5.4 Cinética da reação enzimática

A velocidade da reação enzimática, a 0oC, apresenta valores próximos de zero. A elevação da temperatura aumenta a velocidade somente enquanto a enzima conservar sua estrutura nativa. Acima de 50-55°C, a maioria das enzimas são desnaturadas, acarretando a perda do poder de catálise. Entre 0oC e 50°C vive a grande maioria dos seres vivos; há, entretanto, exceções, entre as quais a mais notável é representada por bactérias que vivem em águas termais, com temperaturas ao redor de 100°C.

As considerações referentes a amplas variações de pH são pertinentes ao estudo da atividade enzimática in vitro. Os seres vivos têm suas reações ocorrendo em ambiente tamponado, já que todas as células dispõem de mecanismos para manutenção do pH. Mesmo assim, microambientes celulares podem apresentar pequenas variações de pH que afetam a atividade das enzimas e que servem para o controle de sua ação. A temperatura tem influência decisiva sobre a distribuição geográfica dos seres vivos. Microrganismos, vegetais e animais ectotérmicos têm suas atividades vitais inteiramente dependentes da temperatura ambiente; aves e mamíferos, endotérmicos, são menos afetados.

 

5.4 Cinética da reação enzimática

Enzima e substrato formam um complexo transitório

O estudo das reações enzimáticas e de uma série de propriedades das enzimas baseia-se em medidas da velocidade da reação, que é diretamente

proporcional à concentração do reagente (Seção 5.1). À medida que a reação se processa, a concentração do reagente diminui e a velocidade da reação também, ou seja, a velocidade da reação varia ao longo do tempo. A velocidade da reação determinada após um intervalo de tempo é a velocidade média da reação durante esse tempo. Para determinar a velocidade de reação efetivamente proporcional à concentração inicial de reagente, é necessário medir a velocidade inicial (v0). Esta medida é conseguida utilizando-se um tempo de reação muito pequeno, durante o qual a conversão de reagente em produto tenha sido tão reduzida que a concentração de reagente possa ser considerada constante — é o chamado tempo inicial. Como o tempo inicial difere para cada reação considerada, podendo variar de frações de segundos até várias horas, convenciona-se ser o tempo em que menos de 10% do reagente (substrato) tenham sido transformados em produto.

Grande parte das reações catalisadas enzimaticamente obedece ao padrão

A + B ⇌ C + D

 

Para o tratamento da cinética enzimática, entretanto, será adotado um modelo mais simples, em que há apenas um substrato e um produto, representado por:

S ⇌ P

 

É o caso, por exemplo, de algumas reações de isomerização, em que um isômero é transformado em outro.

A velocidade de reação é medida em tempos iniciais, quando a concentração de P é desprezível (e, portanto a velocidade v = k [P] é praticamente igual a zero), sendo possível fazer a aproximação:

S → P

 

A reação catalisada enzimaticamente processa-se em duas etapas: na primeira, a enzima (E) liga-se reversivelmente ao substrato (S), formando um complexo enzima-substrato (ES):

Na segunda fase, são liberados o produto (P) e a enzima:

 

Uma vez na forma livre, a enzima pode, então, ligar-se a outra molécula de substrato (seta tracejada no esquema seguinte). A representação conjunta das etapas (1) e (2) é:

 

As equações de velocidade para as reações componentes do processo são:

 

v = k [E] [S] 1 1

 

v –1 = k –1 [ES]

 

v = k [ES] 2 2

 

O tratamento matemático dos dados experimentais, obtidos com preparações não purificadas de enzimas, foi feito no início do século XX por Leonor Michaelis e Maud L. Menten. Estes pesquisadores procuravam explicar, sobretudo, porque a função que relaciona a velocidade da reação com a concentração do reagente (substrato, S) era uma hipérbole equilátera e não uma reta, como previsto pela equação v = k [reagente].

Michaelis e Menten partiram de dois pressupostos: (1) a concentração de substrato é muito maior do que a concentração de enzima e (2) k1 > k –1 > k . São duas as decorrências desta diferença de grandeza entre as constantes 2

de velocidade k –1 e k2:

1. a primeira reação estabelece um equilíbrio, o que não seria possível

se k2 fosse maior do que k –1

2. a velocidade da reação global, ou seja, a velocidade da formação

do produto, v2, é determinada pelo valor de k2, já que esta é a etapa mais lenta e limitante do processo.

