3.2 Ligação do oxigênio à hemoglobina

A hemoglobina predominante (mais de 95% do total) nos seres humanos adultos (HbA) é formada por quatro cadeias polipeptídicas, duas α (com 141 aminoácidos) (α1 e α2) e duas β (com 146 aminoácidos) (β1 e β2). Apesar de apresentarem diferenças na sequência de aminoácidos, os dois tipos de subunidades e a mioglobina exibem estrutura terciária semelhante

(Seção 2.4). Apresentam a maior extensão da cadeia formada por segmentos em α-hélice, conectados por regiões sem estrutura regular. As hélices recebem letras e os seus aminoácidos constituintes, números; por exemplo, F8 é o oitavo aminoácido da hélice F.

Na estrutura quaternária da hemoglobina, as ligações não covalentes são muito mais numerosas entre subunidades diferentes — α/β — do que entre subunidades iguais — α/α e β/β. O resultado desta associação desigual é uma molécula tetramérica composta pela união de dois dímeros, α 1 β1 e α2

β 2 (Figura 3.1 a). O contato entre os dois dímeros é estabelecido nas

interfaces designadas α β e α β (Figura 3.1 b). Estas interfaces sofrem 1 2 2 1 modificações importantes na oxigenação e desoxigenação da hemoglobina.

3.2 Ligação do oxigênio à hemoglobina

O grupo prostético heme é o sítio de ligação do oxigênio

A hemoglobina é uma hemoproteína (Seção 2.6): cada uma de suas

cadeias está associada a um grupo prostético heme (Figura 3.2). O heme é uma molécula de porfirina contendo um íon de ferro, que, na mioglobina e na hemoglobina, permanece no estado ferroso, Fe2+. As porfirinas consistem em um anel plano, resultante da fusão de quatro núcleos pirrólicos, com substituintes variáveis, que caracterizam seus subtipos; na hemoglobina é

encontrado o isômero denominado protoporfirina IX1. O heme confere à hemoglobina, e ao sangue, sua cor característica.

Figura 3.1 Estrutura quaternária da hemoglobina. a) A associação entre subunidades diferentes é mais forte que entre subunidades iguais: quando a hemoglobina é suspensa em solução concentrada de ureia, o tetrâmero dissocia-se em dímeros αβ; os grupos heme não estão mostrados. b) Esquema enfocando as áreas de contato entre os dímeros, com a interface α1β 2à frente; cada grupo heme fica alojado em um bolsão hidrofóbico.

O grupo heme localiza-se dentro de uma cavidade hidrofóbica, delimitada sobretudo por aminoácidos apolares, que estabelecem interações hidrofóbicas com o anel porfirínico. Este ambiente apolar torna possível a ligação do oxigênio ao ferro (Fe2+), sem que ele seja oxidado ao estado férrico (Fe3+).

O íon de ferro fica no centro do grupo heme, formando seis ligações: com os quatro átomos de nitrogênio do anel porfirínico, com a cadeia polipeptídica — em um resíduo de histidina, a His F8, chamada de histidina proximal — e pode, ainda, ligar-se reversivelmente a uma molécula de oxigênio (O 2). As duas últimas ligações são perpendiculares ao plano do

anel e situam-se em lados opostos do plano do heme (Figura 3.2). Ao sítio de ligação do ferro com oxigênio podem ligar-se outras moléculas pequenas, como CO e H S, com afinidade ainda maior que o oxigênio, o 2

que explica sua alta toxidez para organismos aeróbios.

Figura 3.2 Estrutura do grupo heme (protoporfirina IX e um íon de ferro) da oxi-hemoglobina. a) O íon Fe2+ liga-se aos átomos de nitrogênio dos núcleos pirrólicos (numerados de I a IV) do anel porfirínico (em preto, com as cadeias laterais em azul), à molécula de oxigênio e ao grupo imidazólico da histidina proximal (His F8). b) Representação tridimensional do heme e das ligações do Fe2+.

Uma molécula de hemoglobina totalmente oxigenada contém quatro moléculas de O e é denominada oxi-hemoblobina (oxi-Hb ou HbO ), em 2 2 contraposição à forma desprovida de oxigênio, chamada desoxi-hemoglobina (desoxi-Hb ou Hb). A ligação do oxigênio ao grupo heme altera a cor da hemoglobina, que passa de azulada (sangue venoso) a vermelha (sangue arterial).

A ligação com oxigênio desencadeia alterações na conformação da

hemoglobina

As hemoglobinas oxigenada e desoxigenada têm estruturas tão diferentes, que apresentam formas cristalinas distintas.

