensão dos flavivírus, e confirmou a suspeita de que as mutações responsáveis pela atenuação do vírus Asibi estão localizadas em sítios expostos na superfície do glicopeptídeo E. Na época em que Monath publicou o artigo no qual nos baseamos — 1996 — não se tinha conseguido ainda identificar "em nível funcional" as mudanças precisas que são responsáveis por essa atenuação. Aguardavam-se as informações a esse respeito, que seriam obtidas graças a um passo importante dado por Rice, Grakoui, Galler e Chambers (pp. 285-96): em 1989, conseguiram produzir um clone do cDNA abrangendo todo o genoma viral, e capaz de gerar RNAs infecciosos, in vitro. Tornou-se, assim, possível introduzir no vírus mutações sítio-dirigidas de tipo selvagem (Asibi), verificando-se, em seguida, se sua prole teria a virulência reconstituída.

Além de permitir o mapeamento genético de funções virais específicas, a tecnologia de clones infecciosos permitiu que se manipulasse o genoma do vírus vacinal e se engenheirassem mutantes, que no jargão dos biologistas tem o curioso nome de "quimeras". Esses novos vírus vivos podem operar como vetores capazes de expressar no organismo humano antígenos heterólogos, desencadeando reação imunitária contra o vírus amarílico e os de

outras doenças. 108

Coleção Ricardo Galler/IOC/Fiocruz

O trabalho que vem sendo desenvolvido pelas equipes de Bio-Manguinhos e de empresas estrangeiras que começaram a se interessar por esta tecnologia a partir de 1997, quando deixou de ser objeto de pesquisas acadêmicas, consiste em introduzir no genoma do vírus amarílico um gene que codifica proteína de outro microrganismo, sabendo-se de antemão que está associada à ativação das defesas imunitárias do homem. Ao infectar a célula, o vírus vacinal da febre amarela, com aquele gene incorporado a seu genoma, tem seu RNA traduzido em proteínas, inclusive a que originalmente não fazia parte dele. Quando o organismo humano é infectado pelo segundo microrganismo, já é capaz de reconhecê-lo. O indivíduo imunizado com esse vírus recombinante fica, assim, protegido contra a febre amarela e outra doença infecciosa.

Na realidade, podem ser plurais as combinações, e o grupo de Galler trabalha atualmente com a inclusão de genes de dengue e malária no vírus da febre amarela. Construção semelhante foi feita com encefalite japonesa por uma firma norte-americana, que já testou, com sucesso, o vírus recombinante em quarenta voluntários.

Quando o grupo de Galler iniciou os trabalhos no começo dos anos 1990, a metodologia de manipulação in vitro já havia sido desenvolvida, e estavam sendo decifrados os genomas das várias cepas vacinais em uso. Em Bio-Manguinhos, tinham um vírus com bom desempenho vacinal, e metodologias definidas de produção e controle de qualidade. Levou quatro a cinco anos o desenvolvimento do clone cDNA do vírus 17D (subcepa 17D-204), que foi usado, em seguida, para gerar um vírus semente e lotes vacina, em trabalho desenvolvido conjuntamente com a equipe de Marcos Freire, em Bio-Manguinhos. Partindo de apenas cinco microgramas de cDNA, prepararam em cultura de tecido um lote semente secundário com rendimento suficiente para a produção de vacinas por cinqüenta anos, trinta milhões de doses por ano, usando um vírus geneticamente homogêneo, e absolutamente idêntico, no final do processo, ao inóculo utilizado no começo.

Nos testes em macacos, porém, o escore clínico ficou um pouco acima do desempenho do vírus atualmente em uso na produção de vacinas (Marchevsky, Mariano, Ferreira, et al., 1995; pp. 70-80). "Tivemos que introduzir mutações" — explica Ricardo Galler. Agora trabalham com um novo cDNA, que é a cepa 17D-204 com alterações que a tornam mais parecida como a vacina em uso, mas o resultado ainda não é definitivo. "Eu não conheço ninguém no mundo que tenha um cDNA que possa dizer que vai dar vírus amarílico atenuado. É um problema que não está definido. ... a gente está numa fase que não sabe se tem o vírus ideal ou não" (Galler, entrevista, 23.3.2001).

Encerramos aqui o extenso périplo narrativo pela história da vacina contra a febre amarela, sem encontrarmos um ponto final, porque é uma história que deságua em pontas inacabadas. A urbanização da febre amarela é uma incógnita aberta à investigação e, antes que tenhamos os seus resultados, podem acontecer os dramáticos acontecimentos que muitos julgam iminentes. Os trágicos acidentes pós-vacinais que relatamos puseram mais uma vez em evidência a necessidade apontada vinte anos atrás de pesquisas sobre as bases genéticas da atenuação do viscerotropismo e neurotropismo dos vírus 17D usados como imunizantes. As alternativas que seguramente vão ser implementadas — cultura em tecido de vírus geneticamente homogêneos e modificados — são tecnologias ainda em desenvolvimento, a exigir toda a criatividade dos técnicos e pesquisadores de Bio-Manguinhos. Eles têm de vencer não apenas complexos problemas técnicos como aquelas seculares resistências do 'meio' — a falta de recursos e equipamentos, a camisa de força burocrática, o desinteresse do Estado e da iniciativa privada pela ciência — que tornam infinitamente mais árduo o trabalho dos pesquisadores brasileiros, em comparação com os dos países que estão à frente da grande revolução tecnológica em curso nas ciências da vida.