11.3 Fosforilação oxidativa

Quando a atividade das enzimas intrinsecamente produtoras de ROS, como as NADPH oxidases, é exacerbada, instalam-se o estresse oxidativo e as moléstias a ele associadas. Para combater tais situações, diversos fármacos têm sido testados como inibidores dessas enzimas. A inibição da síntese de ROS seria uma abordagem alternativa à utilização de antioxidantes convencionais para a neutralização dessas espécies, uma vez formadas, tendo em vista a baixa eficácia clínica dos antioxidantes convencionais e seus paradoxais efeitos pró-oxidantes.

Ainda em relação à prevenção do acúmulo de ROS, os organismos aeróbios contam com a proteção natural das proteínas desacopladoras. Elas permitem manter níveis não tóxicos de ROS, mas compatíveis com a participação dessas espécies no controle dos processos citados, além de

outros que serão analisados na Seção 11.5.

11.3 Fosforilação oxidativa

As transferências de elétrons de um componente da cadeia de transporte de elétrons para o seguinte constituem reações de oxidação-redução

termodinamicamente favoráveis (Seções 11.1 e 11.2). A síntese de ATP ou fosforilação oxidativa (de “fosforilação de ADP à custa da oxidação de coenzimas”), que é endergônica, é acoplada a essas reações de oxidação-redução.

11.3.1 Hipótese quimiosmótica

A energia derivada do transporte de elétrons é convertida em uma força

próton-motriz

O acoplamento da síntese de ATP ao transporte de elétrons é explicado pela hipótese quimiosmótica, proposta por Peter Mitchell em 1961. Segundo esta hipótese, a energia do transporte de elétrons é utilizada para bombear prótons do interior da mitocôndria através da membrana interna, que é virtualmente impermeável a prótons, para o espaço intermembranas

(Figura 11.11). O transporte de H+ ocorre contragradiente, sendo um processo endergônico. A movimentação unidirecional é possível por estar acoplada à transferência exergônica de elétrons e graças à disposição assimétrica dos complexos transportadores de elétrons em relação às duas faces da membrana interna.

Figura 11.11 Esquema mostrando o bombeamento de prótons (setas verdes) da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas pelos complexos I, III e IV, à custa da energia derivada do transporte de elétrons (setas vermelhas). O gradiente de prótons (concentração maior de H+ no espaço intermembranas) e o gradiente elétrico (face interna da membrana interna mais negativa) constituem a força próton-motriz que é utilizada para sintetizar ATP pela ATP sintase, a única via de acesso de prótons para a matriz (seta roxa).

A consequência do bombeamento é a produção de um gradiente de prótons, isto é, uma concentração de prótons maior no espaço intermembranas do que na matriz mitocondrial. Em mitocôndrias isoladas consumindo O 2 ativamente, o pH externo chega a ser uma unidade menor do que o pH da matriz. A face da membrana interna voltada para a matriz fica mais negativa do que a face voltada para o espaço intermembranas e a diferença de carga elétrica (gradiente elétrico) gera um potencial de membrana, da ordem de 0,1 a 0,2 V. A energia conservada no gradiente eletroquímico resultante é chamada de força próton-motriz, constituída de dois componentes: o gradiente de pH (concentração de prótons maior no espaço intermembranas) e o gradiente elétrico (a matriz é negativa em relação ao espaço intermembranas).

O retorno dos prótons ao interior da mitocôndria é um processo espontâneo, a favor do gradiente eletroquímico, que libera energia capaz de levar à síntese de ATP. Entretanto, a membrana interna da mitocôndria é impermeável a prótons em toda a sua extensão, exceto em sítios específicos,

constituídos pelo complexo sintetizador de ATP, a ATP sintase (Figura

11.11) — é somente por este canal que os prótons podem atravessar a membrana, de volta à matriz, e desfazer o gradiente. A ATP sintase catalisa a formação de ATP quando os prótons atravessam a enzima, em direção ao interior da mitocôndria.

A variação de energia livre associada ao transporte de um próton através da membrana interna da mitocôndria pode ser determinada a partir da diferença de pH e do potencial de membrana estabelecidos em mitocôndrias consumindo oxigênio; tais medidas indicam um valor próximo de 20 kJ · mol–1. Considerando-se que cerca de 60 kJ · mol–1 são consumidos para a síntese de ATP nas condições intracelulares, teoricamente seria necessária a passagem de três prótons pela ATP sintase para cada ATP sintetizado; todavia, os resultados disponíveis para diferentes organismos variam de 3,3 a 5 prótons. A hipótese quimiosmótica vem sendo consubstanciada por evidências experimentais, algumas das quais são apresentadas a seguir.

A fosforilação oxidativa só se processa em mitocôndrias intactas ou em vesículas fechadas, compatíveis com a formação de um gradiente de prótons. Medidas de concentração de prótons durante o transporte de elétrons revelam acúmulo de prótons no exterior da mitocôndria ou no

interior de vesículas invertidas (Figura 11.13 b). A síntese de ATP pode ser obtida mesmo na ausência de transporte de elétrons, desde que exista o gradiente de prótons. Esta verificação também é feita pelo uso de vesículas invertidas. Quando se adiciona álcali ao meio de suspensão destas vesículas, a concentração de H1 diminui; como a concentração interna de H1 permanece constante, é gerado momentaneamente um gradiente de prótons. Há extrusão de prótons pela ATP sintase, acompanhada de síntese de ATP, que pode ser detectado no exterior das vesículas.