A oxigenação da hemoglobina determina alterações estruturais sequenciais. Na desoxi-Hb, os íons de ferro estão situados fora do plano do grupo heme e o anel porfirínico é ligeiramente côncavo. Quando o oxigênio se liga ao heme de uma das subunidades, o ferro se desloca para o plano do anel, que se torna mais achatado, arrastando a His 87 à qual está ligado

(Figura 3.3) e, consequentemente, o próprio segmento da cadeia polipeptídica que contém este aminoácido. A movimentação deste segmento desloca um segmento contíguo, segmentos estes que compõem as interfaces α 1 β2 e α2 β1 entre os dímeros, provocando o rompimento de várias ligações não covalentes. Há uma alteração da disposição relativa dos dímeros, que resulta em estreitamento do bolsão entre as subunidades β

(Figura 3.4). Deste modo, o pequeno deslocamento do ferro (cerca de 0,5 Å), causado pela ligação do oxigênio ao grupo heme de uma subunidade, dispara uma sequência de eventos mecanicamente transmitidos, que alteram a estrutura quaternária da hemoglobina.

Figura 3.3 A ligação do oxigênio ao Fe2+ do grupo heme provoca o deslocamento do ferro para o plano do anel porfirínico, que se torna mais achatado, deslocando a histidina proximal e iniciando uma série de alterações estruturais na hemoglobina. (Adaptada de Berg, J. M.; Tymoczko, J. L. & Stryer, L.: Biochemistry, 5th edition. Freeman and Company, 2002.)

Figura 3.4 Estrutura tridimensional da desoxi-Hb (a) e oxi-Hb (b), com as cadeias β em primeiro plano. Na transformação desoxi-Hb → oxi-Hb, há movimentação de um dímero em relação ao outro, simbolizada pelas setas largas cinza sobre a molécula de oxi-Hb e evidenciada pela mudança na posição relativa de alguns aminoácidos; ocorre, ainda, um estreitamento da cavidade central entre as cadeias β, indicado pelas setas finas pretas.

A hemoglobina liga-se ao oxigênio cooperativamente

A ligação do oxigênio implica rearranjos moleculares sucessivos, já que a mudança de conformação de uma subunidade acarreta alteração das outras. Estes movimentos coordenados determinam a cinética de oxigenação da hemoglobina: a ligação da primeira molécula de oxigênio facilita o preenchimento dos outros grupos heme. As sucessivas conformações assumidas pela molécula de hemoglobina têm afinidades crescentes pelo oxigênio: a ligação da quarta molécula é 300 vezes mais eficiente do que a ligação da primeira. A esse fenômeno dá-se o nome de cooperatividade. Como a cooperatividade resulta da influência exercida por um sítio sobre outros localizados em subunidades diferentes de uma mesma molécula, só pode ser apresentada por proteínas oligoméricas, como a

hemoglobina e as enzimas alostéricas (Seção 19.2.1). No caso da mioglobina, formada por uma única cadeia polipeptídica e um único grupo heme, não existe cooperatividade.

A diferença no mecanismo de oxigenação de mioglobina e hemoglobina está traduzida nas cinéticas de oxigenação destas proteínas em função da

pressão parcial de oxigênio (pO2) (Figura 3.5): enquanto a mioglobina apresenta uma curva hiperbólica, a hemoglobina exibe uma curva sigmoide. A forma hiperbólica é esperada para uma proteína com um único sítio de ligação. A curva sigmoide indica que a ligação das moléculas de oxigênio aos quatro heme não é independente, e que o preenchimento de um heme aumenta a afinidade por oxigênio dos outros heme.

A cooperatividade exibida pela hemoglobina proporciona uma resposta mais sensível a variações na concentração de oxigênio, adequando-se, com perfeição, à sua função de transportar este gás. No sangue arterial que sai dos pulmões dos seres humanos, a pO2 é alta, em média, 100 mmHg (ou 100 torr ou 13,3 kPa2) e a hemoglobina fica 98% saturada com oxigênio; nos tecidos extrapulmonares, onde a pO 2 é baixa (sangue venoso), ela libera grande parte do oxigênio. Por exemplo, a pO nos capilares que irrigam um 2 músculo em atividade é cerca de 20 mmHg e a saturação da hemoglobina cai para 33%, ou seja, ela libera 65% do oxigênio associado. A mioglobina seria um transportador bem menos eficiente, já que menos de 10% do seu oxigênio seria liberado nessas condições. Todavia, sua alta afinidade por oxigênio, mesmo em baixa pO2, permite que ela desempenhe eficientemente a função de reservatório de oxigênio nos músculos de mamíferos, onde é encontrada em abundância. A mioglobina tem afinidade por oxigênio maior que a hemoglobina em qualquer pO , o que permite que ele seja transferido 2 do sangue para o músculo, onde fica associado à mioglobina e pode ser utilizado pelas mitocôndrias das células musculares.