11.9 Oxidação do NADH citosólico, 156 11.10Transporte de metabólitos através da membrana interna da mitocôndria

IV. NADH e FADH 2 pela cadeia de transporte de elétrons e

fosforilação oxidativa.

Em cada uma das etapas I a III, verifica-se a formação de coenzimas reduzidas e de ATP (por fosforilação no nível do substrato), e somam-se os seus valores. Na fase IV, obtém-se a quantidade de ATP produzida por fosforilação oxidativa acoplada à oxidação do total de coenzimas, considerando-se a síntese de 3 ATP para cada NADH e 2 para cada FADH 2. A oxidação completa de um mol de glicose está discriminada na tabela seguinte:

Mols de

ATP

Etapas I II III I+II+III IV formados

Coenzimas produzidas 2 NADH 2 NADH 6 NADH 10 NADH 30 30

2 FADH 2 FADH ATP 4 2 2

4 ATP

Fosforilação no nível do substrato 2 ATP — 2 ATP 4 ATP — 4

Total 38

A oxidação biológica da glicose em condições aeróbias produz, portanto, 38 ATP. A equação geral deste processo é:

C H O + 6 O + 38 ADP + 38 P → 6 CO + 6 H O + 38 ATP 6 12 6 2 i 2 2

Em algumas células de eucariotos, o rendimento da oxidação da glicose é reduzido de 38 para 36 ATP porque a oxidação de cada NADH produzido no citosol (glicólise) permite a síntese de apenas 2 ATP (seção seguinte).

11.9 Oxidação do NADH citosólico

A membrana interna da mitocôndria é impermeável a NADH (e NAD+), de modo que a oxidação do NADH citosólico não pode ser feita diretamente pela cadeia de transporte de elétrons. Entretanto, as coenzimas reduzidas no citosol podem ser indiretamente oxidadas pela cadeia de transporte de elétrons, graças a sistemas designados lançadeiras. Nestes sistemas, os elétrons do NADH são transferidos para um composto citosólico capaz de atravessar a membrana interna da mitocôndria; alternativamente, os elétrons são passados para um composto que pode reduzir um componente da membrana interna. Por qualquer dos dois processos, o composto que transporta os elétrons é reoxidado ao doá-los, retorna ao citosol, e pode participar de um novo ciclo. Há duas lançadeiras importantes em células de vertebrados: a do malato-aspartato e a do glicerol fosfato.

1. Lançadeira do malato-aspartato. O NADH citosólico reduz oxaloacetato, em uma reação catalisada pela malato desidrogenase citosólica. O malato formado entra na mitocôndria, onde é oxidado pela malato desidrogenase mitocondrial, que também utiliza NAD+ como

coenzima (Figura 11.16). O processo leva à produção de NADH mitocondrial a partir de NADH citosólico, apesar de não haver permeabilidade da membrana interna ao NADH. O oxaloacetato formado na mitocôndria não atravessa a membrana interna, mas pode receber um grupo amino do glutamato, formando aspartato. O aspartato sai da

mitocôndria e, no citosol, regenera o oxaloacetato (Figura 11.17). Este é o sentido desta lançadeira em mitocôndrias respirando ativamente.

Figura 11.16 Esquema simplificado da lançadeira do malato-aspartato. O transporte de malato para a matriz mitocondrial (seta azul) e a regeneração de oxaloacetato no citosol (seta vermelha tracejada) estão representados na

Figura 11.17.

Figura 11.17 Lançadeira do malato-aspartato. As enzimas e translocases

(Seção 11.10) que participam da lançadeira são: (1) malato desidrogenase citosólica; (2) dicarboxilato translocase; (3) malato desidrogenase

mitocondrial; (4) aspartato aminotransferase (Seção 17.2.1) mitocondrial; (5) aspartato-glutamato translocase; (6) aspartato aminotransferase citosólica.