Estes pressupostos revelaram-se verdadeiros para um grande número de enzimas, chamadas enzimas michaelianas, e serão admitidos para as considerações feitas a seguir. Para muitas enzimas, entretanto, as premissas consideradas por aqueles autores não são verdadeiras e a cinética de suas reações é diferente da que será tratada aqui.

Nas reações enzimáticas, a concentração de enzima é, via de regra, muito menor que a de substrato. Realmente, em virtude da diferença de

massa molar entre eles (Tabela 5.3), soluções equimolares de enzima e substrato não são usadas na prática e, muitas vezes, nem sequer poderiam ser obtidas. Um exemplo ilustrativo é a reação de síntese de glutamina a partir de glutamato e NH +, catalisada pela glutamina sintetase: 4

 

Glutamato + NH = 4 + ATP → Glutamina + ADP + HPO 2-4 + H+

 

Uma solução 10 mM de glutamato (mol = 150) contém 1,5 g/L; para conter o mesmo número de moléculas, uma solução de glutamina sintetase (mol = 600.000) deveria ser também 10 mM, ou seja, conter 6 kg de enzima por litro! Na prática, portanto, as soluções de enzimas são muito mais diluídas do que as de seus substratos e, nas reações enzimáticas, o número de moléculas de enzima é muito inferior ao número de moléculas do substrato. Esta situação é semelhante à celular, onde a concentração de substrato chega a ser 106 vezes superior à da enzima.

Apesar dessa disparidade numérica, quando se adiciona enzima a uma solução de substrato, nem todas as moléculas de enzima combinam-se com o substrato. Como k é muito menor do que k , a conversão ES → E + P é 2 –1 comparativamente muito lenta e estabelece-se um equilíbrio entre E, S e ES. Este equilíbrio é atingido em frações de segundo depois de serem postos em contato enzima e substrato, e tem concentrações definidas e constantes de cada espécie, havendo sempre uma porcentagem de enzima

livre (E). Na Figura 5.5, esta fase ocorre até o tempo t 1. Como a enzima é um composto químico, a reação E + S ⇌ ES em nada difere de uma reação genérica A + B ⇌ C, em cujo equilíbrio existem, concomitantemente, as espécies A, B e C. As concentrações de cada espécie dependerão do valor da constante de equilíbrio da reação e, portanto, dos valores das constantes de velocidade k 1 e k –1:

 

Tendo havido formação de ES, inicia-se a segunda parte da reação enzimática, aquela que efetivamente gera o produto, com velocidade diretamente proporcional à concentração de ES:

 

Durante o tempo em que é medida a velocidade inicial (o tempo inicial), mantém-se a seguinte situação: contínua formação do produto e concentrações estáveis de ES, E e S. O fato de ES estar sendo consumido na formação do produto não provoca diminuição significativa da sua concentração, pois há sempre substrato excedente para combinar-se com a enzima que é liberada quando se forma o produto; a pequena e contínua diminuição da concentração de S não é significativa, face ao seu grande

excesso. Na Figura 5.5, este período corresponde ao intervalo t –t . 1 2 Naturalmente, em tempos maiores do que os tempos iniciais (tempos

maiores do que t 2, na Figura 5.5) a diminuição da concentração de substrato passa a ser significativa: a reação prosseguirá com velocidades cada vez

menores (ao longo do intervalo de tempo Δt, na Figura 5.5), até que todo o

substrato seja transformado em produto (tempo t , na Figura 5.5). 3

As considerações que serão feitas daqui para diante referem-se a velocidades iniciais (v 0), medidas em tempos iniciais.

A influência da concentração do substrato na velocidade da reação pode ser esclarecida pela análise de três situações de concentrações diferentes de

substrato (situações I, II e III da Figura 5.6), com uma mesma concentração de enzima. É importante ressaltar que as velocidades consideradas são velocidades iniciais, v (incluindo a V ), medidas após um mesmo tempo 0 máx inicial — a influência do tempo na velocidade da reação não está sendo

analisada na Figura 5.6.

