20.2 Regulação da glicólise e da gliconeogênese

A glicólise é encontrada em todas as células de mamíferos. No fígado e no córtex renal, processa-se também a gliconeogênese, uma via antagônica à glicólise. Nestes órgãos, a regulação das duas vias é feita de forma inversa, isto é, quando uma delas está ativa, a outra está desacelerada. Uma vez que a glicólise e a gliconeogênese compartilham várias enzimas, a regulação diferencial só pode ser exercida nas etapas em que as vias diferem, incidindo sobre enzimas que pertencem a uma só das vias.

 

20.2.1 Regulação alostérica e por modi cação covalente

Há três sítios de controle da glicólise e da gliconeogênese: as conversões entre (1) glicose e glicose 6-fosfato; (2) frutose 6-fosfato e frutose 1,6-bisfosfato; (3) fosfoenolpiruvato e piruvato. Deve-se notar que as enzimas-alvo da regulação de ambas as vias catalisam reações irreversíveis. A próxima tabela resume os controles das duas vias.

 

Sítios de controle da glicólise Enzimas-alvo da regulação (Reações irreversíveis)

e gliconeogênese (Etapas

diferentes nas duas vias)

Conversão entre: Glicólise Gliconeogênese

1) Glicose e glicose 6-fosfato Glicoquinase Glicose 6-

fosfatase

2) Frutose 6-fosfato e frutose 1,6- Fosfofrutoquinase 1 Frutose 1,6-

bisfosfato bisfosfatase

3) Fosfoenolpiruvato e piruvato Piruvato quinase Fosfoenolpiruvato

carboxiquinase +

piruvato

carboxilase

Segue-se a análise dos três sítios de controle da glicólise e da gliconeogênese, no fígado, o principal órgão responsável pela gliconeogênese e no músculo.

 

Primeiro sítio de controle: glicoquinase e glicose 6-fosfatase

A primeira reação da glicólise

Glicose + ATP Glicose 6-fosfato + ADP + H+

 

é catalisada pelas hexoquinases I a III, na maioria dos tecidos de

mamíferos. As três isoenzimas exibem cinética michaeliana típica (Figura

20.6) e alta afinidade por glicose, com valores de KM entre 0,01 e 0,1 mM. Como o intervalo fisiológico de flutuação da concentração de glicose plasmática é de 5 a 8 mM, estas hexoquinases funcionam sempre em velocidade máxima (Vmáx). Ou seja, a velocidade da reação que catalisam independe do valor da glicemia, assegurando um suprimento constante de glicose para células estritamente dependentes deste açúcar, como as do cérebro e hemácias, e também para outros tecidos como o muscular, adiposo etc. Outro mecanismo de regulação permite ajustar a captação de glicose pelo tecido à sua utilização — o produto da reação, glicose 6-fosfato, é um potente inibidor das hexoquinases I-III. Quando a utilização da glicose 6-fosfato diminui, sua concentração aumenta e as hexoquinases ficam momentaneamente inibidas, limitando a fosforilação da glicose. Assim, no período absortivo, quando o nível de insulina é alto, as fibras musculares recebem glicose (GLUT 4, o transportador de glicose nestas células é estimulado por insulina) e utilizam-na para obtenção de ATP e para síntese de glicogênio. Saturados os estoques de glicogênio, a utilização da glicose 6-fosfato diminui, restringindo a captação de glicose plasmática.

No fígado, a situação é diferente, pela presença da hexoquinase IV ou

glicoquinase2. Embora promovendo a mesma reação, esta isoenzima tem propriedades cinéticas diferentes das outras hexoquinases e, até mesmo, excêntricas. Apesar de ser uma enzima monomérica, a glicoquinase exibe cooperatividade na ligação com o substrato, refletida em uma curva

sigmoide de saturação com glicose (Figura 20.6), à semelhança das enzimas alostéricas, que são oligoméricas. A concentração de glicose que estabelece a metade da Vmáx da reação catalisada pela glicoquinase — designada K 0,5 ou S0,5, em vez de KM, por não obedecer à cinética de Michaelis-Menten — é cerca de 5 mM, próxima da glicemia de jejum e dezenas de vezes maior do que o KM das outras hexoquinases. A glicoquinase difere das outras hexoquinases por ter afinidade muito menor pela glicose e por não ser inibida pela glicose 6-fosfato.

