11.3.2 ATP sintase

Figura 11.12 Diagrama mostrando valores de potencial de redução padrão (Eº′) e de energia livre padrão (Gº′) referentes ao transporte dos elétrons do NADH ao oxigênio. A variação de energia livre padrão (ΔGº′) de cada etapa pode ser estimada a partir da ordenada à direita (Gº′). Nas etapas de que participam os Complexos I, III e IV, o decréscimo de energia livre (setas largas) é suficiente para gerar um gradiente de prótons capaz de promover a síntese de ATP.

Como a questão ainda não está totalmente esclarecida e como os valores de produção de ATP servem principalmente para comparações, neste texto serão adotados sempre os valores inteiros de P/O: 3 para o NADH e 2 para succinato.

11.3.2 ATP sintase

A ATP sintase é formada por dois componentes, F1 e FO

Em micrografias eletrônicas, pode-se observar que a face interna da membrana interna da mitocôndria é recoberta por microesferas, conectadas à membrana por pequenas hastes. O tratamento de preparações de mitocôndrias com ultrassom produz fragmentos de membrana que formam, espontaneamente, vesículas invertidas, nas quais a face com as microesferas

situa-se do lado de fora (Figura 11.13). Estas vesículas são capazes de efetuar o transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa. Se as microesferas forem removidas das vesículas, estas conservam apenas a capacidade de transportar elétrons. Por outro lado, as microesferas isoladas contêm a atividade catalítica de síntese que, nestas condições, sem o gradiente de prótons, é demonstrada pela capacidade de promover a reação no sentido da hidrólise de ATP. Estas experiências demonstram a localização da ATP sintase (na realidade, de parte da enzima) nas microesferas.

Nos organismos analisados, a ATP sintase compreende dois componentes, cada um constituído por várias subunidades proteicas. Uma porção periférica, chamada fator de acoplamento 1 (F1), corresponde às microesferas e suas hastes, visíveis ao microscópio eletrônico. A segunda porção fica embebida na membrana — plasmática de bactérias, tilacoide de

cloroplastos (Seção 15.2) e interna de mitocôndrias — e é denominada F O, com a letra o subscrita, porque inclui, em mitocôndrias, uma subunidade que se liga a oligomicina, um inibidor da ATP sintase. As ATP sintases têm, basicamente, a mesma estrutura, sendo que as enzimas de eucariotos apresentam subunidades adicionais às de procariotos. Recentemente, à semelhança do que foi verificado com os complexos transportadores de elétrons, demonstrou-se a existência de dímeros e outras formas oligoméricas da ATP sintase mitocondrial, cujo significado fisiológico é desconhecido.

A Figura 11.14 mostra um esquema da estrutura da ATP sintase de Escherichia coli. F1, que se projeta para o citoplasma da célula bacteriana, é formado pelas subunidades α β γ δ ε; as seis subunidades maiores (três α e 3 3

três β) dispõem-se, alternadamente, em um círculo ao redor da subunidade γ, que, por sua vez, está associada à subunidade ε;o hexâmero α 3-β3 estabelece contato também com a subunidade δ. F , inserido na membrana O plasmática, consta das subunidades a b2 c10. As dez subunidades c compõem uma estrutura em anel e interagem com a subunidade a, que se liga ao dímero b . F e F são unidos por um eixo central, constituído pelas 2 1 O

subunidades γ e ε, e por um eixo lateral, com as subunidades δ e b2.

F1 catalisa a síntese de ATP por meio de três sítios ativos, um em cada subunidade β, junto a uma interface α/β; FO contém os canais de passagem (de entrada e de saída) de prótons.

Figura 11.13 Microesferas da membrana interna da mitocôndria e ATP sintase. (a) A membrana interna é recoberta por microesferas com pequenas hastes, voltadas para a matriz mitocondrial — o esquema mostra uma das numerosas invaginações desta membrana, chamadas cristas. (b) Formação de vesículas invertidas por tratamento de mitocôndrias com ultrassom. (c) As microesferas e suas hastes, formadas pelo componente F 1 da ATP sintase, podem ser removidas por diversos tratamentos, por exemplo, com tripsina, e mantêm sua atividade catalítica; as vesículas mantêm, inserido na membrana, o componente F da ATP sintase. O

Figura 11.14 Modelo da ATP sintase de Escherichia coli. A enzima consiste em oito subunidades diferentes, com a estequiometria α β γ δ ε a 3 3 b 2 c 10. F1 = α3 β3 γ δ ε; FO = a b2 c10. A porção F 1estende-se da superfície interna da membrana plasmática para o citoplasma e F fica incluído na O membrana. A maior parte da subunidade γ fica inserida na cavidade central do conjunto α 3-β3; sua extremidade próxima à membrana interage com ε e o anel de subunidades c — o conjunto γ-ε-c atua como rotor. A subunidade 10 δ associa-se com o hexâmero α3-β3 e o dímero b2, e este liga-se à subunidade a — o conjunto α-β-δ-b-a é o estator. A subunidade a contém 3 3 2 os canais de entrada (seta amarela) e de saída (seta branca) de prótons, situados, respectivamente, na superfície externa (voltada para o espaço periplasmático) e interna (em contato com o citoplasma) da membrana plasmática. Eles ganham acesso à membrana através do canal de entrada, ligam-se às subunidades c, provocando a sua rotação, e, após um giro completo, são liberados no citoplasma, através do canal de saída de prótons. A rotação de c10 faz girar a subunidade γ no centro de α3-β3, o que causa as mudanças conformacionais dos sítios catalíticos, necessárias à síntese de ATP (apenas um dos três sítios está representado). (Adaptada de Hutcheon ML et al.: Proc Natl Acad Sci USA 98 (15): 8519-8524, 2001.)

