2.10 Métodos de purificação de proteínas

Atualmente, proteínas podem ser obtidas por um caminho totalmente diferente, graças ao desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante. O gene que codifica a proteína desejada pode ser isolado das células de origem e expresso em organismos com crescimento rápido, como bactérias e leveduras. Graças às técnicas empregadas, a proteína heteróloga, que na célula original ocorre em concentrações da ordem de 0,002%, passa a representar de 30 a 40% do conteúdo proteico das células recombinantes. Obviamente, esta alta concentração facilita muito o isolamento da proteína.

2.10 Métodos de puri cação de proteínas

2.10.1 Cromatogra a em coluna

Na cromatografia em coluna, uma amostra da mistura de proteínas é aplicada no topo de uma coluna formada por uma matriz hidratada, que pode ser constituída de diversos tipos de materiais, denominados conjuntamente resinas. A coluna, então, é eluída com uma solução apropriada para a separação da proteína de interesse. As diferentes proteínas migrarão através da coluna com velocidades diferentes que dependerão do seu grau de interação com a matriz, o que permite a separação. Os vários tipos de cromatografia em coluna disponíveis diferem quanto à matriz utilizada e são classificados de acordo com a propriedade das proteínas que é discriminada pela matriz: tamanho (cromatografia de exclusão), carga iônica (cromatografia de troca iônica) e especificidade de ligação (cromatografia de afinidade).

Cromatogra a de exclusão ( ltração em gel)

A cromatografia de exclusão, também chamada de cromatografia por filtração em gel, separa moléculas que diferem quanto ao tamanho, como acontece com as proteínas, cuja massa molar varia de alguns milhares (5.733 para insulina) a milhões (2.800.000 para hemocianina, uma proteína transportadora de oxigênio de certos invertebrados). A matriz, nesta técnica, é um gel constituído por esferas com poros de tamanho definido. As moléculas menores do que o diâmetro dos poros podem penetrar nas esferas, ao passo que as maiores, não — são “excluídas”. Deste modo, as moléculas menores percorrem, ao longo de uma coluna com esse material, um trajeto muito maior do que as moléculas maiores, que sairão da coluna

em primeiro lugar (Figura 2.18). Um material comumente empregado para a fabricação de géis cromatográficos é dextrana, um polímero de glicose, comercialmente disponível com o nome de Sephadex®; este produto é sintetizado com poros de diversos tamanhos, permitindo a exclusão de moléculas com um largo intervalo de massa molar.

Figura 2.18 Filtração em gel. Uma mistura formada por duas proteínas (A e B), com massas molares diferentes, é aplicada sobre uma coluna de gel formado por esferas porosas (a). As moléculas da proteína menor (proteína B) podem penetrar nos poros das esferas (b), percorrendo a coluna mais lentamente (c); a proteína maior (proteína A) é, então, eluída primeiramente (d) e a proteína menor, depois (e).

A filtração em gel também pode ser empregada para diminuir a concentração de sais de uma solução de proteína após sua precipitação por adição de altas concentrações de sulfato de amônio. Para tanto, deve-se fazer a filtração em um gel que exclua a proteína, que será eluída primeiramente. Outro processo rotineiramente utilizado para separar proteínas de substâncias de pequena massa molar é a diálise. A diálise não é uma técnica cromatográfica, mas é um tipo de filtração molecular. A mistura de proteína e moléculas pequenas é colocada dentro de um saco de material semipermeável, como o celofane (acetato de celulose). Quando o saco de diálise é imerso em tampão, as moléculas proteicas ficam retidas, enquanto as moléculas pequenas ou íons atravessam a membrana de diálise

(Figura 2.19).

Figura 2.19 Diálise. O saco de diálise contendo a mistura de proteína (azul) e moléculas pequenas (vermelhas) é imerso em um volume grande de solução tampão (a). Como a membrana semipermeável permite a passagem apenas das moléculas pequenas, sua concentração dentro e fora do saco tende a se igualar (b). Após várias trocas de tampão (c), restam apenas as moléculas de proteína dentro do saco de diálise (d).

Cromatogra a de troca iônica

As resinas de troca iônica comumente utilizadas para purificar proteínas são formadas por celulose ligada covalentemente a grupos com

carga positiva ou negativa (Tabela 2.6). Moléculas com carga de mesmo sinal que a resina são eluídas primeiramente, seguidas por moléculas com carga oposta, em uma ordem definida pela magnitude da carga apresentada pela proteína nas condições da cromatografia. Geralmente, escolhem-se valores de pH e de concentração salina que determinem a ligação da proteína de interesse à resina escolhida; seguem-se alterações dessas condições que levem à eluição da proteína.

Tabela 2.6 Algumas resinas utilizadas para cromatogra a de troca iônica de proteínas.

Resina Grupo ionizável

Fosfocelulose 2 – – PO

3

Carboximetilcelulose – – CH 2 – COO

Dietilaminoetilcelulose + – CH – CH – NH(CH CH ) 2 2 2 32

Cromatogra a de a nidade

Muitas proteínas ligam-se específica e não covalentemente a determinadas moléculas: enzimas, hormônios e anticorpos ligam-se, respectivamente, a substratos, receptores ou antígenos. Tais proteínas podem ser purificadas por cromatografia de afinidade. O princípio do método consiste em unir a molécula pela qual a proteína tem afinidade (ligante) a uma matriz insolúvel, sendo a mais utilizada a agarose, um polímero de açúcares encontrado em algas vermelhas. A mistura de proteínas é passada por uma coluna preparada com esse material: a proteína de interesse fica adsorvida à coluna, graças à interação com o ligante, e as outras proteínas passam livremente. A proteína adsorvida pode ser eluída da

coluna por adição de solução concentrada do ligante (Figura 2.20). Se a proteína for uma enzima, o ligante pode ser o substrato, o produto ou o inibidor competitivo. No caso de purificação de anticorpos, o ligante utilizado é o antígeno. O receptor de insulina, uma proteína da superfície celular, foi isolado por cromatografia de afinidade em agarose contendo insulina covalentemente ligada. A cromatografia de afinidade tem, obviamente, um poder de resolução muito maior do que os outros métodos

cromatográficos (Tabela 5.6), embora seja restrita a uma classe especial de proteínas.