Bioquímica Básica
2.10.2 Eletroforese
Figura 2.20 Cromatografia de afinidade. Uma mistura de proteínas (representadas em cores diferentes) é passada através de uma coluna da resina (esferas brancas), contendo um ligante (espículas em verde), pelo qual a proteína de interesse tem afinidade (a); as proteínas percorrem a coluna (b) e somente a proteína de interesse é retida (c); a eluição é feita com uma solução concentrada de ligante, que, competindo com suas moléculas ligadas à matriz, libera a proteína desejada (d).
2.10.2 Eletroforese
Em um mesmo pH, proteínas diferentes apresentarão cargas líquidas diferentes, o que determinará velocidades de migração diferentes, se as proteínas forem submetidas a um campo elétrico. Este é o princípio da eletroforese. As diferentes técnicas de eletroforese empregam, invariavelmente, um suporte sólido — como papel ou gel — que evita a mistura das proteínas por convecção e permite utilizar pequenas quantidades de material.
Na eletroforese em papel, a amostra é aplicada sobre uma tira de papel ou de acetato de celulose, saturada com solução tampão. As extremidades da tira são imersas em reservatórios distintos contendo tampão, onde ficam
os eletrodos (Figura 2.21). O sistema é submetido a uma diferença de potencial apropriada e as proteínas migram em direção ao polo de carga oposta à sua, com velocidades proporcionais às suas cargas. Depois de algum tempo da corrida eletroforética, a posição das proteínas é revelada por coloração específica.
A eletroforese em gel é um dos métodos mais utilizados para analisar misturas de proteínas ou outras macromoléculas. Os géis utilizados como suporte — agarose e poliacrilamida — podem ser preparados com porosidade variável, propiciando separação das moléculas segundo o seu tamanho, além da sua carga. Proteínas menores migram mais depressa que as maiores, formando uma série de bandas definidas, que podem ser
visualizadas por coloração específica (Figura 2.22). Uma variante desta técnica, conhecida pela sigla SDS-PAGE, emprega um gel de poliacrilamida, em presença do detergente dodecilsulfato de sódio (SDS,
Figura 2.17). O SDS liga-se a grupos hidrofóbicos das proteínas, causando sua desnaturação. Esta associação, com a maioria das proteínas, segue o mesmo padrão: uma molécula de SDS a cada dois resíduos de aminoácidos. Cada molécula de detergente ligada atribui uma carga negativa à proteína desnaturada, mascarando a carga intrínseca da molécula nativa: todas as proteínas de uma mistura apresentarão carga negativa e migrarão em direção ao polo positivo. O resultado é a formação de um complexo com forma alongada, com uma densidade de cargas negativas proporcional ao comprimento da cadeia polipeptídica. Este método, portanto, separa proteínas segundo a sua massa molar. Se a proteína apresentar estrutura quaternária, suas subunidades serão desnaturadas e dissociadas por SDS e a eletroforese permite determinar a massa molar de cada uma delas. O emprego da eletroforese em gel, ao longo das diferentes etapas de um processo de purificação de proteínas, além de permitir a sua separação, fornece informações adicionais, tais como: o número de proteínas presentes na preparação, a sua massa molar e de quantas subunidades são formadas.
Figura 2.21 Eletroforese em papel. Uma mistura de três proteínas — A, B e C — é aplicada sobre uma tira de papel ou acetato de celulose, umedecida com tampão. A tira é colocada em um aparato apropriado e um campo elétrico é aplicado ao sistema (a). As proteínas migram, de sua posição inicial (b) para os polos, de acordo com a carga que apresentam no pH do tampão utilizado. Depois de algum tempo, a eletroforese é interrompida e a posição das proteínas é revelada (c).