Análise de mutantes duplos de mutações aleatórias

Presuma que, em linhagens diferentes, existam mutações em dois genes diferentes

que conferem o mesmo fenótipo mutante — por exemplo, uma exigência de arginina. Denominaremos esses genes arg-1 e arg-2. Os genótipos das duas linhagens podem ser representados como arg-1 · arg-2+ e arg-1+ · arg-2. Essas duas linhagens podem ser fundidas para formar um heterocário com os dois núcleos em um citoplasma compartilhado:

 

O núcleo 1 é arg-1 · arg-2+

O núcleo 2 é arg-1+ · arg-2

Tendo em vista que os produtos dos genes são criados em um citoplasma comum, os dois alelos do tipo selvagem podem exercer seu efeito dominante e colaborar para a produção de um heterocário de fenótipo do tipo selvagem. Em outras palavras, as duas mutações se complementam, justamente conforme ocorreria em um diploide. Se as mutações fossem de alelos do mesmo gene, não haveria complementação.

 

Análise de mutantes duplos de mutações aleatórias Relembre que, para saber se dois genes interagem, precisamos avaliar o fenótipo do mutante duplo para verificar se ele é diferente da combinação de ambas as mutações únicas. O mutante duplo é obtido por meio de entrecruzamento. A F1 é obtida como parte do teste de complementação; assim, com a presunção de que a complementação foi observada, sugerindo genes diferentes, a F é autofecundada ou entrecruzada para se 1 obter uma F2 homozigota para ambas as mutações. Esse mutante duplo pode ser identificado em seguida ao se observarem as proporções mendelianas. Por exemplo, se uma proporção mendeliana 9:3:3:1 padrão for obtida, o fenótipo presente no único 1/16 da progênie representa o mutante duplo (o “1” em 9:3:3:1). Nos casos de interação gênica, entretanto, o fenótipo do mutante duplo pode não ser distinto, mas corresponderá àquele dos mutantes únicos. Nesse caso, resultará uma proporção mendeliana modificada, tal como 9:3:4 ou 9:7.

A proporção mendeliana de 9:3:3:1 padrão é o caso mais simples, esperado se não

houver interação gênica e se as duas mutações em teste estiverem em cromossomos diferentes. Essa proporção de 9:3:3:1 é a hipótese nula: qualquer proporção mendeliana modificada que represente um desvio dessa hipótese nula será informativa, como os exemplos a seguir irão demonstrar:

A proporção de 9:3:3:1 | Nenhuma interação gênica. Como um valor basal, iniciaremos com o caso no qual dois genes mutantes não interagem, uma situação na qual esperamos a proporção de 9:3:3:1. Vejamos a herança da cor da pele em cobras do milho. A cor natural da cobra é um padrão de repetição de camuflagem preta e laranja, conforme

demonstrado na Figura 6.14 A. O fenótipo é produzido por dois pigmentos separados, ambos os quais estão sob controle genético. Um gene determina o pigmento laranja, e os alelos que consideraremos são o+ (presença de pigmento laranja) e o (ausência de pigmento laranja). Outro gene determina o pigmento preto, e seus alelos são b+ (presença de pigmento preto) e b (ausência de pigmento preto). Esses dois genes não estão ligados. O padrão natural é produzido pelo genótipo o+/—; b+/—. (O travessão representa a presença de qualquer alelo.) Uma cobra que é o/o; b+/— é preta, tendo em

vista que não apresenta o pigmento laranja (Figura 6.14 B), e uma cobra que é o+/—;

b/b é laranja, tendo em vista que não apresenta o pigmento preto (Figura 6.14 C). O

duplo homozigoto recessivo o/o; b/b é albino (Figura 6.14 D). Entretanto, observe que a cor rosa pálida do albino advém de um outro pigmento, a hemoglobina do sangue, que é visível através da pele dessa cobra quando os outros pigmentos estão ausentes. A cobra albina também demonstra claramente que existe outro elemento para o padrão de pigmentação da pele, além do pigmento: o motivo em repetição, no qual e ao redor do qual o pigmento é depositado.

