19.4.1 AMP cíclico e a via da proteína quinase A

A produção do segundo mensageiro da ação hormonal é uma etapa do

processo de transdução de sinal

A transdução de sinal, iniciada com a ligação do hormônio a seu receptor na membrana plasmática, leva à produção intracelular de um segundo mensageiro da ação hormonal. A atuação deste segundo mensageiro sobre as reações processadas na célula-alvo resulta na resposta característica de um tecido a um determinado hormônio, sem que este tenha sido introduzido na célula. O processo compreende, geralmente, o acoplamento do complexo hormônio-receptor a uma proteína G, seguido pela interação desta proteína com uma enzima, que, então, catalisa a produção do segundo mensageiro. As proteínas G compõem uma grande família de proteínas transdutoras, capazes de transformar sinais moleculares externos em sinais intracelulares; são designadas G pela propriedade de ligarem-se a nucleotídios de guanina, GDP e GTP.

A alteração da concentração dos segundos mensageiros provoca, como resposta ao estímulo inicial, mudanças na fisiologia celular, devidas à alteração da conformação de proteínas, por fosforilação ou ligação com íons cálcio ou modificação do funcionamento (abertura ou fechamento) de canais iônicos.

Os segundos mensageiros de hormônios constituem uma classe de compostos muito diversificados estruturalmente. Alguns exemplos importantes são: AMP cíclico, GMP cíclico, íons Ca2+ e derivados de fosfolipídios de membrana.

O AMP cíclico (cAMP), ou adenosina 3′ ,5′ -monofosfato, é formado a partir de ATP, por ação da adenilato ciclase, uma enzima integrada na membrana plasmática. A presença de cAMP nas células irá provocar alterações na atividade de determinadas enzimas e, por consequência, no metabolismo. Estas modificações são temporárias, porque o cAMP pode ser

hidrolisado a 5′ -AMP pela reação catalisada pela fosfodiesterase (Figura

19.3). A concentração de cAMP e a resposta celular ao hormônio estão na dependência das atividades relativas da adenilato ciclase e da fosfodiesterase.

Figura 19.3 Síntese e hidrólise de cAMP. A adenilato ciclase catalisa a conversão de ATP em cAMP, por formação de uma ligação fosfodiéster entre os carbonos 3′ e 5′ da ribose e liberação de pirofosfato (PP ). A ligação i é hidrolisada pela fosfodiesterase, originando 5′-AMP.

A transdução de sinal dos hormônios que utilizam cAMP como segundo mensageiro é, então, efetuada por três proteínas presentes na membrana plasmática: o receptor hormonal, a adenilato ciclase e uma proteína G, que conecta as duas primeiras. São compostas de três subunidades, α, β e γ, e é a subunidade α que tem a capacidade de associação a GDP ou GTP: na ausência do hormônio está ligada a GDP e na presença dele, a GTP. Os

eventos (Figura 19.4 a) que levam à produção de cAMP a partir do estímulo hormonal são:

1. Na ausência do hormônio, a proteína G apresenta-se com as

subunidades α-β-γ associadas e a subunidade α unida a GDP; a adenilato ciclase está inativa.

2. Quando o hormônio se liga ao receptor, este sofre uma mudança de

conformação, que provoca sua ligação à proteína G. Esta união altera a estrutura da proteína G, fazendo diminuir a afinidade da subunidade α por GDP e aumentar a sua afinidade por GTP; em consequência, o GDP é trocado por GTP.

3. A ligação de GTP à subunidade α promove sua dissociação das

outras duas subunidades da proteína G, obtendose dois conjuntos: β-γ e α-GTP. Este último associa-se à adenilato ciclase, formando o complexo α-GTP-adenilato ciclase. A ligação de α-GTP estimula a enzima, que catalisa a conversão de ATP em cAMP.

A estimulação da adenilato ciclase tem duração limitada. A própria subunidade α da proteína G tem uma discreta atividade GTPásica, sendo capaz de catalisar a hidrólise lenta de GTP a GDP. Quando isto acontece, há dissociação do complexo α-GDP-adenilato ciclase: a enzima, inativa, é liberada e a subunidade α volta a associar-se às subunidades β-γ, reconstituindo a proteína G, que pode participar de outro ciclo de transdução de sinal. Em virtude da ação GTPásica da subunidade α, a atividade da adenilato ciclase depende estritamente de estimulação hormonal, cessando na ausência do hormônio.

