2.8 Alterações estruturais das proteínas

Figura 2.16 Solubilidade da hemoglobina equina, em função da concentração de (NH ) SO , expressa em termos da força iônica da solução. 4 2 4

Solventes orgânicos solúveis em água, como acetona e etanol, diminuem a solubilidade das proteínas, devido ao baixo valor de suas constantes dielétricas e porque eles também sofrem hidratação. Em soluções aquosas desses compostos, moléculas contendo grupos com carga, como as proteínas, sofrem menor hidratação e interagem tão fortemente que precipitam. Procedimentos experimentais que utilizam a adição de solventes orgânicos para precipitar proteínas devem ser realizados a 0°C, porque, em temperaturas mais altas, eles provocam a desnaturação das proteínas.

2.8 Alterações estruturais das proteínas

A desnaturação da proteína consiste na perda de sua estrutura original

À medida que uma proteína é sintetizada, sua estrutura primária dobra-se espontaneamente, originando as estruturas secundária e terciária. Se a proteína em questão possuir estrutura quaternária, esta também se organiza espontaneamente, assim que a estrutura terciária das subunidades componentes é formada. A proteína assume a conformação denominada nativa. Esta é a conformação mais estável que a molécula pode assumir naquelas condições e reflete um equilíbrio delicado entre as interações ocorridas no interior da molécula proteica e entre esta e seu meio ambiente.

Ao proceder-se ao isolamento e purificação de uma proteína, a partir das células onde ela é encontrada, são introduzidas alterações físicas e químicas no seu meio ambiente, que podem afetar sua estrutura espacial a ponto de ocasionar a perda de sua função. A proteína é dita, então, desnaturada: sua conformação nativa é destruída devido ao rompimento de ligações não covalentes (as ligações peptídicas são mantidas) e o resultado é uma cadeia polipeptídica distendida.

A desnaturação pode ser provocada, experimentalmente, por tratamentos que ocasionam o rompimento de ligações não covalentes. O aquecimento a temperaturas altas, mas menores do que 100°C, provoca a desnaturação da maioria das proteínas. Há exceções, como as proteínas de bactérias termofílicas que habitam fontes termais, cujas temperaturas são próximas de 100°C. Uma destas proteínas, a DNA polimerase da bactéria Thermus aquaticus, a Taq polimerase, tem sido amplamente empregada na reação em cadeia da polimerase (PCR, de Polymerase Chain Reaction), um método laboratorial de amplificação de DNA. Graças à sua estabilidade térmica, a enzima mantém-se ativa a 95°C, temperatura em que as fitas de DNA separam-se, e podem, então, ser duplicadas pela ação da enzima. Um fato curioso é que a estrutura espacial dessas proteínas termoestáveis apresenta apenas diferenças sutis em relação à estrutura de proteínas com estabilidade térmica normal.

Outros agentes desnaturantes são os ácidos e os álcalis fortes: valores de pH muito baixos ou muito altos, afetando a ionização dos grupamentos da proteína, conferem à molécula uma elevada carga positiva, ou negativa, ocasionando repulsão intramolecular, com exposição do interior hidrofóbico. O tratamento com solventes orgânicos polares ou com compostos capazes de formar ligações de hidrogênio, como a ureia, determina a desnaturação da proteína; estes últimos compostos estabelecem ligações de hidrogênio com grupamentos da proteína, substituindo ligações que mantinham a estrutura nativa, e os solventes orgânicos por diminuírem a constante dielétrica do meio.

A desnaturação também pode ser ocasionada por detergentes e sabões, que são compostos anfipáticos, ou seja, apresentam uma cadeia apolar longa, ligada a um grupo terminal carregado. Estes agentes são desnaturantes porque sua cauda hidrofóbica se introduz no interior da molécula proteica e se associa com radicais apolares, rompendo interações hidrofóbicas que mantêm a estrutura nativa. Um detergente frequentemente

empregado é o dodecilsulfato de sódio (SDS) (Figura 2.17).

A desnaturação pode ser irreversível: algumas proteínas, quando desnaturadas, tornam-se insolúveis. É o caso da albumina do ovo, quando aquecida, e da caseína, quando o leite é acidificado, por exemplo, por crescimento bacteriano.

Figura 2.17 Fórmula estrutural do detergente dodecilsulfato de sódio (SDS), ilustrando sua natureza anfipática.

Proteínas desnaturadas podem renaturar

Retiradas as condições desnaturantes, algumas proteínas reassumem sua conformação nativa — este processo chama-se renaturação. A renaturação demonstra que a estrutura tridimensional de uma proteína é consequência de sua estrutura primária, ou seja, é determinada, unicamente, por sua sequência de aminoácidos.

Durante muito tempo, admitiu-se que o processo de enovelamento da cadeia polipeptídica recém-sintetizada nos ribossomos era autônomo, não requerendo nenhum fator adicional, nem fornecimento de energia. Esta visão passou a ser questionada diante da constatação de que a velocidade e a eficiência da renaturação in vitro são muito menores do que in vivo. Realmente, na década de 1990, demonstrou-se que as células dispõem de um aparato muito eficiente para assessorar a proteína durante a “montagem” de sua estrutura nativa. Este aparato é constituído por uma

família de proteínas denominadas chaperonas6. Elas ligam-se a proteínas nascentes e, por meio de etapas cíclicas, sustentadas por hidrólise de ATP, impedem ou revertem interações inadequadas de regiões potencialmente complementares. Também facilitam o transporte de proteínas através de membranas desde o citosol até o destino final, seja a secreção ou a inclusão em uma organela.

As proteínas assessoras possibilitam, ainda, a estabilização de proteínas em condições desfavoráveis, como altas temperaturas etc. As chaperonas foram identificadas na década de 1970 em Drosophila melanogaster como proteínas de choque térmico, Hsp (de Heat shock protein), induzidas quando as células eram submetidas a altas temperaturas.

As proteínas assessoras são amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas desde em bactérias até em mamíferos. Distúrbios no processo de enovelamento da cadeia proteica, e a consequente agregação de moléculas, estão envolvidos em diversas condições patológicas, como as

doenças de Alzheimer, de Parkinson, aquelas causadas por príons (Seção

2.4) etc.

A substituição de aminoácidos pode alterar a função das proteínas

Uma mutação que resulte na substituição de um aminoácido em uma posição crítica na molécula da proteína pode ter consequências danosas para o desempenho da sua função. O exemplo clássico é a substituição, nas cadeias β da hemoglobina, de um resíduo de glutamato, cuja cadeia lateral polar negativa localiza-se na superfície externa da molécula, por valina, com grupo R apolar. As moléculas da hemoglobina substituída, quando desoxigenadas, agregam-se devido a ligações hidrofóbicas envolvendo as cadeias laterais apolares de valina. Os agregados formam um precipitado fibroso que distorce as hemácias, que adquirem forma de foice — sickle, em inglês — e, por isso, a hemoglobina alterada é chamada de hemoglobina S, em contraposição à hemoglobina normal, a hemoglobina A. Estas células deformadas obstruem os capilares, impedindo a oxigenação adequada dos tecidos; também são mais frágeis que as normais e sofrem hemólise facilmente (têm meia-vida de 16 a 20 dias em lugar dos 120 dias das hemácias normais), ocasionando anemia grave. A doença é conhecida como anemia falciforme, e manifesta-se somente quando a mutação ocorre em homozigose: indivíduos heterozigotos são normais. Outras hemoglobinas mutantes estão analisadas no próximo capítulo.