 

Figura 20.6 Curvas de saturação com glicose para as hexoquinases I a III e para a glicoquinase. Em valores próximos da concentração basal (de jejum) de glicose plasmática (5 mM), as hexoquinases funcionam em velocidade constante, ao passo que a glicoquinase catalisa a reação em velocidades proporcionais à glicemia. v /V 5 velocidades relativas de 0 máx

reação.

 

A importância do valor de K0,5 da glicoquinase é adaptar rigorosamente sua atividade à glicemia, pois aumentos do nível sanguíneo de glicose levam a aumentos significativos da velocidade da reação. É o que acontece após a ingestão de uma refeição: a maior velocidade da reação da glicoquinase permite converter o excedente de glicose em glicogênio, armazenado no fígado, e em triacilgliceróis, estocados no tecido adiposo. Nesta situação, também se eleva a velocidade do transporte por GLUT 2

(Seção 19.6.3), possibilitando a entrada de glicose nos hepatócitos. Por outro lado, quando há redução da glicemia, a baixa afinidade da glicoquinase pelo açúcar limita sua tomada pelo fígado, deixando-o disponível para os tecidos que dele não podem prescindir.

Quando a concentração plasmática de glicose é baixa, a atuação da glicoquinase é restringida, não somente devido à sua baixa afinidade pelo substrato, mas também porque a enzima é bloqueada por uma proteína reguladora. Esta proteína altera a atividade da glicoquinase e a sua localização intracelular. A proteína reguladora localiza-se no núcleo do hepatócito, para onde sequestra a glicoquinase, com a qual forma um complexo inativo. Na presença de altos níveis de glicose, a afinidade da proteína reguladora pela glicoquinase diminui, o complexo é desfeito e a glicoquinase passa para o citosol, onde pode catalisar a fosforilação da glicose. Por outro lado, a frutose 6-fosfato promove a formação do complexo nuclear inativo. O acúmulo de frutose 6-fosfato sinaliza interrupção da glicólise em etapas posteriores, coadunando-se com a inibição da glicoquinase. O glucagon, liberado na hipoglicemia, bloqueia a mobilização da enzima para o citosol — a glicoquinase transita entre o citosol e o núcleo dependendo da disponibilidade de substrato e das condições hormonais vigentes. Em resumo, as propriedades da glicoquinase, aliadas às de GLUT 2, capacitam o fígado a fazer ajustes na glicemia e utilizar a glicose apenas quando ela é abundante.

Na gliconeogênese, a etapa contrária à fosforilação da glicose é catalisada pela glicose 6-fosfatase:

 

Glicose 6-fosfato + H2O Glicose + Pi

 

O valor do KM da glicose 6-fosfatase é muito maior do que a concentração basal de glicose 6-fosfato nos hepatócitos, de modo que sua atividade é proporcional ao conteúdo intracelular de seu substrato. A produção de glicose 6-fosfato aumenta em virtude do estímulo da glicogenólise e da gliconeogênese no jejum, quando a atuação da glicose 6-fosfatase é decisiva para a exportação de glicose do fígado para outros órgãos; nesta condição, a via glicolítica encontra-se inibida. Nenhuma regulação alostérica é conhecida para a glicose 6-fosfatase; o controle existe no nível da transcrição.

 

Segundo sítio de controle: fosfofrutoquinase 1 e frutose 1,6-bisfosfatase

A conversão de frutose 6-fosfato a frutose 1,6-bisfosfato é promovida pela fosfofrutoquinase 1 na glicólise e a transformação oposta, na

gliconeogênese, pela frutose 1,6-bisfosfatase (Figura 20.7 a). Estas reações compõem a etapa mais importante e a mais complexa da regulação das duas vias. A seguir, estão indicados os principais efetuadores alostéricos das duas enzimas:

Figura 20.7 Segundo sítio de controle da glicólise/gliconeogênese: interconversão de frutose 6-fosfato e frutose 1,6-bisfosfato. As setas tracejadas azuis indicam regulações alostéricas, positivas (+) e negativas (–). a) Regulação alostérica da fosfofrutoquinase 1, a enzima da glicólise (G), e da frutose 1,6-bisfosfatase, da gliconeogênese (GNeo). A 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase está representada por um retângulo contendo os domínios com atividade de quinase e de fosfatase. b) Regulação alostérica da formação e da hidrólise de frutose 2,6-bisfosfato catalisadas pelas atividades de 6-fosfofruto-2-quinase e de frutose 2,6-bisfosfatase da enzima bifuncional. P 2– i = fosfato inorgânico (HPO 4). c) Regulação por modificação covalente da 6 - fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase. ℗ = grupo fosfato (PO 2– 3).

