“Omas”

FIGURA 14.19 Os mapas genômicos circulares das linhagens de E. coli K-12 e O157:H7. O círculo ilustra a distribuição de sequências específicas de cada linhagem. O arcabouço colinear comum a ambas as linhagens está demonstrado em azul. As posições de sequências específicas de O157:H7 estão demonstradas em vermelho. As posições das sequências específicas de K-12 estão demonstradas em verde. As posições das sequências específicas de O157:H7 e K-12 no mesmo local estão demonstradas em marrom. As sequências hipervariáveis estão demonstradas em roxo. (Dados de N. T. Perna et al., “Genome Sequence of Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7”, Nature 409, 2001, 529-533. Cortesia de Guy Plunkett III e Frederick Blattner.)

“Omas”

Além do genoma, outros conjuntos de dados globais são de interesse. Seguindo o exemplo do termo genoma, em relação ao qual “gene” mais “-oma” se torna uma palavra para “todos os genes”, pesquisadores da genômica cunharam uma diversidade de termos para descrever outros conjuntos de dados globais com os quais estão trabalhando. Essa lista de omas inclui:

O transcriptoma. Sequências e padrões de expressão de todos os transcritos de RNA (quais tipos,

onde nos tecidos, quando, quanto).

O proteoma. Sequências e padrões de expressão de todas as proteínas (onde, quando, quanto).

O interatoma. Conjunto completo de interações físicas de proteínas e segmentos de DNA, de

proteínas e segmentos de RNA e entre proteínas.

Não consideraremos todos esses omas nesta seção, mas enfocaremos algumas das técnicas globais que estão começando a ser exploradas para obter esses conjuntos de dados.

Utilização de microarranjos de DNA para estudar o transcriptoma. Suponha que desejamos responder à questão: que genes são ativos em uma célula em particular sob determinadas condições? Essas condições podem ser um ou mais estágios no desenvolvimento ou podem ser a presença ou a ausência de um patógeno ou de um hormônio. Os genes ativos são transcritos em RNA e, assim, o conjunto de transcritos de RNA presentes na célula pode nos informar quais genes estão ativos. Aqui é onde a nova tecnologia de chips de DNA utilizada para analisar transcritos de DNA é tão poderosa.

Os chips de DNA são amostras de DNA dispostas como uma série de

manchas microscópicas ligadas a um “chip” de vidro do tamanho de uma lamínula de microscópio. O conjunto de DNA assim demonstrado é denominado microarranjo. Um tipo de microarranjo típico contém oligonucleotídios sintéticos curtos que representam a maior parte dos genes,

ou todos, em um genoma (Figura 14.20). Os microarranjos de DNA têm enriquecido a genética molecular ao possibilitar a análise de transcritos de RNA para todos os genes simultaneamente em um único experimento. Vejamos como atua esse processo em mais detalhes.

FIGURA 14.20 As principais etapas em uma análise com microarranjo são (1) extração do mRNA de células ou tecidos, (2) síntese de sondas de cDNA marcadas com corante fluorescente, (3) hibridização com o microarranjo, (4) detecção do sinal fluorescente de sondas hibridizadas e (5) análise da imagem para identificar os níveis relativos da sonda hibridizada. Os níveis relativos revelam os genes cuja expressão está aumentada ou diminuída sob as condições analisadas.

Os microarranjos são expostos a sondas de cDNA — por exemplo, um

conjunto de sondas utilizadas como controle e um conjunto de sondas representando uma condição específica. O conjunto utilizado como um controle pode ser produzido a partir do conjunto total de moléculas de RNA extraídas de um tipo celular em particular cultivado sob condições típicas. O segundo conjunto de sondas pode ser produzido a partir do RNA extraído de células cultivadas em alguma condição experimental. Marcações fluorescentes são ligadas às sondas e as sondas são hibridizadas com o microarranjo. A ligação relativa das moléculas da sonda com o microarranjo é automaticamente monitorada com a utilização de um microscópio iluminado com feixe de laser. Desse modo, são identificados os genes cujos níveis de expressão estão aumentados ou diminuídos sob a determinada condição experimental. De modo semelhante, os genes que estão ativos em um determinado tipo celular ou em um determinado estágio do desenvolvimento podem ser identificados.

Com a compreensão sobre quais genes estão ativos ou inativos em um

determinado estágio do desenvolvimento, em um tipo celular em particular ou em diversas condições ambientais, os conjuntos de genes que podem responder a sinais reguladores semelhantes podem ser identificados. Além disso, os perfis de expressão gênica podem pintar um quadro das diferenças entre as células normais e doentes. Ao identificar os genes cuja expressão é alterada por mutações, em células cancerosas ou por um patógeno, os pesquisadores podem planejar novas estratégias terapêuticas.