O mecanismo descrito refere-se à ação de hormônios que ativam a adenilato ciclase. Outros hormônios determinam inibição da adenilato ciclase: são reconhecidos por outro tipo de receptor, que se liga a outro tipo de proteína G, embora o processo que produz a inibição seja análogo ao do estímulo. Ou seja, existem dois tipos de proteínas G: o primeiro deles, designado GS, com subunidade α chamada αS (s de stimulation), está associado a receptores de hormônios que provocam o estímulo da adenilato

ciclase, denominados RS (Figura 19.4 b). O segundo tipo é chamado Gi, com subunidade α indicada por αi (i de inhibition), e intermedeia a ação de hormônios que levam à inibição da adenilato ciclase. Após a ligação desta categoria de hormônio a seu receptor, do tipo R , os eventos são i semelhantes ao caso do estímulo: troca de GDP por GTP e ligação de αi-GTP à adenilato ciclase. Esta ligação, entretanto, provoca inibição da enzima. Alguns hormônios, como a adrenalina, podem ligar-se, em tecidos diferentes, a receptores R ou R . S i

Figura 19.4 a) Transdução de sinal de hormônios que estimulam a adenilato ciclase. 1) Situação prévia à ligação do hormônio ao receptor: proteína G com as três subunidades (a-b-g) associadas e GDP ligado à subunidade a; adenilato ciclase inativa. 2) A formação do complexo hormônio-receptor altera o receptor, causando sua união à proteína G, que, então, troca GDP por GTP. 3) A ligação de GTP à subunidade a da proteína G determina dissociação das subunidades b-g; o complexo a-GTP liga-se à adenilato ciclase, ativando-a. b) Representação esquemática da regulação da adenilato ciclase por hormônios estimuladores (H 1) e inibidores (H2) da sua atividade. O complexo H 1-RS une-se a uma proteína G Sque ativa a adenilato ciclase, enquanto o complexo H-R interage com uma proteína G que inibe 2 i i a enzima.

O funcionamento de vias de transdução de sinal envolvendo proteínas G pode ser alterado por toxinas bacterianas, ocasionando a instalação de moléstias. A toxina da cólera, por exemplo, é uma enzima que catalisa a transferência de uma unidade ADP-ribose do NAD+ (a remoção da

nicotinamida da molécula de NAD+produz ADP-ribose — Figura 9.2) para um resíduo de arginina da subunidade α S de uma proteína GS. Esta modificação covalente determina a perda da atividade GTPásica de α S, que permanece ligada a GTP, mantendo a adenilato ciclase estimulada mesmo na ausência do hormônio. A toxina da cólera liga-se à superfície das células da mucosa intestinal e é internalizada; uma vez no citosol, promove a modificação da GS. O aumento da concentração intracelular de cAMP altera o funcionamento de canais iônicos, acelerando a secreção de íons para a luz intestinal, acompanhada de enorme afluxo de água, ocasionando a diarreia profusa característica da cólera.

A toxina da coqueluche (ou tosse comprida) catalisa a ADP-ribosilação da subunidade α de uma proteína G das células epiteliais do trato i i respiratório. Neste caso, α i permanece associada a GDP e às subunidades β e γ, ficando impossibilitada de complexar-se com a adenilato ciclase e causar a sua inibição; o resultado é a ativação permanente da enzima. A concentração elevada de cAMP, por mecanismos desconhecidos, provoca dano ao epitélio do trato respiratório, que se reflete em acessos de tosse violenta.

Os níveis de cAMP podem ainda ser aumentados por inibição da fosfodiesterase de cAMP, causada por derivados de purinas, como cafeína e teofilina. Estas substâncias também atuam como antagonistas dos efeitos

fisiológicos da adenosina. Este nucleosídio, assim como o ATP (Seção

8.1.2), ocorre também no espaço extracelular e atua como neurotransmissor, ligando-se a receptores purinérgicos presentes na membrana plasmática da maioria das células de mamíferos. Estão descritos quatro receptores de adenosina, do tipo 7TM, que interagem com proteínas G. A adenosina extracelular participa da regulação dos sistemas cardiovascular, nervoso, imunológico e respiratório; neste último caso, provoca broncoconstrição. A teofilina provoca dilatação brônquica e é empregada no tratamento da asma há mais de 70 anos; apesar disto, seu mecanismo de ação ainda é incerto, podendo ser devido à inibição da fosfodiesterase (o aumento da

concentração de cAMP causa relaxamento de músculos lisos — Seção 22.6) ou ao bloqueio dos receptores de adenosina, impedindo a broncoconstrição.

O cAMP estimula a proteína quinase A

O aumento intracelular na concentração de cAMP, consequente à ação hormonal, resulta na ativação de um tipo particular de proteína quinase, chamada proteína quinase dependente de cAMP ou proteína quinase A (PKA). É uma enzima oligomérica, composta por subunidades catalíticas e subunidades reguladoras que, quando associadas, formam um complexo inativo. O cAMP liga-se às subunidades reguladoras, provocando a

dissociação das subunidades catalíticas, que se tornam ativas (Figura 19.5), capazes de promover a transferência do grupo fosfato do ATP para resíduos de treonina ou serina de diversas proteínas.

Figura 19.5 Ativação da proteína quinase dependente de cAMP (PKA). A molécula da enzima inativa é formada por quatro subunidades: duas catalíticas (C) e duas reguladoras (R). A ligação de cAMP às subunidades reguladoras libera as subunidades catalíticas, então ativas.

A via de transdução de sinal hormonal descrita até aqui — hormônio complexado ao receptor RS da membrana plasmática/ligação à proteína G /adenilato ciclase estimulada/síntese de cAMP/PKA ativada — é S

denominada via da PKA. Todas as proteínas componentes da via, desde o receptor até a fosfoproteína fosfatase, que finaliza a transdução de sinal (ver a seguir), ficam agrupadas em regiões diferenciadas da membrana, os rafts

(Seção 7.2), formando uma unidade de transdução de sinal muito eficiente.