 

FIGURA 6.13 Um heterocário de Neurospora e fungos semelhantes mimetiza um estado diploide. Quando as células vegetativas se fundem, os núcleos haploides compartilham o mesmo citoplasma em um heterocário. Neste exemplo, os núcleos haploides com mutações em diferentes genes na via de síntese da arginina se complementam para produzir um Neurospora que deixa de necessitar de arginina.

FIGURA 6.14 Em cobras Pantherophis guttatus, combinações dos pigmentos laranja e preto determinam os quatro fenótipos demonstrados. A. Uma cobra camuflada preta e laranja do tipo selvagem sintetiza ambos os pigmentos preto e laranja. B. Uma cobra preta não sintetiza o pigmento laranja. C. Uma cobra laranja não sintetiza o pigmento preto. D. Uma cobra albina não sintetiza pigmento preto, nem laranja. (Anthony Griffiths.)

 

 

Se uma cobra laranja homozigota e uma cobra preta homozigota forem cruzadas, a F 1

é do tipo selvagem (camuflada), demonstrando a complementação:

 

Aqui, entretanto, uma F 2 demonstra uma proporção de 9:3:3:1 padrão:

A proporção de 9:3:3:1 é produzida em virtude de os dois genes para pigmento atuarem de modo independente no nível celular.

 

 

Se a presença de um mutante torna uma via bioquímica falha, a outra via ainda está ativa, produzindo a cor do outro pigmento. Ambas as vias falham apenas quando ambos os mutantes estão presentes, e não é produzido pigmento de nenhuma cor.

 

A proporção de 9:7 | Genes na mesma via bioquímica. A proporção da F2 do cruzamento di-híbrido da campânula demonstra ambas as plantas azuis e brancas em uma proporção de 9:7. Como os referidos resultados podem ser explicados? A proporção de 9:7 é claramente uma modificação da proporção di-híbrida de 9:3:3:1, com 3:3:1 combinadas para perfazer 7; portanto, é inferido algum tipo de interação. O cruzamento das duas linhagens brancas e as gerações subsequentes podem ser representados como segue:

Claramente, nesse caso, o único modo por meio do qual é possível uma proporção de 9:7 é se o mutante duplo apresentar os mesmos fenótipos que os dois mutantes únicos. Portanto, a proporção modificada constitui um modo de identificar o fenótipo do mutante duplo. Além disso, os fenótipos idênticos dos mutantes únicos e duplos sugerem que cada alelo mutante controla uma etapa diferente na mesma via bioquímica. Os resultados demonstram que uma planta apresentará pétalas brancas se for homozigota em relação ao alelo mutante recessivo de qualquer um dos genes ou de ambos os genes. Para apresentar o fenótipo azul, uma planta deve apresentar no mínimo uma cópia do alelo dominante de ambos os genes, tendo em vista que ambos são necessários para completar as etapas sequenciais na via. Não importa qual esteja ausente, a mesma via bioquímica falha, produzindo o mesmo fenótipo. Portanto, três das classes genotípicas produzirão o mesmo fenótipo e, assim, em geral, resultam apenas dois fenótipos.

O exemplo nas campânulas envolveu etapas diferentes em uma via de síntese.

Resultados semelhantes podem surgir a partir da regulação gênica. Um gene regulador com frequência atua por meio da produção de uma proteína que se liga a um sítio

regulador upstream de um gene-alvo, facilitando a transcrição do gene (Figura 6.15). Na ausência da proteína reguladora, o gene-alvo será transcrito em níveis muito baixos, inadequados para as necessidades celulares. Cruzaremos uma linhagem pura r/r defeituosa para a proteína reguladora com uma linhagem pura a/a defeituosa para a proteína-alvo. O cruzamento é r/r; a+/a+ × r+/r+; a/a. O di-híbrido r+/r; a+/a demonstrará complementação entre os genótipos mutantes, tendo em vista que ambos, r+ e a+, estão presentes, possibilitando a transcrição normal do alelo do tipo selvagem. Quando autofecundados, os di-híbridos da F 1 também resultarão em uma proporção fenotípica de 9:7 na F : 2

FIGURA 6.15 + + O gene r codifica uma proteína reguladora, e o gene a codifica uma proteína estrutural. Ambos têm de ser normais para que uma proteína estrutural funcional (“ativa”) seja sintetizada.

