19.2.1 Regulação alostérica

As regulações alostérica e por modificação covalente têm seus princípios gerais descritos a seguir.

19.2.1 Regulação alostérica

As enzimas reguladas por modificação não covalente são chamadas alostéricas. Este tipo de enzima é encontrado em quase todas as vias metabólicas, catalisando geralmente uma reação irreversível localizada no início da via. Estruturalmente, são proteínas oligoméricas, com um sítio ativo em cada cadeia polipeptídica. A ligação do substrato ao sítio ativo de uma subunidade afeta a conformação das demais, facilitando a ligação das moléculas de substrato aos outros sítios ativos. A cooperatividade estabelecida entre os sítios catalíticos é evidenciada pela cinética da catálise: o gráfico de velocidade da reação em função da concentração de substrato é uma curva sigmoide, em vez da curva hiperbólica de Michaelis-

Menten (Figura 19.1 a). Trata-se do mesmo tipo de cooperatividade, exibida por uma curva sigmoide, encontrada na ligação do oxigênio à hemoglobina, também uma proteína oligomérica, com um sítio de ligação para o oxigênio, o grupo heme, em cada subunidade. Em contraposição, a ligação do oxigênio à mioglobina, uma proteína monomérica, com um único grupo heme, segue uma cinética hiperbólica, como a das enzimas michaelianas, que apresentam, geralmente, uma única cadeia polipeptídica, com um só sítio ativo. Mesmo enzimas oligoméricas podem apresentar cinética michaeliana, desde que não exista efeito cooperativo entre suas subunidades.

As enzimas alostéricas são sensíveis reguladores do metabolismo graças à possibilidade de ligarem-se a determinados metabólitos, o que provoca grandes alterações de sua atividade. Estes metabólitos, os efetuadores ou moduladores alostéricos, são chamados positivos (ativadores alostéricos) ou negativos (inibidores alostéricos), segundo provoquem aumento ou

redução da velocidade da reação catalisada (Figura 19.1 b). O efetuador alostérico liga-se a um nicho específico da estrutura tridimensional da enzima, chamado centro ou sítio alostérico, que é tão específico para o efetuador quanto o sítio ativo é para o substrato.

As enzimas alostéricas caracterizam-se por apresentarem duas conformações espaciais diferentes e interconversíveis, com alta ou baixa afinidade pelo substrato. O efeito dos efetuadores alostéricos pode ser explicado por sua ligação preferencial a uma das formas, muito ativa ou pouco ativa, da enzima. Como esta ligação estabiliza a enzima em uma dada forma, os efetuadores alostéricos atuam como ativadores ou inibidores da reação enzimática.

Figura 19.1 a) Gráfico da velocidade de reação em função da concentração de substrato para uma enzima alostérica e para uma enzima michaeliana. A curva sigmoidal exibida pela enzima alostérica é o reflexo da cooperatividade apresentada pelas suas subunidades; as enzimas monoméricas, michaelianas, têm cinética hiperbólica. b) Cinética da reação catalisada por uma enzima alostérica na presença e na ausência de efetuadores alostéricos. Com igual concentração de substrato (S ), a 1 velocidade da reação varia dependendo da presença de efetuadores.

Como a ligação dos efetuadores à enzima é não covalente e reversível, o percentual de enzima que se encontra na forma ativa ou inativa depende da concentração do efetuador alostérico. Considere-se o esquema simplificado de ligação de uma enzima alostérica a seu efetuador:

Em uma situação fisiológica em que a concentração do efetuador alostérico negativo é baixa, praticamente todas as moléculas de enzima estarão ativas; à medida que a concentração do efetuador aumenta, percentuais crescentes de enzima estarão a ele ligados e, então, inativos. Quando o inibidor alostérico, que é um produto do metabolismo, for consumido por outra reação celular e sua concentração decrescer, percentuais cada vez maiores de enzima voltarão à forma ativa.

Uma mesma enzima alostérica pode ser regulada por efetuadores alostéricos positivos e negativos, que poderão estar presentes em diferentes concentrações. A velocidade da reação que ela catalisa poderá variar em uma larga faixa: a menor velocidade será obtida na presença de concentrações altas do efetuador negativo, e a maior velocidade, na presença de grandes concentrações do efetuador positivo. Desta forma, para uma mesma concentração de substrato e mesma concentração de enzima, a velocidade da reação catalisada por uma enzima alostérica pode apresentar

grande variação. Notem-se, na Figura 19.1 b, os valores diferentes de velocidade (v , v , v ), obtidos com a concentração S de substrato. 1 2 3 1

Nas vias metabólicas é frequente que um produto final atue como efetuador alostérico negativo de uma enzima alostérica que catalisa uma das

primeiras reações da via (Figura 19.2). Quando a concentração celular deste produto aumenta, sua atuação como inibidor alostérico faz diminuir a velocidade da via, restringindo sua própria produção. Este é o mecanismo conhecido como inibição por feedback ou retroinibição. À medida que o metabólito é consumido por outras sequências metabólicas e sua concentração diminui, percentuais crescentes de enzima voltam à forma ativa, aumentando a velocidade da via. A participação da enzima reguladora em uma etapa inicial da via é estratégica, constituindo um fator de economia celular, por impedir o acúmulo indevido de compostos intermediários que poderiam interferir de modo negativo sobre outras vias. Muitas vezes, o produto final de uma via atua também como efetuador alostérico positivo em outra via metabólica que utiliza o mesmo substrato inicial. Naturalmente, a regulação desta segunda via irá interferir em uma terceira via, e assim por diante. O resultado final desta série de interferências é o rigoroso ajuste da produção de cada composto ao seu consumo e o funcionamento harmônico e coordenado das reações que compõem o metabolismo.