 

Figura 5.5 Variação das concentrações dos componentes da reação enzimática em função do tempo. O intervalo 0 - t é muito pequeno. Após o 1 tempo t 1 estabelece-se o equilíbrio entre E, S e ES, cujas concentrações permanecem aproximadamente constantes até o tempo t . A concentração 2 do produto cresce sempre; a concentração do substrato, a rigor, diminui, mas pode ser considerada constante face à sua enorme concentração em comparação à da enzima, do complexo ES e do produto. Entre t1 e t 2 está o tempo inicial, durante o qual a velocidade inicial (v ) deve ser medida. 0 Durante o intervalo de tempo Δt, a concentração do substrato diminui efetivamente e a reação chega ao final (tempo t3).

 

A situação I da Figura 5.6 supõe uma pequena concentração de substrato (pequena, porém muito maior do que a concentração de enzima) e que o equilíbrio da primeira etapa da reação seja tal que apenas 25% das moléculas de enzimas presentes estejam ligadas ao substrato, formando o complexo ES; os 75% restantes estarão livres, na forma E. Na situação II, há uma maior concentração de substrato e o equilíbrio é obtido com 50% das moléculas de enzimas na forma de complexo ES e os outros 50% como enzimas livres (E). Na situação III, o aumento da concentração de substrato foi tal que levou 75% das moléculas de enzimas a estar complexadas com o substrato.

Em resumo, nas situações I, II e III da Figura 5.6, as concentrações de E (enzima livre) e de complexo ES, expressas como porcentagem da concentração total de enzima ([E] + [ES]), são:

Figura 5.6 Esquema ilustrativo do equilíbrio E + S ⇌ ES, em três situações (I, II, III) de concentrações diferentes de substrato e mesma concentração de enzima, analisadas após um mesmo tempo inicial. As velocidades de reação (v ) são indicadas em porcentagens da V . Na 0 máx

prática, a proporção [S]/[E] é muito maior do que a representada no esquema.

 

Se a quantidade de substrato for muito maior do que a prevista na situação III, a concentração de E será praticamente nula, encontrando-se toda a enzima disponível sob a forma de ES. Trata-se da maior concentração possível de ES, praticamente igual à concentração de enzima utilizada:

A concentração de ES é refletida na velocidade de formação do produto, já que

 

v2 = k2 [ES]

 

e a reação ocorre na maior velocidade possível. Essa concentração de substrato é dita saturante e, a partir dela, novos aumentos da concentração de substrato não terão efeito perceptível sobre a velocidade da reação, que atingiu o seu valor máximo, a velocidade máxima (V ) da reação. Com as máx

concentrações de substrato das situações I e II serão obtidas velocidades respectivamente iguais a 25 e 50% da Vmáx. A velocidade da reação é

sempre proporcional à concentração de ES, como exemplificado na Figura

5.6.

Os dados experimentais para construir um gráfico que relaciona

velocidade inicial e concentração de substrato (Figura 5.7) podem ser conseguidos pelo procedimento seguinte. Prepara-se uma série de tubos contendo a mesma concentração de enzima e concentrações crescentes de substrato. Espera-se o tempo adequado para que se forme uma quantidade mensurável de produto; este tempo, entretanto, deve ser suficientemente pequeno para que menos de 10% do substrato tenham sido transformados em produto, para garantir que serão medidas velocidades iniciais. Dosa-se o produto e calcula-se a velocidade (quantidade de produto formado dividido

pelo tempo). Na curva obtida (Figura 5.7), podem-se identificar duas regiões:

1. a região que contém os pontos A e B, em que a velocidade

aumenta com o aumento da concentração de S, indicando que durante a reação havia moléculas de enzima livres — nesta parte, a concentração de S é o fator limitante da velocidade da reação;

2. a região do ponto C, em que a velocidade permanece

essencialmente constante, apesar do aumento da concentração de S, e se aproxima de V máx, indicando que a maioria das moléculas de enzima estiveram ligadas ao substrato durante o tempo em que a

velocidade da reação foi medida (sobre a dificuldade de determinar

o valor de Vmáx a partir do gráfico da Figura 5.7, ver Seção 5.5).