 

CONCEITO-CHAVE Uma proporção de 9:7 na F2 sugere interação de genes na mesma via; a ausência de qualquer

função gênica leva à ausência do produto nal da via.

A proporção de 9:3:4 | Epistasia recessiva. Uma proporção de 9:3:4 na F2 sugere um tipo de interação gênica denominado epistasia. Essa palavra significa “predominância sobre”, e se refere à situação na qual o mutante duplo demonstra o fenótipo de uma mutação, mas não de outra. A mutação que “predomina sobre” é epistática, enquanto a que “fica sob” é hipostática. A epistasia também resulta de os genes estarem na mesma via bioquímica. Em uma via de síntese simples, a mutação epistática é carreada por um gene que está mais upstream (mais inicialmente na via) do que o gene da mutação

hipostática (Figura 6.16). O fenótipo mutante do gene upstream predomina, não importa o que esteja ocorrendo posteriormente na via.

Vejamos um exemplo a respeito da síntese do pigmento das pétalas na planta maria-

olhos-azuis (Collinsia parviflora). A partir do tipo selvagem azul, iniciaremos com duas linhagens mutantes puras, uma com pétalas brancas (w/w) e a outra com pétalas magenta (m/m). Os genes w e m não estão ligados. A F1 e a F2 são como segue:

FIGURA 6.16 + + Alelos do tipo selvagem de dois genes ( w e m) codificam enzimas que catalisam etapas sucessivas na síntese de um pigmento azul das pétalas. As plantas homozigotas m/m produzem flores magenta, e as plantas homozigotas w/w produzem flores brancas. O mutante duplo w/w; m/m também produz flores brancas, indicando que o branco é epistático em relação ao magenta.

 

Na F 2, a proporção fenotípica de 9:3:4 é diagnóstica de epistasia recessiva. Assim como no caso precedente, novamente observamos que a proporção nos informa qual é obrigatoriamente o fenótipo do duplo mutante, tendo em vista que o componente da proporção deve ser um agrupamento de uma classe mutante única ( ) mais a classe mutante dupla ( ). Portanto, o mutante duplo expressa apenas um dos dois fenótipos mutantes; assim, por definição, branco tem de ser epistático em relação a magenta. (Para encontrar o mutante duplo dentro do grupo, as plantas brancas da F 2 deveriam ser individualmente submetidas ao cruzamento-teste.) Essa interação é denominada epistasia recessiva, tendo em vista que um fenótipo recessivo (branco) supera o outro fenótipo. A epistasia dominante será considerada na próxima seção.

No nível celular, podemos justificar a epistasia recessiva em Collinsia por meio do

tipo de via a seguir (ver também Figura 6.16).

 

Observe que a mutação epistática ocorre em uma etapa na via que leva ao pigmento azul; essa etapa é anterior à etapa que é bloqueada pela mutação mascarada.

Outro caso informativo de epistasia recessiva é a cor amarela da pelagem de alguns

cães labrador retriever. Dois alelos, B e b, fazem referência às pelagens preta e marrom, respectivamente. Os dois alelos produzem melanina preta e marrom. O alelo e de outro gene é epistático em relação a esses alelos, proporcionando uma pelagem amarela

(Figura 6.17). Portanto, ambos os genótipos B/—; e/e e b/b; e/e produzem um fenótipo amarelo, enquanto B/—; E/— e b/b; E/— são preto e marrom, respectivamente. Esse caso de epistasia não é causado por um bloqueio upstream na via que leva ao pigmento escuro. Cães amarelos podem produzir pigmento preto ou marrom, conforme pode ser observado em seus narizes e seus lábios. A ação do alelo e é evitar a deposição do pigmento nos pelos. Nesse caso, o gene epistático está dowstream no desenvolvimento; ele representa um tipo de alvo do desenvolvimento que tem de ser de genótipo E antes que o pigmento possa ser depositado.