Figura 19.2 Regulação alostérica de duas vias metabólicas hipotéticas. O composto F é efetuador alostérico negativo da enzima que catalisa a conversão de B em C e efetuador alostérico positivo da enzima que converte A em G — a oferta de A resulta em síntese aumentada de H.

Algumas coenzimas são efetuadores alostéricos importantes

A função de modulador alostérico não é exercida apenas por compostos intermediários do metabolismo, sendo muito frequente que coenzimas também desempenhem este papel. Uma coenzima pode participar de uma reação exercendo o seu papel precípuo de coenzima, ligando-se ao sítio ativo da enzima ou atuar como efetuador alostérico de outra enzima, ligando-se ao sítio alostérico e alterando a velocidade da reação — o NADH, além de ser uma coenzima transportadora de hidrogênio, atua como efetuador alostérico de enzimas do ciclo de Krebs regulando a velocidade do ciclo. Casos mais complexos ocorrem quando a coenzima de uma reação atua como inibidor alostérico da enzima que catalisa a reação, sendo reconhecida tanto pelo sítio ativo como pelo sítio alostérico. O exemplo clássico é o ATP na reação catalisada pela fosfofrutoquinase 1. Este caso constitui um aparente paradoxo, pois a ligação da coenzima ao sítio alostérico impediria sua ligação ao sítio ativo, inviabilizando a reação. Na realidade, a afinidade da coenzima pelo sítio ativo é muito maior do que pelo sítio alostérico. Em baixas concentrações da coenzima, a ligação com o sítio ativo é favorecida; em altas concentrações, a ligação com o sítio alostérico torna-se possível e a reação passa a ser inibida.

A Tabela 19.1 alista as enzimas alostéricas mais relevantes e seus principais efetuadores positivos e negativos.

Tabela 19.1 Enzimas alostéricas e seus efetuadores.

Efetuadores alostéricos

Enzima Negativos Positivos

Fosfofrutoquinase 1 ATP, Citrato AMP, Frutose 2,6-bisfosfato

Frutose 1,6-bisfosfatase Frutose 2,6-bisfosfato

6-Fosfofruto-2-quinase Fosfoenolpiruvato

Frutose 2,6-bisfosfatase Frutose 6-fosfato Fosfoenolpiruvato

Piruvato quinase Alanina Frutose 1,6-bisfosfato

Piruvato carboxilase Acetil-CoA

Piruvato desidrogenase Acetil-CoA, NADH Piruvato

Isocitrato desidrogenase NADH ADP

α-Cetoglutarato desidrogenase Succinil-CoA, NADH, ATP

Carnitina acil transferase I Malonil-CoA

Citrato liase Acil-CoA

Acetil-CoA carboxilase Acil-CoA Citrato

As coenzimas, mesmo quando não agem como efetuadores alostéricos, podem determinar a velocidade das reações das quais participam em função de sua concentração. Em cada reação a coenzima é utilizada em quantidade estequiometricamente equivalente à do substrato e, como as concentrações celulares das coenzimas são muito inferiores às dos substratos, elas são limitantes da velocidade da reação. A ação contínua das coenzimas é viabilizada pelo fato de oscilarem constantemente entre suas duas formas possíveis: NAD+ e NADH, ATP e ADP etc. As mesmas coenzimas participam de vias metabólicas diferentes, algumas das quais consomem a forma oxidada da coenzima, e outras, a forma reduzida. É o caso do ciclo de Krebs, que utiliza a forma oxidada de NAD+ e FAD e produz as respectivas formas reduzidas; em contrapartida, a cadeia de transporte de elétrons recebe as coenzimas reduzidas e oxida-as. Estas vias podem, então, trabalhar em associação utilizando uma pequena quantidade de coenzimas, reciclando-as permanentemente. É também o que ocorre com a via das pentoses-fosfato e a síntese de ácidos graxos. O NADPH, a forma predominante da coenzima no citosol, inibe as desidrogenases da via das pentoses-fosfato; somente quando processos de sínteses redutoras, como a síntese de ácidos graxos, fazem diminuir a concentração citosólica de NADPH e aumentar a de NADP+, as desidrogenases e, por consequência, a via das pentoses podem funcionar.

Tendo em vista que a soma das concentrações celulares das duas formas de uma coenzima — (NAD+ + NADH), (ATP + ADP) etc. — é constante, o aumento da concentração de uma das formas é sempre acompanhado pela diminuição da outra forma. Adicionalmente, a proporção entre as duas formas varia com o compartimento celular.

As coenzimas constituem indicadores sensíveis da fisiologia celular, e pequenas alterações na concentração de uma de suas formas são imediatamente percebidas pelas reações que se processam naquele compartimento celular e, subsequentemente, pelos ciclos metabólicos de outros compartimentos. Quando, por exemplo, a fibra muscular executa contração intensa, com um aporte insuficiente de oxigênio, o aumento da concentração mitocondrial de NADH é refletido no citosol, desviando a reação catalisada pela lactato desidrogenase no sentido da formação de lactato, regenerando NAD+ (Seção 9.1.1).