A ATP sintase atua como um nanomotor rotatório

Como a energia liberada pela passagem de prótons através da ATP sintase é aproveitada para promover a reação entre ADP e fosfato (P ) i continua uma incógnita no nível molecular. A sequência provável dos

eventos na enzima de Escherichia coli é descrita a seguir e na Figura 11.14.

A reação ocorre em três etapas e os três sítios catalíticos de F1 podem apresentar-se em três conformações — cada etapa é cumprida por uma conformação específica. Durante a catálise, cada um dos sítios assume, sequencialmente, uma configuração, de tal modo que, em um dado instante, etapas diferentes estão ocorrendo nos três sítios. As etapas seriam: ligação dos substratos (ADP e P ), formação da ligação anidrido fosfórico e i

liberação do ATP sintetizado. As mudanças conformacionais dos sítios catalíticos resultam de movimentação de elementos estruturais da enzima, à custa da energia fornecida pela movimentação de prótons a favor do gradiente.

Em F O, a subunidade a contém, na interface com as subunidades c, dois canais de passagem de prótons, cada um acessível de um lado diferente da

membrana — o canal de entrada no lado externo, periplasmático1, da membrana e o canal de saída no lado interno, citoplasmático, da membrana. Para atravessar a membrana, os prótons penetram no canal de entrada e ligam-se a cadeias laterais de aminoácidos (protonação) das subunidades c, fazendo girar o anel c . Após um giro completo, que resulta 10 no retorno à interface a-c e no alinhamento com o canal de saída, os prótons são liberados (desprotonação) no citoplasma.

A rotação do anel c10 movimenta o eixo central, formado pelas subunidades γ e ε, que são associadas ao anel. Como a subunidade γ fica encaixada no centro da estrutura globular α-β , ao girar, ela interage, 3 3 sucessivamente, com as subunidades α 3-β3, causando as alterações de conformação dos sítios catalíticos. A cada rotação de 120º, os sítios alternam suas propriedades catalíticas.

Resumindo, a rotação do anel c10 em relação à subunidade a em FO determina a rotação do eixo central em relação ao hexâmero α3-β 3em F1. Em analogia a uma máquina motriz, as subunidades γ-ε-c10 constituem o rotor e o conjunto α-β-δ-b-a, o estator (a parte de um motor que não gira 3 3 2

durante o seu funcionamento). A passagem de prótons por F O faz girar o rotor, que se move em relação às subunidades estacionárias. O eixo lateral δ-b mantém estáticos: o hexâmero α-β , enquanto o eixo central γ–ε gira 2 3 3 dentro dele, e a subunidade a, enquanto o anel c10 rroda, impedindo que α3-β e agirem junto com o rotor. A movimentação do rotor em relação ao 3

cilindro α3-β3 e à subunidade a determina, respectivamente, a ativação dos sítios catalíticos e o transporte de prótons.

A prova decisiva sobre o funcionamento da ATP sintase foi obtida por visualização direta da rotação de uma única molécula de enzima. O movimento pôde ser filmado ao microscópio graças a um filamento fluorescente de actina ligado à subunidade γ, que funcionava como marcador. Muitos aspectos do mecanismo catalítico da ATP sintase, investigado há décadas, continuam desconhecidos. Todavia, há consenso que F e F são mecanicamente acoplados por um rotor, cujo movimento O 1

determina a função a ser desempenhada por cada sítio catalítico. Em outras palavras, a ATP sintase converte a energia eletroquímica armazenada no gradiente de prótons em energia mecânica, que é utilizada para gerar energia química sob a forma de ATP.

Em bactérias, sob determinadas condições fisiológicas, a ATP sintase catalisa a hidrólise de ATP, em vez da sua síntese. Realmente, a reação promovida pela enzima é reversível e muito do que se sabe sobre o seu funcionamento resultou da análise da reação ocorrendo no sentido da hidrólise de ATP. Resultados recentes indicam que, durante a hidrólise de ATP, o fosfato (Pi) é liberado ao término da terceira etapa catalítica (terceiro giro de 120°), depois do ADP. Ou seja, quando ocorre a síntese de ATP, o primeiro substrato a ligar-se a um sítio ativo vazio é o P . Ainda mais, a i ligação de P i provocaria impedimentos estéricos à ligação de ATP, permitindo apenas a de ADP. Estas constatações permitem explicar como a ATP sintase consegue ligar ADP eficientemente, sabendo-se que um sítio vazio tem afinidade semelhante por ATP e ADP e que a concentração intracelular de ATP é cerca de 10 vezes maior que a de ADP.