Estágios da transcrição

CONCEITO-CHAVE A transcrição é assimétrica: apenas um lamento do DNA de um gene é utilizado

como um molde para a transcrição. Esse lamento está na orientação de 3′ para 5′ e o RNA é

sintetizado no sentido 5′ para 3′.

Estágios da transcrição

A sequência codificadora de proteína em um gene é um segmento relativamente pequeno do DNA inserido em uma molécula de DNA muito mais longa (o cromossomo). Como o segmento apropriado é transcrito em uma molécula de RNA unifilamentar de comprimento e sequência de nucleotídios corretos? Tendo em vista que o DNA de um cromossomo é uma unidade contínua, a maquinaria de transcrição deve estar direcionada para o início de um gene para iniciar a transcrição no local certo, continuar transcrevendo o comprimento do gene, e finalmente interromper a transcrição na outra extremidade. Esses três estágios distintos da transcrição são denominados iniciação, alongamento e término. Embora o processo geral de transcrição seja notavelmente semelhante em procariotos e em eucariotos, existem diferenças importantes. Por esse motivo, acompanharemos os três estágios primeiramente em procariotos (com a utilização da bactéria intestinal E. coli como exemplo) e em seguida em eucariotos.

Iniciação em procariotos. Como a RNA polimerase encontra o ponto de início correto para a transcrição? Em procariotos, a RNA polimerase normalmente se liga a uma sequência de DNA específica, denominada promotor, localizada próximo do início da região transcrita. Um promotor é uma parte importante da região reguladora de um gene. Relembre que, tendo em vista que a síntese de um transcrito de RNA tem início na sua extremidade 5′ e continua no sentido 5′ para 3′, a convenção é desenhar e fazer referência à orientação do gene também no sentido 5′ para 3′. Por esse motivo, o filamento de DNA não molde normalmente é demonstrado. Em geral, a extremidade 5′ é desenhada à esquerda e a 3′ à direita. Com essa visão, tendo em vista que o promotor deve estar próximo da extremidade do gene na qual a transcrição tem início, diz-se que ele está na extremidade 5′ do gene; portanto, a região promotora também é

denominada região reguladora 5′ (Figura 8.7 A).

FIGURA 8.6 A sequência de mRNA é complementar ao filamento-molde de DNA a partir do qual ela é transcrita e, portanto, corresponde à sequência do filamento não molde (exceto que o RNA apresenta U onde o DNA apresenta T). Esta sequência é do gene para a enzima β-galactosidase.

A primeira base transcrita está sempre na mesma localização, designada sítio

de iniciação. É feita referência ao promotor como upstream do sítio de iniciação, tendo em vista que está localizado à frente do sítio de iniciação (5′ do gene), no sentido oposto ao da transcrição. Um sítio downstream estaria localizado posteriormente no sentido da transcrição. Por convenção, a primeira base do DNA a ser transcrita é numerada +1. As posições dos nucleotídios upstream do sítio de iniciação são indicadas por um sinal negativo (—) e aquelas dowstream, por um sinal positivo (+).

A Figura 8.7 B demonstra as sequências promotoras de sete genes diferentes

no genoma de E. coli. Tendo em vista que a mesma RNA polimerase se liga às sequências promotoras desses genes diferentes, as semelhanças entre os promotores não são uma surpresa. Em particular, duas regiões de grande semelhança aparecem em virtualmente todos os casos. Essas regiões foram denominadas as regiões —35 (menos 35) e —10, tendo em vista que estão localizadas 35 pares de bases e 10 pares de bases, respectivamente, upstream

da primeira base transcrita. Elas estão demonstradas em amarelo na Figura 8.7 B. Conforme você pode observar, as regiões —35 e —10 de diferentes genes não precisam ser idênticas para realizar uma função semelhante. Não obstante, é possível chegar a uma sequência de nucleotídios, denominada sequência consenso, que está de acordo com a maior parte das sequências. A sequência

consenso do promotor de E. coli está demonstrada na parte inferior da Figura

8.7 B. Uma holoenzima RNA polimerase (ver próximo parágrafo) se liga ao DNA nesse ponto, em seguida desenrola a dupla-hélice do DNA e inicia a

síntese de uma molécula de RNA. Observe, na Figura 8.7 A, que a parte do gene codificadora de proteína normalmente tem início em uma sequência ATG, mas o sítio de iniciação, onde a transcrição tem início, normalmente está bem upstream dessa sequência. A parte intercalar é denominada região 5′ não traduzida (5' UTR).