FIGURA 6.17 Três cores de pelagem diferentes em labrador retriever. Dois alelos B e b de um gene de pigmento determinam (A) preto e (B) marrom, respectivamente. Em um gene em separado, E possibilita a deposição da cor na pelagem, e e/e impede a deposição, resultando (C) no fenótipo dourado. A parte C ilustra a epistasia recessiva. (Anthony Griffiths.)

 

CONCEITO-CHAVE A epistasia é inferida quando um alelo mutante de um gene mascara a expressão de um

alelo mutante de outro gene e em vez disso expressa o seu próprio fenótipo.

 

Em fungos, a análise de tétrades é útil na identificação de um mutante duplo. Por

exemplo, um asco que contém metade dos seus produtos como do tipo selvagem deve conter mutantes duplos. Considere o cruzamento:

 

a · b+ × a+ · b

Em alguma proporção da progênie, os alelos a e b segregarão juntos (um asco ditipo não parental). Uma referida tétrade demonstrará os fenótipos a seguir:

 

tipo selvagem a+ · b+ mutante duplo a · b tipo selvagem a+ · b+ mutante duplo a · b

Portanto, o mutante duplo obrigatoriamente tem o genótipo não do tipo selvagem e pode ser avaliado de acordo. Se o fenótipo for o fenótipo a, então b está sendo sobrepujado; se o fenótipo for o fenótipo b, então a está sendo sobrepujado. Se ambos os fenótipos estiverem presentes, então não há epistasia.

 

A proporção de 12:3:1 | Epistasia dominante. Em dedaleiras (Digitalis purpurea), dois genes interagem na via que determina a coloração das pétalas. Os dois genes não estão ligados. Um gene afeta a intensidade do pigmento vermelho na pétala; o alelo d resulta na cor vermelho-clara observada em populações naturais de dedaleiras, enquanto D é

um alelo mutante que produz a cor vermelho-escura (Figura 6.18). O outro gene determina em quais células o pigmento é sintetizado: o alelo w possibilita a síntese do pigmento por todas as pétalas assim como no tipo selvagem, mas o alelo mutante W confina a síntese do pigmento às pequenas manchas na garganta. Se autofecundarmos um di-híbrido D/d; W/w, a proporção da F2 é como segue:

A proporção nos informa que o alelo dominante W é epistático, produzindo a proporção 12:3:1. O componente da proporção inclui obrigatoriamente a classe mutante dupla (

 

), que é claramente de fenótipo branco, estabelecendo a epistasia do alelo dominante

W. Os dois genes atuam em uma via comum do desenvolvimento: W evita a síntese do pigmento vermelho, mas apenas em uma classe especial de células que constituem a área principal da pétala; a síntese é limitada às manchas da garganta. Quando a síntese é permitida, o pigmento pode ser produzido em concentrações altas ou baixas.

 

FIGURA 6.18 Em dedaleiras, D e d causam pigmentos escuros e claros, respectivamente, enquanto o W epistático restringe o pigmento às manchas na garganta. (Anthony Griffiths.)

 

Supressores. Não é fácil selecionar ou triar especificamente interações epistáticas e casos de epistasia devem ser construídos por meio da laboriosa combinação de duas mutações candidatas por vez. Entretanto, em relação ao nosso próximo tipo de interação gênica, o experimentador pode selecionar prontamente alelos mutantes de interesse. Um supressor é um alelo mutante de um gene que reverte o efeito de uma mutação de outro gene, resultando em um fenótipo do tipo selvagem ou próximo do tipo selvagem. A supressão implica que o gene-alvo e o gene supressor normalmente interagem em algum nível funcional em seus estados do tipo selvagem. Por exemplo, presuma que um alelo a+ produza o fenótipo normal, enquanto um alelo mutante recessivo a resulte em uma anormalidade. Um alelo mutante recessivo s em outro gene suprime o efeito de a e, assim, o genótipo a/a · s/s apresentará o fenótipo do tipo selvagem (semelhante a a+). Alelos supressores por vezes não apresentam efeito na ausência da outra mutação; em um referido caso, o fenótipo de a+/a+ · s/s seria do tipo selvagem. Em outros casos, o alelo supressor produz o seu próprio fenótipo anormal.