A ação catalítica da PKA pode ser exercida sobre inúmeras proteínas; algumas tornam-se ativas em virtude da fosforilação; outras perdem a atividade. Sendo assim, um mesmo hormônio atuando em vários tecidos, apesar de provocar a mesma sequência inicial de eventos — ativação da via da PKA —, determina alterações diferentes do padrão metabólico em cada tecido, porque as enzimas que serão fosforiladas em cada tecido também serão diferentes. A resposta metabólica obtida dependerá da equipe de proteínas sintetizadas pelo tecido-alvo do hormônio que causou a estimulação da PKA.

A atuação de muitos hormônios peptídicos e de catecolaminas e o desempenho de diversas atividades fisiológicas resultam de ativação da via da PKA. Alguns exemplos:

1. Hormônios da hipófise: hormônios adrenocorticotrófico (ACTH),

tireoide-estimulante (tirotrofina ou TSH), luteinizante (LH) e foliculoestimulante (FSH), atuando em glândulas endócrinas, onde estimulam a liberação e/ou síntese de hormônios específicos — cortisol, hormônios tireoidianos e hormônios sexuais.

2. Hormônio antidiurético (vasopressina), atuando no controle da

reabsorção de água nos túbulos renais.

3. Atividades sensoriais como a visão e o olfato (Seção 19.5).

4. Adrenalina e glucagon (Seção 19.6).

As fosfoproteína fosfatases antagonizam os efeitos da PKA

A fosforilação de proteínas pode ser revertida pelas fosfoproteína

fosfatases (PP — Seção 19.2.2), que hidrolisam os grupos fosfato adicionados pelas proteína quinases, PKA inclusive. As próprias fosfoproteína fosfatases são reguladas por modificação covalente: são substratos da PKA e de outras proteína quinases. Um exemplo importante em eucariotos é a fosfoproteína fosfatase-1 (PP-1), que participa da regulação de uma grande variedade de processos celulares. PP-1 é constituída por uma subunidade catalítica, que apresenta baixa atividade e ausência de especificidade para o substrato. Só é capaz de atuar efetivamente, e sobre determinados substratos, quando está associada a uma das 200 subunidades reguladoras diferentes já identificadas. Esta seria a razão da grande versatilidade de atuação de PP-1, porque, dessas associações, resultam formas diferentes da enzima, com especificidade de substrato, localização celular e regulação distintas.

Uma das vias metabólicas reguladas por PP-1 é o metabolismo do glicogênio em mamíferos. O glicogênio e as enzimas que atuam no seu metabolismo e que o regulam organizam-se em grânulos citoplasmáticos. As subunidades reguladoras de PP-1, GM em músculos esqueléticos e GL no fígado, funcionam como um elo de ligação entre a subunidade catalítica, o glicogênio e as enzimas-substrato de PP-1 (glicogênio sintase, glicogênio

fosforilase, glicogênio fosforilase quinase — Seção 20.1), localizadas nos grânulos.

Figura 19.6 Regulação da fosfoproteína fosfatase 1 (PP-1) em músculos esqueléticos de mamíferos. Na presença de insulina, a adição de grupos fosfato (P) à subunidade GM ativa a subunidade catalítica de PP-1 (PP-1-C), que desfosforila suas três enzimas-substrato: a glicogênio sintase (GS) é ativada; a glicogênio fosforilase (GP) e a glicogênio fosforilase quinase (GPK) são inibidas. Com adrenalina, a fosforilação de GM pela proteína quinase dependente de cAMP (PKA) causa sua separação da subunidade catalítica, que se dissocia do grânulo de glicogênio. A interação da subunidade catalítica com o Inibidor-1 (I-1), também fosforilado pela PKA, resulta no bloqueio da PP-1. (Adaptada de Nelson DL, Cox MM: Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed. W. H. Freeman, 2008.)

A subunidade GM de músculos apresenta sítios em sua estrutura que

podem ser fosforilados por diferentes proteína quinases (Figura 19.6). Com insulina, a fosforilação de um desses sítios, provavelmente pela PKB, ativa PP-1, que desfosforila as três enzimas-substrato, levando à ativação da glicogênio sintase e à inativação da glicogênio fosforilase e da glicogênio fosforilase quinase — PP-1 promove o acúmulo de glicogênio, por estimular a síntese e inibir a degradação do polissacarídio. Sob estímulo de adrenalina, a adição de grupos fosfato à subunidade GM pela PKA provoca a dissociação da subunidade catalítica, que se desliga dos grânulos, ficando impossibilitada de atuar sobre os seus substratos. Uma vez livre no citosol, PP-1 pode interagir com uma proteína inibidora, chamada de Inibidor-1 (I-1), e tornar-se totalmente inativa. Para que isto ocorra, o Inibidor-1 deve estar fosforilado, à custa da PKA. Assim, a PKA mantém a PP-1, uma enzima cuja ação é antagônica à sua, na forma inativa.