A passagem de malato e aspartato através da membrana interna da mitocôndria é efetuada por translocases presentes nesta membrana, que

serão descritas na Seção 11.10. A lançadeira do malato-aspartato ocorre em plantas e na maioria das células de vertebrados, incluindo as de fígado, coração, rins e cérebro.

2. Lançadeira do glicerol fosfato. O NADH citosólico reduz di-hidroxiacetona fosfato, em uma reação catalisada pela glicerol 3-fosfato desidrogenase. O glicerol 3-fosfato formado difunde-se até a face externa da membrana interna, onde se localiza uma isoenzima da glicerol 3-fosfato

desidrogenase que contém FAD como grupo prostético (Figura 11.18). A di-hidroxiacetona fosfato é regenerada, produzindo FADH2 que entrega os elétrons à coenzima Q.

Deve-se notar que, quando a lançadeira do glicerol fosfato é acionada, cada NADH origina apenas 2 ATP. O decréscimo na produção de ATP por NADH citosólico oxidado garante a irreversibilidade do transporte de seus elétrons para o interior da mitocôndria, mesmo que a concentração de NADH no citosol seja baixa. Este sistema opera em plantas, nos músculos de voo de insetos e em músculos esqueléticos e cérebro de vertebrados.

Figura 11.18 Lançadeira do glicerol-fosfato. A esfera representa a glicerol 3-fosfato desidrogenase situada na face externa da membrana interna, que contém FAD como grupo prostético.

11.10 Transporte de metabólitos através da membrana

interna da mitocôndria

A membrana interna da mitocôndria, ao contrário da membrana externa, é impermeável à maioria dos compostos. Apesar desta alta seletividade, o trânsito de muitos compostos entre a matriz mitocondrial e o citosol é propiciado pela existência de sistemas transportadores — translocases ou

permeases — presentes na membrana interna da mitocôndria (Figura

11.19). Quando não há um transportador específico, o composto é incapaz de atravessar a membrana. O transporte mediado por translocases encontra-

se descrito na Seção 7.4.1.

Os sistemas de transporte da membrana interna da mitocôndria mais bem conhecidos são:

1. Adenina nucleotídio translocase ou ATP/ADP translocase — efetua a troca de uma molécula de ATP da matriz mitocondrial por uma molécula de ADP, externa. Sua atuação permite que o ATP sintetizado dentro da mitocôndria possa ser exportado para o citosol, onde ocorre a maioria dos processos que consomem energia. Esta translocase é uma proteína muito abundante, que chega a representar 15% do conteúdo proteico da membrana interna da mitocôndria.

A ATP/ADP translocase pode ser inativada por inibidores específicos, com o consequente bloqueio da fosforilação oxidativa. Um deles, atractilosídio, é um glicosídio tóxico, isolado de uma espécie de erva daninha que cresce em pastagens, podendo ocasionar o envenenamento do gado. Outro inibidor conhecido é o ácido bongcréquico, antibiótico produzido por um fungo que cresce em uma comida típica à base de coco (bongkrek, em indonésio). O resultado da inibição da ATP/ADP translocase é o colapso da fosforilação oxidativa e da cadeia de transporte de elétrons. Uma vez fosforilado todo o ADP presente na matriz mitocondrial, a ATP sintase torna-se inativa, por falta de substrato (ADP); a cadeia de transporte de elétrons, que atua acoplada à fosforilação oxidativa, também não pode prosseguir.

2. Fosfato translocase — catalisa o cotransporte (simporte) de fosfato (Pi) e H+ para a matriz mitocondrial. O transporte de fosfato é inibido por reagentes específicos para grupos sulfidrila, como a N-etil-maleimida.

É o resultado das ações conjugadas das translocases 1 e 2 que provê a ATP sintase dos substratos (ADP e P i) de que necessita.

3. Dicarboxilato translocase — promove a troca de dicarboxilatos (malato, succinato, fumarato e α-cetoglutarato) por fosfato, ou troca de um dicarboxilato por outro.