A triagem de supressores é bem direta. Inicie com um mutante em algum processo de

interesse, exponha esse mutante a agentes que causem mutação, tal como radiação de alta energia, e trie os descendentes em relação aos tipos selvagens. Em haploides tais como fungos, a triagem é realizada simplesmente por meio do plaqueamento de células mutagenizadas e da observação das colônias com fenótipos do tipo selvagem. Na maior parte, os tipos selvagens que são originados desse modo são meramente reversões do evento mutacional original e são denominados revertentes. Entretanto, alguns serão “pseudorrevertentes”, mutantes duplos nos quais uma das mutações é um supressor.

Os estados revertente e suprimido podem ser distinguidos por meio de cruzamento

apropriado. Por exemplo, em leveduras, os dois resultados seriam distinguidos como segue:

 

O surgimento do fenótipo mutante original identifica o genitor como um mutante suprimido.

Em diploides, os supressores produzem diversas proporções de F2 modificadas, que

são úteis na confirmação da supressão. Vejamos um exemplo da vida real de Drosophila. O alelo recessivo pd resulta na cor dos olhos roxa quando não suprimido. Um alelo su recessivo não apresenta por si próprio um fenótipo detectável, mas suprime o alelo recessivo não ligado pd. Portanto, pd/pd; su/su tem o aspecto do tipo selvagem e apresenta olhos vermelhos. A análise a seguir ilustra o padrão de herança. Uma mosca com olhos roxos homozigota é cruzada com uma com olhos vermelhos homozigota que carreia o supressor.

 

A proporção geral na F2 é de 13 vermelhos:3 roxos. O componente de obrigatoriamente inclui o mutante duplo, que é claramente de fenótipo do tipo selvagem. Essa proporção é esperada a partir de um supressor recessivo que por si próprio não apresenta fenótipo detectável.

Por vezes a supressão é confundida com epistasia. Entretanto, a diferença-chave é

que um supressor cancela a expressão de um alelo mutante e restaura o fenótipo do tipo selvagem correspondente. Além disso, com frequência apenas dois fenótipos segregam (assim como nos exemplos precedentes), em vez de três, como na epistasia.

Como os supressores atuam no nível molecular? Existem muitos mecanismos

possíveis. Um tipo de supressão particularmente útil tem por base a ligação física de produtos gênicos na célula — por exemplo, ligação entre proteínas. Presuma que duas proteínas normalmente se combinem para proporcionar algum tipo de função celular. Quando uma mutação causa uma alteração no formato de uma proteína, ela deixa de se

combinar à outra; portanto, a função é perdida (Figura 6.19). Entretanto, uma mutação supressora que causa uma alteração no formato compensatória na segunda proteína pode restaurar a combinação, portanto, a função normal. Nessa figura, se os genótipos fossem diploides que representam uma F2 de um di-híbrido, então resultaria uma proporção de 14:2, tendo em vista que os únicos genótipos mutantes seriam m/m · s+/s+ (1/16) e m+/m+ · s/s (1/16), totalizando 2/16. Se esse fosse um cruzamento di-híbrido haploide (tal como m+ s+ × m s), resultaria uma proporção de 1:1. A partir das proporções de supressores em geral, com frequência as proteínas que interagem podem ser deduzidas.

Alternativamente, quando uma mutação causa um bloqueio em uma via metabólica, o

supressor encontra algum modo de superar o bloqueio — por exemplo, por meio do redirecionamento de intermediários similares para além do bloqueio da via. No exemplo a seguir, o supressor fornece um intermediário B para contornar o bloqueio.

FIGURA 6.19 Uma primeira mutação altera o sítio de ligação de uma proteína, de modo que ela não consegue mais se ligar a um parceiro. Uma mutação supressora no parceiro altera o sítio de ligação, de modo que ambas as proteínas são capazes de se ligar novamente.

 

Em diversos organismos, foram encontrados supressores sem sentido — mutações nos genes de tRNA que resultam em um anticódon que se ligará a um códon de parada prematuro em uma sequência codificadora mutante. Portanto, o supressor possibilita que a tradução prossiga além do bloqueio anterior e produza uma proteína completa, em vez de uma proteína truncada. Essas mutações supressoras com frequência apresentam poucos efeitos sobre o fenótipo além da supressão.