 

Efetuadores alostéricos

Enzimas Negativos Positivos

Fosfofrutoquinase 1 ATP; Citrato AMP; Frutose 2,6-bisfosfato

Frutose 1,6-bisfosfatase Frutose 2,6-bisfosfato —

 

A inibição da fosfofrutoquinase 1, também chamada 6-fosfofruto-1-quinase, por ATP representa uma situação clássica de regulação por feedback ou retroinibição, em que um produto final da via regula sua velocidade. A inibição por citrato permite adequar a intensidade da glicólise à do ciclo de Krebs: se o suprimento de substratos para o ciclo ultrapassa sua capacidade de utilizá-los, acumula-se citrato que, difundindo-se para o citosol, inibe a fosfofrutoquinase 1.

A ativação da fosfofrutoquinase 1 por AMP é particularmente importante no caso de músculos esqueléticos em contração vigorosa, quando aumenta a concentração de AMP. Nesta situação, também cresce a disponibilidade de substrato para a glicólise, por duas razões: a proteína quinase dependente de AMP (AMPK) promove a migração de GLUT 4 para a superfície celular, o que faz aumentar o transporte de glicose plasmática; o metabolismo do glicogênio está regulado no sentido degradativo, fornecendo glicose intracelularmente. A consequência é uma aceleração da glicólise, com produção de grande quantidade de NADH. O aporte de oxigênio para o músculo é de início insuficiente para permitir a oxidação de NADH pela cadeia de transporte de elétrons. Resulta um aumento da concentração de NADH mitocondrial, que acaba por refletir-se no citosol, pois há pouco NAD+ na mitocôndria para ser usado pelo sistema de lançadeira para oxidar o NADH citosólico. Este é, então, oxidado na reação catalisada pela lactato desidrogenase, que reduz piruvato a lactato. O NAD+ assim produzido permite o prosseguimento da glicólise anaeróbia, gerando ATP para sustentar a contração muscular. O lactato é captado pelo fígado, que é capaz de convertê-lo a glicose. Esta, uma vez na circulação, pode ser aproveitada pelas células musculares, onde o seu transporte está estimulado.

No fígado, a frutose 2,6-bisfosfato é o efetuador alostérico mais potente na ativação da fosfofrutoquinase 1 e na inibição da frutose 1,6-bisfosfatase. O controle da atividade da glicólise e da gliconeogênese vai depender da concentração desta forma bisfosforilada da frutose. Sendo assim, sua própria produção está sob controle estrito.

 

A produção de frutose 2,6-bisfosfato é submetida a controle alostérico e

hormonal

O conteúdo celular de frutose 2,6-bisfosfato está na dependência de duas ações catalíticas — quinase e fosfatase —, presentes em domínios diferentes de uma mesma enzima bifuncional, chamada 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase. A atividade de quinase é, às vezes, denominada fosfofrutoquinase 2, para distingui-la da fosfofrutoquinase 1. As duas fosfofrutoquinases são relacionadas: a fosfofrutoquinase 1, que catalisa a produção de um intermediário da glicólise, a frutose 1,6-bisfosfato, é ativada alostericamente pelo produto da reação da fosfofrutoquinase 2, a frutose 2,6-bisfosfato.

A frutose 2,6-bisfosfato é produzida pela seguinte reação, catalisada pela 6-fosfofruto-2-quinase da enzima bifuncional:

A frutose 2,6-bisfosfato, além de não ser um intermediário da glicólise, não segue qualquer via metabólica conhecida. A única alternativa para diminuir sua concentração é a hidrólise do grupo 2-fosfato, com regeneração de frutose 6-fosfato, catalisada pela frutose 2,6-bisfosfatase da enzima bifuncional:

 

Assim, quando a atividade de 6-fosfofruto-2-quinase está favorecida, aumenta a concentração de frutose 2,6-bisfosfato; o oposto ocorre quando prevalece a ação de frutose 2,6-bisfosfatase. Como já citado, a frutose 2,6-bisfosfato ativa fortemente a fosfofrutoquinase 1 e inibe a frutose 1,6-bisfosfatase, favorecendo a glicólise e restringindo a gliconeogênese

(Figura 20.7 a).

A 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase, responsável pelo nível de frutose 2,6-bisfosfato, está submetida a controle alostérico e por modificação covalente.

A regulação alostérica da enzima bifuncional está mostrada na tabela a

seguir e na Figura 20.7 b.