A RNA polimerase bacteriana que procura no DNA uma sequência

promotora é denominada holoenzima RNA polimerase (Figura 8.8). Esse complexo multissubunidades é composto pelas cinco subunidades do cerne da enzima (duas subunidades α, uma β, uma β′ e uma ω), mais uma subunidade denominada fator sigma (σ). As duas subunidades α auxiliam na montagem da enzima e promovem interações com proteínas reguladoras, a subunidade β é ativa na catálise, a subunidade β′ se liga ao DNA, e a subunidade ω apresenta papéis na montagem da enzima e na regulação da expressão gênica. A subunidade σ se liga às regiões —10 e —35, posicionando, assim, a holoenzima para iniciar a transcrição corretamente no sítio de início (ver

Figura 8.8 A). A subunidade σ também apresenta um papel na separação (dissociação) dos filamentos de DNA ao redor da região —10, de modo que o cerne da enzima consegue se ligar fortemente ao DNA no preparo para a síntese do RNA. Após a ligação do cerne da enzima, a transcrição tem início e

a subunidade σ se dissocia do restante do complexo (ver Figura 8.8 B).

FIGURA 8.7 A. O promotor está localizado upstream (em direção à extremidade 5′) do ponto de início e das sequências codificadoras. B. Os promotores apresentam regiões de sequências semelhantes, conforme indicado pelo sombreado em amarelo em sete diferentes sequências promotoras em E. coli. Os espaços (pontos) estão inseridos nas sequências para otimizar o alinhamento das sequências comuns. Os números fazem referência ao número de bases antes (—) ou após (+) o ponto de iniciação da síntese de RNA. A sequência consenso em relação à maior parte dos promotores de E. coli está na parte inferior. (Dados de H. Lodish, D. Baltimore, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira e J. Darnell, Molecular Cell Biology, 3rd ed.)

A E. coli, assim como a maior parte das outras bactérias, apresenta diversos

fatores σ diferentes. Um, denominado σ70 em virtude de sua massa em quilodáltons ser 70, é a subunidade σ primária utilizada para iniciar a transcrição da vasta maioria dos genes de E. coli. Outros fatores σ reconhecem diferentes sequências promotoras. Portanto, por meio da associação com diferentes fatores σ, o mesmo cerne enzimático consegue reconhecer diferentes sequências de promotor e transcrever diferentes conjuntos de genes.

Alongamento. Na medida em que a RNA polimerase se movimenta ao longo do DNA, ela desenrola o DNA à sua frente e enrola novamente o DNA que já foi transcrito. Desse modo, ela mantém uma região do DNA unifilamentar, denominada bolha de transcrição, dentro da qual o filamento-molde é exposto. Na bolha, a polimerase monitora a ligação de um ribonucleosídio trifosfato livre à próxima base exposta no molde de DNA e, se houver complementariedade, adiciona-a à cadeia. A energia para a adição de um nucleotídio é derivada da divisão do trifosfato de alta energia e da liberação de difosfato inorgânico, de acordo com a fórmula geral a seguir:

FIGURA 8.8 A subunidade σ posiciona a RNA polimerase procariótica para o início da transcrição. A. A ligação da subunidade σ às regiões —10 e —35 posiciona as outras subunidades para a iniciação correta. B. Logo após o início da síntese de RNA, a subunidade σ se dissocia das outras subunidades, que continuam a transcrição.

A Figura 8.9 A fornece uma ilustração física do alongamento. Dentro da

bolha, os últimos oito ou nove nucleotídios adicionados à cadeia de RNA formam um híbrido de RNA-DNA por meio do pareamento de bases complementares com o filamento-molde. Na medida em que a cadeia de RNA é alongada em sua extremidade 3′, a extremidade 5′ é adicionalmente liberada da polimerase. Os pares de bases complementares são quebrados no ponto de saída, liberando o um filamento único.