 

CONCEITO-CHAVE Alelos mutantes denominados supressores cancelam o efeito de um alelo mutante de outro

gene, resultando em fenótipo do tipo selvagem.

 

Modificadores. Como a denominação sugere, uma mutação modificadora em um segundo locus altera o grau de expressão de um gene mutado no primeiro locus. Os genes reguladores fornecem uma ilustração simples. Assim como em um exemplo anterior, as proteínas reguladoras se ligam à sequência do DNA upstream do sítio de início da transcrição. Essas proteínas regulam o nível de transcrição. Na discussão sobre a complementação, consideramos uma mutação nula de um gene regulador que evitou quase completamente a transcrição. Entretanto, algumas mutações reguladoras alteram o nível de transcrição do gene-alvo, de modo que mais ou menos proteína é produzida. Em outras palavras, uma mutação em uma proteína reguladora pode diminuir ou aumentar o gene transcrito. Vejamos um exemplo que utiliza uma mutação b em um regulador que regula para menos, que afeta o gene A em um fungo, tal como levedura. Observamos o efeito de b sobre uma mutação leaky no gene A. Uma mutação leaky é uma mutação com algum nível baixo de função gênica. Cruzamos uma mutação gotejante a com a mutação reguladora b:

 

Mutante leaky a · b+ × Regulador ineficiente a+ · b

 

Progênie Fenótipo

 

a+ · b+ tipo selvagem

a+ · b defeituoso (baixa transcrição)

 

a · b+ defeituoso (proteína A defeituosa)

 

a · b extremamente defeituoso (baixa transcrição da proteína defeituosa)

 

Portanto, a ação do modificador é observada no aparecimento de duas gradações de fenótipos mutantes dentro da progênie a.

 

Letais sintéticos. Em alguns casos, quando dois mutantes únicos viáveis são intercruzados, os mutantes duplos resultantes são letais. Em uma F2 diploide, esse resultado seria manifestado como uma proporção de 9:3:3, tendo em vista que o mutante duplo (que seria o componente “1” da proporção) estaria ausente. Esses letais sintéticos podem ser considerados uma categoria especial de interação gênica. Eles podem apontar para tipos específicos de interações de produtos gênicos. Por exemplo, a análise do genoma revelou que a evolução produziu muitos sistemas duplicados dentro da célula. Uma vantagem desses sistemas duplicados pode ser o fornecimento de “cópias de segurança”. Se houver mutações nulas nos genes em ambos os sistemas duplicados, então um sistema defeituoso não apresentará uma cópia de segurança, e o indivíduo não apresentará a função essencial e morrerá. Em outro caso, uma mutação leaky em uma etapa de uma via bioquímica pode causar a diminuição da velocidade da via, mas deixar função suficiente para a vida. Entretanto, se mutantes duplos são combinados, cada um com uma mutação leaky em uma etapa diferente, a via inteira é interrompida. Uma versão da última interação é de duas mutações em proteínas que

interagem, conforme demonstrado na Figura 6.20.

Nas discussões anteriores sobre proporções mendelianas modificadas, todos os

cruzamentos eram autofecundações de di-híbridos. Como um exercício, você pode querer calcular as proporções que seriam produzidas nos mesmos sistemas se fossem realizados cruzamentos-teste em vez de autofecundações.

 

CONCEITO-CHAVE Uma diversidade de proporções da F1 de 9:3:3:1 modi cadas pode revelar tipos especí cos de

interação gênica.

Um resumo de algumas das proporções que revelam a interação gênica está

demonstrado na Tabela 6.2.

 

FIGURA 6.20 Duas proteínas em interação realizam alguma função essencial em algum substrato, tal como DNA, mas primeiramente precisam se ligar a ele. A ligação reduzida de qualquer proteína possibilita a permanência de algumas funções, mas a ligação reduzida de ambas é letal.

 

Tabela 6.2 Algumas proporções de F2 modi cadas.