5.5 A equação de Michaelis-Menten

em tentativas subsequentes. (3)Índice de purificação: razão entre a atividade específica da etapa considerada e a atividade específica do extrato celular.

 

5.5 A equação de Michaelis-Menten

A descrição matemática dos fenômenos cinéticos da catálise enzimática é dada pela equação de Michaelis-Menten. Para deduzi-la, será considerada a reação reversível:

 

Considerando os tempos iniciais de reação, a velocidade de formação de ES a partir de E + P

 

v–2 = k –2 [E] [P]

 

pode ser desprezada, pois, como a concentração inicial de P é insignificante em relação a S, o produto não conseguirá ligar-se à enzima, já que a probabilidade de ligação do substrato é muito maior. A própria equação desta velocidade mostra que, quando a concentração de P é próxima de zero, a velocidade v também tende a zero. –2

A velocidade de formação de ES é apenas:

 

v 1 = k1 [E] [S]

 

[E] é a concentração de enzima livre, isto é, a diferença entre a concentração adicionada de enzima (ou seja, sua concentração total = E ) e a t concentração de ES (ou seja, a quantidade de enzima ligada ao substrato). Substituindo este valor de [E] na equação de v 1:

 

v 1 = k1 ([E t] – [ES]) [S]

 

A velocidade de desaparecimento de ES será a soma de duas velocidades: aquela que dissocia ES em E + S (v ) e aquela que transforma –1

ES em E + P (v2):

 

v = k [ES] –1 –1

 

v2 = k 2[ES]

 

Assim, a velocidade de desaparecimento de ES será:

 

v + v = k [ES] + k [ES] –1 2 –1 2

 

v–1 + v2 = (k –1 + k2) [ES]

 

Durante os tempos iniciais de reação, a concentração de ES mantém-se constante, com o estabelecimento de um equilíbrio estacionário (steady-state). As velocidades de formação (v ) e de desaparecimento (v + v ) de 1 –1 2 ES são, então, iguais.

 

A velocidade inicial da reação total é a velocidade do aparecimento do produto:

v 0 = k2 [ES]

 

Substituindo, nesta equação, o valor de [ES] da equação (A):

 

Como a velocidade máxima (Vmáx) é obtida quando toda a enzima (Et) se encontra sob a forma de ES, o produto k 2 [Et] é a velocidade máxima e

 

A relação (k + k )/k foi definida por Michaelis e Menten como uma –1 2 1

nova constante, KM. Chega-se assim à expressão final da equação de Michaelis-Menten:

 

Quando a concentração de substrato é tal que a velocidade de reação é

metade da velocidade máxima (ponto B da Figura 5.7), resulta:

A última igualdade indica que a constante de Michaelis-Menten é numericamente igual à concentração de substrato que determina a metade da velocidade máxima, o que permite a determinação experimental desta

constante (Figura 5.7). O valor do KM indica o grau de afinidade da enzima

pelo substrato, como exemplificado pela hexoquinase (Tabela 5.9).

 

Tabela 5.9 Constante de Michaelis-Menten de enzimas.

Enzima Substrato K (mM) M

Glicerol desidrogenase Glicerol 39

Anidrase carbônica CO 7,5 2

Álcool desidrogenase Etanol 0,5

Isocitrato desidrogenase Isocitrato 0,45

Hexoquinase Glicose 0,15

Hexoquinase Frutose 1,5

 

A velocidade da reação só é diretamente proporcional a baixas concentrações

de substrato

Quando a concentração do substrato é muito inferior ao KM, KM + [S] é praticamente igual a K , e a equação de Michaelis-Menten se reduz a: M

 

Como é uma constante, é possível escrever

 

v 0 = K [S]

 

uma equação de reta do tipo y = ax. Esta equação mostra que, com concentrações pequenas de substrato, a velocidade de reação é diretamente proporcional à concentração do substrato (região do ponto A no gráfico da

Figura 5.7).

Por outro lado, quando a concentração de S é muito maior do que K M

(região do ponto C da Figura 5.7), KM + [S] é praticamente igual a [S] e a equação de Michaelis-Menten fica igual a

 

v0 = Vmáx

 

indicando que, quando a concentração de substrato é muito alta (saturante), a velocidade é constante e máxima, independendo da concentração de substrato. Na prática, é muito difícil atingir a V ; ainda assim, há recursos máx

matemáticos que permitem determinar seu valor.