 

Efetuadores alostéricos

Atividades da enzima bifuncional Negativos Positivos

6-Fosfofruto-2-quinase Fosfoenolpiruvato —

Frutose 2,6-bisfosfatase Frutose 6-fosfato Fosfoenolpiruvato

Deste modo, o teor de frutose 2,6-bisfosfato depende diretamente do nível de frutose 6-fosfato e inversamente do nível de fosfoenolpiruvato. O aumento da concentração de fosfoenolpiruvato indica (1) que este composto não está sendo utilizado pela piruvato quinase ou (2) que está sendo produzido pela gliconeogênese. Em qualquer dos dois casos, os seus efeitos sobre as atividades da enzima bifuncional levam à queda da concentração de frutose 2,6-bisfosfato, diminuindo a velocidade da glicólise e abrindo caminho para que se complete a gliconeogênese. Por outro lado, altos níveis de frutose 6-fosfato decorrem de altos níveis de glicose — o acúmulo de frutose 6-fosfato assinala a necessidade de sua utilização pela glicólise e impede a síntese de glicose quando este açúcar está disponível. Isto é obtido pelo bloqueio exercido pela frutose 6-fosfato sobre a frutose 2,6-bisfosfatase: a concentração de frutose 2,6-bisfosfato aumenta, estimulando a fosfofrutoquinase 1 e a oxidação da glicose e inibindo a frutose 1,6-bisfosfatase e a produção de glicose.

Em mamíferos, foram descritas quatro isoenzimas da 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase, que apresentam localização e mecanismos de regulação característicos. No caso da isoenzima hepática, o predomínio de uma de suas duas atividades depende de regulação por modificação covalente. Sob estímulo de glucagon, principalmente, e de adrenalina, a via de transdução de sinal da PKA é acionada e a enzima bifuncional é fosforilada em um resíduo de serina do segmento aminoterminal: sua

atividade de quinase é inibida e a de fosfatase é estimulada (Figura 20.7 c), o que faz reduzir a concentração de frutose 2,6-bisfosfato. Por consequência, a fosfofrutoquinase 1 fica inativa, impedindo a glicólise, e a frutose 1,6-bisfosfatase tem sua atividade restabelecida, levando ao estímulo da gliconeogênese.

A enzima bifuncional de músculos esqueléticos difere da isoenzima de fígado por não conter sítios de fosforilação na porção aminoterminal, não sofrendo regulação por modificação covalente.

Em períodos de jejum, o glucagon estimula a degradação do glicogênio hepático, com produção de glicose 1-fosfato, que é isomerizada a glicose 6-fosfato. À medida que se prolonga o jejum e vai sendo esgotado o suprimento de glicogênio hepático, aumenta a importância da gliconeogênese para a produção de glicose. O fluxo gliconeogênico soma-se à degradação do glicogênio, aumentando a produção de glicose 6-fosfato. Como nesta situação a glicólise está inibida, o destino da glicose 6-fosfato é ser convertida a glicose e exportada do fígado, contribuindo para a correção da baixa glicemia que originou a liberação do glucagon.

A insulina, liberada em hiperglicemia, tem efeito oposto ao glucagon e à adrenalina. Por intermédio de diversos mecanismos, que incluem a atuação da fosfoproteína fosfatase-1 (PP-1), a insulina promove a desfosforilação da 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase, que passa a exibir apenas a atividade de quinase. Os níveis de frutose 2,6-bisfosfato aumentam, ativando a fosfofrutoquinase 1 e inibindo a frutose 1,6-bisfosfatase: a glicólise é ativada e a gliconeogênese é bloqueada, frente a situações de grande oferta de glicose, como após as refeições.

 

No músculo cardíaco, a degradação de glicogênio é concomitante com a

ativação da glicólise

A descrição dos efeitos da frutose 2,6-bisfosfato no fígado mostra que, em presença de glucagon e adrenalina, sua concentração diminui, impedindo a glicólise. Em decorrência, o glicogênio hepático nunca é utilizado pelo próprio hepatócito, destinando-se sempre à manutenção da glicemia. No músculo cardíaco, a situação é oposta: o glicogênio é sempre utilizado pelas próprias fibras musculares, porque quando sua degradação está estimulada, a via glicolítica também está.

A diferença das regulações reside na 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase. A isoenzima bifuncional de músculo cardíaco apresenta em sua porção carboxila terminal vários resíduos de serina, passíveis de fosforilação por proteína quinases componentes de diversas vias de sinalização. Tais modificações covalentes ativam a 6-fosfofruto-2-quinase, em vez de inibir, como ocorre com a isoenzima hepática, a concentração de frutose 2,6-bisfosfato aumenta, estimulando a fosfofrutoquinase 1 e, portanto, a glicólise.