4. Tricarboxilato translocase — efetua o antiporte de tricarboxilatos (citrato, isocitrato e fosfoenolpiruvato) por malato ou por tricarboxilatos; também é responsável pelo transporte do fosfoenolpiruvato mitocondrial para o citosol.

5. Piruvato translocase — permite a entrada, na mitocôndria, do piruvato produzido no citosol, acoplada à saída de OH–.

6. Aspartato-Glutamato translocase — medeia a saída de aspartato da matriz em troca de glutamato e H+do citosol.

7. Sistemas transportadores de íons Ca2+.

Apesar de saber-se, desde 1960, que as mitocôndrias são capazes de transportar íons cálcio, ainda não foram identificadas as proteínas envolvidas na movimentação do íon através da membrana interna. Existem vários sistemas transportadores, dos quais são conhecidas apenas as características funcionais, sendo os mais importantes: um mecanismo uniportador que possibilita a entrada de Ca2+ e dois antiportadores que promovem a liberação de Ca2+ no citosol, à custa da introdução na mitocôndria de Na+ ou H+ (sistemas Ca2+/nNa+ e Ca2+/2H+).

Figura 11.19 Translocases da membrana interna da mitocôndria, numeradas de 1 a 7 e descritas no texto.

As mitocôndrias, além do retículo endoplasmático, constituem um reservatório de cálcio e participam da regulação de sua concentração celular, colaborando para manter os níveis citosólicos de Ca2+ caracteristicamente baixos, próximos de 10–7 M. Esta regulação é fundamental, porque pequenas alterações na concentração de cálcio sinalizam o início de processos celulares de grande importância, que serão

analisados na Parte 4 — Regulação do Metabolismo.

Quando o acúmulo de cálcio na matriz mitocondrial ultrapassa os limites fisiológicos, a permeabilidade da membrana interna aumenta abruptamente, devido à abertura de um canal na membrana, chamado poro de transição de permeabilidade (PTP). Trata-se de um transportador não específico, permeável a quaisquer íons e moléculas menores que 1,5 kDa, cuja atuação ocasiona a morte celular por necrose ou apoptose (morte celular programada).

O papel de PTP na necrose celular é bem estabelecido na vigência de isquemia no coração, cérebro e fígado, quando as concentrações de cálcio aumentam muito, assim como as de espécies reativas de oxigênio. O PTP é estimulado e libera a passagem de prótons através da membrana interna, resultando a dissipação da força próton-motriz e a impossibilidade de sintetizar ATP.

Em determinadas condições, quando a abertura de PTP não chega a causar depleção de ATP e necrose, pode ocorrer apoptose. As proteínas, por não atravessarem PTP, ficam retidas na matriz mitocondrial e, como sua concentração é maior do que no citosol, a pressão osmótica interna aumenta, ocasionando o inchaço por absorção de água (swelling). A membrana interna da mitocôndria, graças às numerosas cristas, não é rompida, mas a externa, sim: o conteúdo do espaço intermembranas é liberado, incluindo o citocromo c que, uma vez no citosol, ativa uma cascata de proteases que determinam a morte celular.

A dicarboxilato translocase e a aspartato/glutamato translocase

participam da lançadeira do malato-aspartato (Figura 11.17). As atuações das demais translocases alistadas e ainda de outros sistemas transportadores estão incluídas na descrição das vias metabólicas.

O transporte de metabólitos e íons através da maioria das permeases da

membrana interna da mitocôndria é do tipo ativo (Seção 7.4.1). A energia necessária para seu funcionamento é derivada do gradiente eletroquímico gerado pelo bombeamento de prótons acoplado à cadeia de transporte de elétrons. Deste modo, as permeases contribuem para a dissipação da força próton-motriz, reduzindo o rendimento em ATP — uma parcela significativa da energia derivada do transporte de elétrons é utilizada para contornar a impermeabilidade da membrana interna.