 

Um grá co com os valores inversos de v e [S] possibilita a determinação de 0

V máx e KM

A equação de Michaelis-Menten é a equação de uma hipérbole retangular; portanto, os valores exatos de V máx nunca são atingidos, pois a curva tem assíntota no valor V do eixo v . Mesmo aproximações de V máx 0máx seriam obtidas com concentrações tão altas de substrato, que são difíceis de conseguir experimentalmente. Como consequência, a determinação de K M também é impossibilitada.

O problema da determinação de V e K pode ser resolvido a partir da máx M transformação algébrica da equação de Michaelis-Menten. Esta transformação, formulada por Lineweaver e Burk, é obtida tomando o inverso daquela equação:

 

ou

 

que é uma equação de reta do tipo y = ax + b.

Um gráfico com os valores de contra valores de é uma reta cujo

intersepto nas ordenadas é e, nas abscissas, (Figura 5.10).

 

Figura 5.10 Transformação de Lineweaver-Burk para os resultados de um experimento onde foram preparados tubos contendo diversas concentrações de substrato e a mesma concentração de enzima; após a incubação, mediu-se v0. Os inversos dos valores das concentrações de substrato utilizadas e os inversos dos valores de v compõem uma reta (linha contínua), que, 0

extrapolada (linha pontilhada), permite a determinação dos valores de KM e de V . máx

 

Este gráfico permite aferir Vmáx sem que seja atingido, na prática, o ponto que equivaleria a esta velocidade, já que a reta pode ser traçada a partir de pontos experimentais conseguidos com concentrações não saturantes de substrato. Prolongando-se a reta, encontra-se o valor do inverso de V no intercepto com o eixo das ordenadas e o valor negativo máx

do inverso de K M, na intersecção com o eixo das abscissas.

 

Algumas enzimas estão próximas da perfeição catalítica

Para estudar a eficiência da catálise enzimática, define-se a constante catalítica, kcat:

A constante catalítica mede, para uma dada concentração de enzima, a eficiência máxima, obtida em condições de Vmáx, quando todas as enzimas estão complexadas com o substrato. Como V é igual ao produto k [Et], máx 2 k cat é igual a k2:

 

k é também conhecida como número de renovação (turnover number) cat

da enzima, porque equivale ao número máximo de moléculas de substrato que um centro ativo converte em produto, por segundo. O valor de k cat indica a rapidez com que uma enzima pode operar, quando todos os centros ativos estão ocupados, ou seja, evidencia com que eficiência o complexo

enzima substrato origina produto (Tabela 5.10). A eficiência é espantosa: pelo valor de k para a catalase, verifica-se que uma molécula desta enzima cat

é capaz de originar 10.000.000 de moléculas de produto por segundo!

Se ao valor de kcat for associado o valor de KM, pode-se definir uma nova constante k /K , que relaciona a eficiência catalítica da enzima com a cat M

sua afinidade pelo substrato. Um baixo valor de kcat/KM ocorrerá ou porque a enzima tem pouca afinidade pelo substrato (K grande), ou porque a M eficiência de gerar produto a partir de ES é pequena (k cat pequeno), ou pelas duas razões somadas. Por outro lado, os maiores valores desta relação serão obtidos satisfazendo simultaneamente duas condições: alta afinidade da enzima pelo substrato (K pequeno) e alta eficiência na transformação de M

ES em produto (kcat grande). Na Tabela 5.10 aparecem os valores da razão k cat/KM para várias enzimas. Esta razão para as enzimas mais eficientes aproxima-se muito dos valores do coeficiente de difusão, ou seja, da frequência de colisão entre enzima e substrato por difusão simples (108-109 M–1• s–1). Isto significa que estas enzimas catalisam a reação com uma eficiência próxima da perfeição: geram produto cada vez que colidem com o substrato. São enzimas que catalisam reações de grande importância para a fisiologia celular, seja na transmissão do impulso nervoso (acetilcolinesterase), na remoção de CO2 dos tecidos (anidrase carbônica) ou na eliminação de radicais livres de oxigênio (catalase e superóxido dismutase); comparativamente, a pepsina, uma enzima digestiva, é muito poucoeficiente.