Entre todas as concentrações de substrato, existe uma que provoca a formação de uma concentração de ES igual à metade da máxima possível — o equilíbrio da primeira etapa é estabelecido com 50% das enzimas sob a

forma livre e 50% das enzimas na forma ES (situação II da Figura 5.6):

 

Nestas condições, a velocidade é igual à metade da V máx. Esta específica concentração de substrato corresponde à constante de Michaelis-Menten,

K M(Seção 5.6), e apresenta interesse particular, pois seu valor indica a afinidade que uma enzima apresenta pelo substrato. Esta correlação pode ser exemplificada com a hexoquinase, que aceita como substratos açúcares de seis carbonos (hexoses), como a glicose e a frutose. Para saber por qual das duas hexoses a hexoquinase apresenta maior afinidade, são feitos dois

experimentos, do tipo mostrado na Figura 5.8, um utilizando glicose como substrato e o outro, frutose. Em cada experiência, obtêm-se a velocidade máxima aproximada da reação e a metade dessa velocidade. No caso em que o substrato é a glicose, a metade da V máx é obtida com concentração do açúcar igual a 0,15 mM. Dito de outra forma, é necessária uma concentração 0,15 mM de glicose para que metade da enzima disponível encontre-se ligada à glicose, fazendo o complexo Enzima-Glicose. Para conseguir situação análoga com frutose, é necessária uma concentração de frutose 10 vezes maior, isto é, 1,5 mM. A hexoquinase tem, portanto, uma afinidade muito maior pela glicose do que pela frutose.

Figura 5.7 Variação da velocidade da reação enzimática (v ) em função da 0 concentração do substrato (S).

 

Figura 5.8 Variação da velocidade da reação enzimática (v0) em função da concentração do substrato (S) para duas concentrações de enzima (E, 3E).

 

A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima

Em todas as considerações feitas sobre a variação da velocidade de reação em relação à concentração de substrato, admitiu-se sempre uma concentração fixa de enzima. Variando a concentração de enzima, a velocidade sempre irá variar qualquer que seja a concentração do substrato, pois se, para uma concentração E de enzima obtém-se:

 

Para uma concentração de enzima igual a 2E, deve-se ter:

 

O substrato está sempre em tal excesso que a quantidade que se liga à enzima é desprezível, de modo que:

 

Entretanto, a concentração de ES em um caso é o dobro da outra e, como

 

v2 = k2 [ES]

 

a velocidade em um caso também será o dobro da outra (Figura 5.8).

Generalizando, a velocidade da reação é diretamente proporcional à

concentração da enzima (Figura 5.9). Esta proporcionalidade facilita a determinação da concentração (atividade) de uma enzima.

 

Figura 5.9 Velocidade da reação enzimática (v ) em função da 0 concentração da enzima (E).

A dosagem de uma enzima é obtida pela medida de sua atividade

As concentrações das soluções são habitualmente expressas em unidades de massa do soluto por unidades de volume da solução. As soluções de enzimas constituem um caso especial, por duas razões. A primeira é que muitas vezes há necessidade de aferir a quantidade de uma enzima na presença de outras proteínas — é o caso de dosagem de enzimas no plasma sanguíneo e em outros fluidos corpóreos ou extratos celulares. A segunda razão é que o importante não é a massa total da enzima, mas a quantidade de enzimas ativas. Ou seja, interessa aferir a atividade enzimática e não a concentração. Em uma solução de enzima desnaturada, sua massa é conservada, mas a propriedade catalítica está perdida.

Em virtude do exposto, a dosagem de uma enzima é feita pela medida de sua atividade, que é avaliada pela velocidade da reação que ela catalisa. Dada a especificidade das enzimas, esta medida é possível, mesmo na presença de outras proteínas. Uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com concentração alta de substrato, para garantir a velocidade máxima e impedir que pequenas variações na concentração do substrato possam afetar as medidas. A velocidade da reação é determinada e a atividade enzimática é expressa em Unidades Internacionais. Uma Unidade Internacional (U) é a quantidade de enzima capaz de formar 1 µmol de produto por minuto em condições de medida especificadas para cada caso (pH, temperatura etc.). As dosagens de enzimas são geralmente expressas

em U/mL ou U/L (Tabela 5.6).