Utilização do teste di-híbrido para estudar o interatoma proteína-proteína. Uma das atividades mais importantes das proteínas é sua interação com outras proteínas. Em virtude do grande número de proteínas em qualquer célula, biólogos buscam modos para estudar sistematicamente todas as interações de proteínas individuais em uma célula. Um dos modos mais comuns de estudar o interatoma utiliza um sistema criado em células de levedura denominado teste di-híbrido, que detecta interações físicas entre duas proteínas. A base do teste é o ativador transcricional codificado pelo

gene GAL4 de levedura (ver Capítulo 12).

Lembre que essa proteína apresenta dois domínios: (1) um domínio de

ligação ao DNA que se liga ao sítio de início de transcrição e (2) um domínio de ativação que ativará a transcrição, mas que por si próprio não consegue se ligar ao DNA. Portanto, os dois domínios devem estar próximos para que ocorra a ativação da transcrição. Suponha que você está investigando se duas proteínas interagem. A estratégia do sistema di-híbrido é separar os dois domínios do ativador codificado por GAL4, tornando a ativação de um gene repórter impossível. Cada domínio é conectado a uma proteína diferente. Se as duas proteínas interagem, elas unirão os dois domínios. O ativador se tornará ativo e iniciará a transcrição do gene repórter.

Como esse esquema é implementado na prática? O gene GAL4 é dividido

entre dois plasmídios, de modo que um plasmídio contém a parte que codifica o domínio de ligação ao DNA e o outro plasmídio contém a parte que codifica o domínio de ativação. Em um plasmídio, um gene para uma proteína em investigação é recomposto próximo ao domínio de ligação ao DNA e essa proteína de fusão atua como uma “isca”. No outro plasmídio, um gene para outra proteína em investigação é recomposto próximo ao

domínio de ativação e diz-se que essa proteína de fusão é o “alvo” (Figura

14.21). Os dois plasmídios híbridos em seguida são introduzidos na mesma célula de levedura — talvez por meio do cruzamento de células haploides que contêm a isca e os plasmídios-alvo. A etapa final é procurar pela ativação da transcrição por um construto de gene repórter regulado por GAL4, que seria a comprovação de que aquela isca e o alvo ligaram-se. O sistema di-híbrido pode ser automatizado para possibilitar a busca por interações proteicas em todo o proteoma.

Estudo do interatoma proteína-DNA com a utilização de análise de imunoprecipitação de cromatina (ChIP). A ligação sequência-específica de proteínas ao DNA é crítica para a expressão gênica correta. Por exemplo, proteínas reguladoras se ligam a promotores e ativam ou reprimem a

transcrição tanto em bactérias quanto em eucariotos (ver Capítulos 11, 12 e

13). No caso dos eucariotos, os cromossomos estão organizados em cromatina, na qual a unidade fundamental, o nucleossomo, contém DNA enrolado ao redor de histonas. A modificação pós-tradução das histonas

com frequência dita quais proteínas se ligam e onde (ver Capítulo 12). Foi desenvolvida uma diversidade de tecnologias que possibilitam que os pesquisadores isolem regiões específicas da cromatina, de modo que o DNA e suas proteínas correlatas possam ser analisados em conjunto. O método mais amplamente utilizado é denominado ChIP (em referência a imunoprecipitação da cromatina) e a sua aplicação está descrita a seguir

(Figura 14.22).

FIGURA 14.21 O sistema utiliza a ligação de duas proteínas, uma proteína “isca” e uma proteína “alvo”, para restaurar a função da proteína Gal4, que ativa um gene repórter. Cam, Trp e Leu são componentes dos sistemas de seleção para a movimentação dos plasmídios entre as células. O gene repórter é lacZ, que está localizado em um cromossomo de levedura (em azul).

Digamos que você isolou um gene de levedura e suspeita que ele

codifique uma proteína que se liga ao DNA quando a levedura é cultivada em alta temperatura. Você deseja saber se essa proteína se liga ao DNA e, caso afirmativo, a qual sequência na levedura. Um modo de abordar essa questão é primeiramente tratar as células de levedura que foram cultivadas em alta temperatura com uma substância química que realizará a ligação cruzada das proteínas com o DNA. Desse modo, as proteínas ligadas ao DNA na ocasião do isolamento da cromatina permanecerão ligadas durante os tratamentos subsequentes. A próxima etapa é quebrar a cromatina em pequenos pedaços. Para separar o fragmento que contém seu complexo proteína-DNA de outros, você utiliza um anticorpo que reage especificamente com a proteína codificada. Você adiciona seu anticorpo à mistura, de modo a formar um complexo imune que pode ser purificado. O DNA ligado ao complexo imune pode ser analisado após a reversão da ligação cruzada. O DNA ligado à proteína pode ser sequenciado diretamente ou amplificado em muitas cópias por meio de PCR para preparar para o sequenciamento do DNA.