Término. A transcrição de um gene individual continua além do segmento do gene codificador de proteína, criando uma região 3′ não traduzida (3′ UTR) na extremidade do transcrito. O alongamento prossegue até que a RNA polimerase reconhece sequências de nucleotídios especiais que atuam como um sinal em relação ao término da cadeia. O encontro com os nucleotídios de

sinal inicia a liberação do RNA nascente e da enzima do molde (Figura 8.9 B). Os dois mecanismos principais de término em E. coli (e em outras bactérias) são denominados intrínseco e rho-dependente.

No mecanismo intrínseco, o término é direto. As sequências de terminação

contêm aproximadamente 40 pares de bases, terminando em um trecho rico em GC que é seguido por um trecho de seis ou mais A. Tendo em vista que G e C no molde fornecerão C e G, respectivamente, no transcrito, o RNA nessa região também é rico em GC. Essas bases C e G são capazes de formar ligações de hidrogênio complementares entre si, resultando em uma alça em

grampo (Figura 8.10). Relembre que o par de bases G-C é mais estável do que o par A-T em virtude de estar ligado pelo hidrogênio em três sítos, enquanto o par A-T (ou A-U) é mantido junto por apenas duas ligações de hidrogênio. As alças em grampo do RNA, que são largamente pares G-C, são mais estáveis do que as alças que são largamente constituídas por pares A-U. A estrutura em grampo é seguida por um trecho de aproximadamente oito U que são complementares aos resíduos de A no molde de DNA.

FIGURA 8.9 As cinco subunidades da RNA polimerase estão demonstradas como uma forma única semelhante a uma elipse circundando a bolha de transcrição. A. Alongamento: a síntese de um filamento de RNA complementar à região unifilamentar do filamento-molde de DNA ocorre no sentido 5′ para 3′. O DNA que é desenrolado à frente da RNA polimerase é novamente enrolado após ter sido transcrito. B. Término: o mecanismo intrínseco demonstrado aqui é um de dois modos utilizados para interromper a síntese de RNA e liberar o transcrito de RNA concluído e a RNA polimerase do DNA. Neste caso, a formação de uma alça em grampo estabelece a sua liberação. Em relação a ambos os mecanismos intrínseco e mediado por rho, o término primeiramente requer a síntese de determinadas sequências de RNA.

Normalmente, na progressão do alongamento da transcrição, a RNA

polimerase irá pausar se o curto híbrido de DNA-RNA na bolha de transcrição for fraco e irá retroceder para estabilizar o híbrido. Assim como nos grampos, a força do híbrido é determinada pelo número relativo de pares de bases G-C em comparação aos pares de bases A-U (ou pares de bases A-T em híbridos de RNA-DNA). No mecanismo intrínseco, acredita-se que a polimerase pause após a síntese das U (A-U forma um híbrido de DNA-RNA fraco). Entretanto, a polimerase ao retroceder encontra a alça em grampo. Esse bloqueio no trajeto desencadeia a liberação do RNA da polimerase e a liberação da polimerase do molde de DNA.

O segundo tipo de mecanismo de término requer o auxílio de uma proteína

denominada fator rho. Essa proteína reconhece as sequências de nucleotídios que atuam como sinais de término para a RNA polimerase. RNA com sinais de término rho-dependentes não apresentam o trecho de resíduos U em sua extremidade 3′ e normalmente não apresentam alças em grampo. Em vez disso, eles apresentam uma sequência de aproximadamente 40 a 60 nucleotídios que é rica em resíduos C e pobre em resíduos G e inclui um segmento upstream denominado sítio rut (utilização de rho). Rho é um hexâmero composto por seis subunidades idênticas que se ligam à cadeia de RNA nascente no sítio rut. Esses sítios estão localizados logo upstream das sequências (relembre que upstream significa a 5′ de) nas quais a RNA polimerase tende a pausar. Após a ligação, rho facilita a liberação do RNA da RNA polimerase. Portanto o término rho-dependente envolve a ligação de rho a rut, a pausa da polimerase e a dissociação mediada por rho do RNA da RNA polimerase.