Adrenalina, hipóxia, insulina e contração intensa ativam a glicólise no miocárdio por determinarem a fosforilação e a estimulação da atividade de quinase da enzima bifuncional. A liberação de adrenalina sinaliza a necessidade de produção de ATP para sustentar o trabalho muscular e seu efeito é mediado pela proteína quinase A (PKA). A glicólise no coração também é estimulada quando o fluxo sanguíneo é deficiente, como na isquemia do miocárdio. Nestas condições, o déficit de oxigênio impede o prosseguimento da fosforilação oxidativa e a única fonte de ATP é a glicólise: a síntese de ATP é reduzida, acarretando aumento na concentração de AMP. A consequência é a estimulação da proteína quinase dependente de AMP (AMPK) que fosforila a enzima bifuncional, coadjuvando o efeito da PKA. A resposta à insulina inclui a ativação da via da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e da proteína quinase B (PKB), que adiciona grupos fosfato à enzima bifuncional, acarretando a estimulação da glicólise; assim, quando os níveis sanguíneos de glicose se elevam, o coração pode passar a usar glicose em vez de ácidos graxos.

Há indicações que, nos músculos esqueléticos, o exercício faz aumentar o nível de frutose 2,6-bisfosfato. Este aumento deve-se à mudança do perfil isoenzimático da enzima bifuncional: há diminuição da isoenzima de músculo e aumento da isoenzima cardíaca.

 

Terceiro sítio de controle: piruvato quinase e piruvato carboxilase + fosfoenolpiruvato carboxiquinase

A regulação do terceiro sítio incide especialmente sobre a piruvato quinase.

O efetuador alostérico positivo da piruvato quinase é a frutose 1,6-

bisfosfato (Figura 20.8 a). Assim, quando a regulação da fosfofrutoquinase 1 estabelece uma alta atividade para esta enzima, seu produto, a frutose 1,6-bisfosfato estimula a piruvato quinase, “preparando-a” para receber o fluxo de substratos da via glicolítica. A piruvato quinase hepática é inibida por alanina. Esta regulação é fundamental durante períodos prolongados de jejum, quando o fígado recebe quantidades apreciáveis de alanina, uma das formas de transporte dos aminoácidos provenientes do catabolismo de proteínas musculares. A alanina é um composto gliconeogênico e, para a síntese de glicose, deve sofrer transaminação, originando piruvato. O piruvato é transformado em oxaloacetato e este, em fosfoenolpiruvato, que segue a via gliconeogênica. A inibição da piruvato quinase por alanina impede que o fosfoenolpiruvato formado possa ser reconvertido a piruvato. Como descrito no segundo sítio de controle da glicólise/gliconeogênese, este composto atua como efetuador alostérico da 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfatase, inibindo sua atividade de quinase e estimulando a de fosfatase. Decresce a concentração de frutose 2,6-bisfosfato, cessando o estímulo sobre a fosfofrutoquinase 1 e o bloqueio da frutose 1,6-bisfosfatase. As consequências são a interrupção da via glicolítica e a ativação simultânea da gliconeogênese.

 

Figura 20.8 Terceiro sítio de controle da glicólise/gliconeogênese: piruvato quinase. a) Regulação alostérica. A enzima é estimulada por frutose 1,6-bisfosfato, cuja produção cresce com a disponibilidade de glicose; é inibida por alanina e, neste caso, o fosfoenolpiruvato inibe a formação de frutose 2,6-bisfosfato, o principal ativador da fosfofrutoquinase 1: a glicólise é desacelerada e a gliconeogênese, favorecida. b) Regulação por modificação covalente. Sob estímulo de glucagon, a piruvato quinase é fosforilada pela proteína quinase A (PKA), tornando-se inativa e favorecendo a gliconeogênese; na presença de insulina, a remoção de grupo fosfato pela fosfoproteína fosfatase 1 (PP-1) ativa a enzima, propiciando o consumo de glicose pela glicólise.

 

A piruvato quinase dos hepatócitos também sofre modificação

covalente (Figura 20.8 b): a fosforilação converte a forma ativa em inativa. No jejum, o glucagon estimula a via da PKA e esta inativação se processa, aumentando a concentração de fosfoenolpiruvato. Em hiperglicemia, sob ação da insulina, a piruvato quinase é desfosforilada pela proteína fosfatase 1 (PP-1), tornando-se ativa — o sentido das regulações é invertido.