A concentração de enzimas intracelulares no plasma é centenas de vezes menor do que no interior das células. Quando as células são lesadas, suas concentrações plasmáticas tornam-se anormalmente elevadas, revelando a instalação da moléstia. Ainda mais, a enzima cuja concentração plasmática aumenta pode indicar o tecido ou órgão que sofreu a injúria. Por isto, a dosagem de enzimas no plasma é prática corrente para a elucidação e o

acompanhamento de muitas doenças (Tabelas 5.6 e 5.7) — os valores obtidos no indivíduo afetado são comparados com os valores médios encontrados em indivíduos sadios.

A medida da atividade enzimática é também imprescindível para monitorar a purificação de uma enzima. O processo de isolamento de uma enzima é iniciado a partir de um macerado de órgão ou tecido, o extrato celular. Tomando uma amostra deste extrato, deve-se determinar a atividade da enzima em questão (em U/mL, geralmente) e a quantidade total de Unidades presentes no volume do extrato. Para adotar um parâmetro que permita a comparação com outras preparações e com etapas posteriores do processo de purificação, é necessário usar um referencial; a referência habitualmente utilizada é a concentração total de proteína presente na preparação. Define-se, assim, a atividade específica, que é o número de Unidades de enzima por miligrama de proteína presente na preparação. A cada etapa processada em direção à purificação da enzima, são feitas novas medidas de atividade e de concentração de proteína, e calculada a nova atividade específica. Se a etapa de purificação foi bem-

sucedida, a atividade específica medida deve aumentar (Tabela 5.8). Este aumento significa, naturalmente, que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis. Novos procedimentos de purificação são efetuados até que, no caso ideal, a atividade específica da preparação torna-se máxima e constante, indicando que a enzima está pura.

 

Tabela 5.6 Resultados de exames laboratoriais de dosagens de enzimas

plasmáticas em dois indivíduos (A e B).

Atividade enzimática no soro (U/L)

Enzimas Indivíduo A Indivíduo B Valores de referência

Aldolase 2 2,1 Até 3

Amilase 120 125 60-160

Colinesterase 2.700 3.200 1.900-3.800

Creatina quinase 62 50 10-80

Lactato desidrogenase 398 220 120-240

Fosfatase ácida prostática 2,8 7,7 Até 3,7

Fosfatase alcalina 295 80 50-250

Aspartato transaminase 560 12 Até 18

Alanina transaminase 1.095 18 Até 21

γ-Glutamil transferase 61 11 6-28

Os resultados dos exames do indivíduo A são compatíveis com um quadro de hepatite viral aguda e os dos exames do indivíduo B, com carcinoma de próstata.

 

Tabela 5.7 Enzimas cujas concentrações plasmáticas são alteradas em

determinadas doenças.

Enzimas Moléstias

Transaminases, γ-glutamil transferase Hepatite, enfarte do miocárdio

Creatina quinase, lactato desidrogenase Enfarte do miocárdio

Amilase, lipase Pancreatite

Fosfatase alcalina, γ-glutamil transferase Hepatite, cirrose, câncer, processos obstrutivos de vias biliares

Fosfatase ácida Neoplasia de próstata

Amilase Parotidite (caxumba)

 

Tabela 5.8 Puri cação hipotética de uma enzima.

Proteína

Etapas da Índice de Proteína total

puri cação (1) (2) (3) Volume (mL) (mg/mL) (mg) U /mL U totais U/mg puri cação

1. Extrato celular 10 80 800 2.000 20.000 25 1

2. Fracionamento por

(NH4)2 SO4 2 120 240 9.000 18.000 75 3

3. Filtração em gel 10 2,2 22 1.620 16.200 750 30

4. Cromatogra a de

troca iônica 5 2,8 14 2.268 11.340 800 32

5. Cromatogra a de

a nidade 2 1,1 2,2 5.500 11.000 5.000 200

(1) (2) U: unidade internacional de atividade enzimática. Atividade específica: número de unidades de enzima por miligrama de proteína. Pelos dados apresentados na tabela, observa-se que a etapa 4 não é um método conveniente para a purificação da enzima em questão; esta etapa deveria ser suprimida