Bioquímica Básica
2.9 Purificação de proteínas — Estratégia geral
2.9 Puri cação de proteínas — Estratégia geral
A purificação de uma proteína inicia-se com a liberação da proteína do material biológico onde ela ocorre — órgãos, tecidos ou células isoladas como hemácias, bactérias e leveduras — pelo rompimento destas estruturas, que pode ser obtido por métodos diversos. A homogeneização mecânica em meio isotônico, por exemplo, produz o maceramento dos tecidos (ou órgãos) e a lise das células, originando um extrato celular, constituído por fragmentos de membrana plasmática, organelas (núcleos, mitocôndrias etc.) e o citosol. Os diversos componentes celulares podem ser separados por fracionamento celular, um procedimento que consiste em centrifugar o extrato celular em velocidades progressivamente maiores. Geralmente, quanto menor for uma estrutura, maior será a força centrífuga necessária para sedimentá-la; como os componentes celulares diferem em tamanho, eles sedimentarão em velocidades diferentes, podendo, assim, ser separados uns dos outros. Quando a proteína desejada localiza-se apenas em uma das frações obtidas — mitocôndrias, por exemplo — o fracionamento celular propicia uma purificação inicial considerável.
Uma vez conseguida uma preparação contendo a proteína, esta pode ser separada de outras proteínas e de outros tipos de moléculas por métodos que se baseiam em solubilidade, tamanho, carga elétrica ou afinidade por determinados compostos. O método de purificação a ser escolhido dependerá da particular proteína que se pretende isolar e, usualmente, empregam-se combinações sequenciais de diferentes métodos. Frequentemente, o primeiro passo empregado para a separação de proteínas de extratos brutos é a precipitação por adição de sais (sulfato de amônio é o mais comumente usado) ou solventes orgânicos miscíveis com água — a separação, neste caso, baseia-se em diferenças de solubilidade apresentadas pelas proteínas. Estas técnicas permitem uma purificação parcial e devem ser seguidas de outras, mais seletivas, como cromatografia e eletroforese.
A purificação da proteína deve ser monitorada ao longo das diferentes etapas de separação e, para isso, é necessário dispor de um método que permita detectar e quantificar especificamente a proteína de interesse. Esta situação está exemplificada na Seção 5.5.1, com a purificação de uma enzima. A estratégia descrita para o isolamento de proteínas aplica-se, basicamente, à purificação de muitas outras moléculas biológicas.