O exato funcionamento das bombas de prótons permanece indeterminado

A extrusão de prótons através da membrana interna da mitocôndria é

feita pelos Complexos I, III e IV (Seção 11.2). Este fato pôde ser verificado

experimentalmente pela utilização de lipossomos (Seção 7.1), aos quais foram incorporados isoladamente cada um destes complexos. Nestes experimentos foi possível demonstrar que transferências de elétrons envolvendo cada um dos três complexos são acompanhadas de translocação de prótons através da membrana das vesículas e que, portanto, são estes complexos as bombas de prótons geradoras do gradiente. Entretanto, o mecanismo molecular do acoplamento entre os dois processos ainda é objeto de controvérsia. Segue-se a descrição de duas hipóteses explicativas existentes.

O modelo do acoplamento direto (redox-dependente) propõe que os centros de oxidação-redução dos complexos mitocondriais são diretamente envolvidos na translocação de prótons: ao serem reduzidos, captam prótons da matriz mitocondrial e, ao transferirem elétrons para o componente seguinte da cadeia, liberam prótons no espaço intermembranas. Ou seja, a bomba de prótons e o centro de oxidação-redução constituem uma entidade funcional única, cujo estado de oxidação-redução induz protonação ou desprotonação. Esta possibilidade seria consistente com o bombeamento de prótons pelos Complexos I e III, como já apontado neste texto. Em contrapartida, parece pouco apropriado para o Complexo IV, que não dispõe de grupos prostéticos que apresentem prótons no estado reduzido — o Complexo IV é formado de citocromos e íons de cobre, transportadores apenas de elétrons.

Outra hipótese postula o acoplamento indireto (conformação-dependente), segundo o qual o centro redox e o módulo que bombeia prótons são distintos e distantes um do outro. A transdução de energia ocorre via mudanças conformacionais: os complexos transportadores de elétrons assumem configurações diferentes nos estados oxidado e reduzido.

De acordo com esta hipótese, a enzima transportadora, ao receber ou doar elétrons, sofre alterações estruturais que provocam mudanças no valor de pKa de grupos ionizáveis-chave e também na disposição destes grupos em relação à membrana interna da mitocôndria, resultando na translocação de prótons. Eles são denominados grupos redox-Bohr, em analogia às cadeias laterais de aminoácidos da hemoglobina responsáveis pelo efeito

Bohr (Seção 3.3). As cadeias laterais, expostas na face interna da membrana, ao receberem elétrons, ligam-se a prótons (pK a maior) da matriz. A perda de elétrons inverte a posição das cadeias, que passam a ficar expostas na face externa da membrana, e diminui a sua afinidade por prótons (pKa menor), que são liberados no espaço intermembranas. O complexo volta à sua conformação anterior e os elétrons prosseguem seu caminho pela cadeia.

Essas mudanças conformacionais no ambiente proteico local são transmitidas até as bombas de H+, distantes dos centros redox, que são ativadas. Postula-se que a atuação dos Complexos I e IV segue o modelo do acoplamento indireto.

A organização dos transportadores de elétrons em supercomplexos respiratórios veio complicar ainda mais a compreensão do acoplamento entre as transferências de elétrons e a translocação de prótons.

A razão P/O revela a estequiometria da fosforilação oxidativa

A variação de energia livre associada à transferência de elétrons através de cada um dos Complexos I, III e IV corresponde a uma força próton-

motriz suficientemente grande para promover a síntese de ATP (Figura

11.12). Para cada NADH que se oxida, ou seja, para cada par de elétrons transportados pelos três complexos até o oxigênio, há síntese de 3 ATP.

Pode-se chegar a esta mesma conclusão medindo-se o número de moléculas de ATP formadas e o número de átomos de oxigênio consumidos na oxidação de diferentes substratos; o quociente entre estes valores é chamado razão P/O — entre fosfato (phosphate) incorporado em ATP e oxigênio utilizado.

A razão P/O é uma medida da eficiência da fosforilação oxidativa. Quando o substrato é o NADH, cujos elétrons passam pelos Complexos I, III e IV até chegarem ao oxigênio, a razão P/O é 3. No caso do succinato, os elétrons são transferidos para o FAD e, a seguir, para a coenzima Q; como o Complexo I é “saltado”, o gradiente de prótons formado é menor e a razão P/O do succinato é 2. As equações respectivas de oxidação, incluindo os prótons bombeados, são:

Como a determinação experimental da razão P/O é sujeita a diversos fatores causadores de erro, durante muito tempo, os valores da razão P/O para NADH (3) e succinato (2) foram questionados. Esses números foram revistos a partir da estequiometria do transporte de prótons. Os resultados de consenso estabelecem que, para cada par de elétrons transferidos ao oxigênio, formando uma molécula de água, 4 H+ são bombeados pelo Complexo I, 4 pelo Complexo III e 2 pelo Complexo IV — na oxidação de NADH, há extrusão de 10 H+e na de succinato, 6. Outro dado verificado em mitocôndrias de células animais é que a síntese de uma molécula de ATP requer o retorno de 4 H1 para a matriz mitocondrial, sendo 3 H+pela ATP

sintase e um para o transporte dos substratos e produto da reação (Seção

11.10). A razão P/O baseada na translocação de prótons torna-se igual a 2,5 (10/4) para o NADH e 1,5 (6/4) para o succinato. Trabalhos muito recentes indicam números próximos, iguais a 2,7 e 1,6, respectivamente. Esta nova revisão da razão P/O deriva de estudos da estrutura atômica de diferentes ATP sintases.