Introdução à Genética
Reparo por excisão de base
FIGURA 16.19 A enzima CPD fotoliase divide um fotodímero de pirimidina ciclobutano para reparar esta mutação.
Reparo por excisão de base
Um princípio abrangente que orienta os sistemas genéticos celulares é o poder da complementaridade da sequência de nucleotídios. (Lembre que a análise genética também depende fortemente desse princípio.) Sistemas de reparo importantes exploram as propriedades da complementaridade antiparalela para restaurar os segmentos de DNA danificados até o seu estado não danificado inicial. Nesses sistemas, uma base ou um segmento mais longo de uma cadeia de DNA é removido e substituído por um segmento de nucleotídios recém-sintetizado complementar ao filamento-molde oposto. Contrariamente aos exemplos de reversão de danos descritos na seção precedente, essas vias incluem a remoção e a substituição de uma ou mais bases.
O primeiro sistema de reparo desse tipo que examinaremos é o reparo por
excisão de base. Após a revisão do DNA pela DNA polimerase, o reparo por excisão de base é o mecanismo mais importante utilizado para remover bases incorretas ou danificadas. O principal alvo do reparo por excisão de base é o dano não volumoso a bases. Esse tipo de dano pode resultar da diversidade de causas mencionadas nas seções precedentes, incluindo metilação, desaminação, oxidação ou perda espontânea de uma base do DNA. O reparo por excisão de
base (Figura 16.20) é realizado por DNA glicosilases que clivam as ligações base-açúcar, liberando, assim, as bases alteradas e gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (AP). Uma enzima denominada endonuclease AP em seguida corta o filamento danificado upstream do sítio AP. Uma terceira enzima, desoxirribofosfodiesterase, limpa o arcabouço ao remover um trecho de resíduos açúcar-fosfato vizinhos, de modo que uma DNA polimerase possa preencher o intervalo com nucleotídios complementares ao outro filamento. A
DNA ligase em seguida sela o novo nucleotídio no arcabouço (ver Figura
16.20).
Existem diversas DNA glicosilases. Uma, a uracila-DNA glicosilase, remove
a uracila do DNA. As unidades de uracila, que resultam da desaminação espontânea da citosina (ver anteriormente), podem levar a uma transição de C para T, se não forem reparadas. Uma vantagem de ter timina (5-metiluracila) em vez da uracila como parceira natural de pareamento da adenina no DNA é que os eventos de desaminação espontânea da citosina podem ser reconhecidos como anormais e em seguida podem ser excisados e reparados. Se a uracila fosse um constituinte normal do DNA, tal reparo não seria possível.
Entretanto, a desaminação impõe outros problemas para as bactérias e os
eucariotos. Ao analisar um grande número de mutações no gene lacI, Jeffrey Miller identificou locais no gene nos quais uma ou mais bases estavam propensas a mutações frequentes. Miller observou que esses assim denominados pontos quentes (hotspots) mutacionais correspondiam a desaminações em determinados resíduos de citosina. A análise da sequência de DNA de hotspots de transição G · C → T · A no gene lacI demonstrou que resíduos de 5-
metilcitosina estão presentes em cada hotspot. Relembre do Capítulo 12 que o DNA eucariótico pode ser metilado para inativar genes. De modo semelhante, E. coli e outras bactérias também metilam o seu DNA, embora para diferentes finalidades. Alguns dos dados desse estudo de lacI estão demonstrados na
Figura 16.21. A altura de cada barra no gráfico representa a frequência de mutações em cada sítio. Pode-se observar que as posições dos resíduos de 5-metilcitosina estão bem-correlacionadas com os sítios mais mutáveis.
FIGURA 16.20 No reparo por excisão de base, as bases danificadas são removidas e reparadas por meio da ação sequencial de uma DNA glicosilase, uma endonuclease AP, uma desoxirribofosfodiesterase (dRpase), uma DNA polimerase e uma ligase.
Por que as 5-metilcitosinas são hotspots para mutações? A desaminação da 5-
metilcitosina gera timina (5-metiluracila):
FIGURA 16.21 Hotspots de metilcitosina em E. coli. Mutações sem sentido em 15 sítios diferentes em lacI foram registradas. Todas resultaram em transições G · C → A · T. O asterisco (*) marca as posições das 5-metilcitosinas e as barras brancas marcam os sítios nos quais transições sabidamente ocorridas não foram isoladas nesse grupo. (Dados de C. Coulondre, J. H. Miller, P. J. Farabaugh e W. Gilbert, “Molecular Basis of Base Substitution Hotspots in Escherichia coli”, Nature 274, 1978, 775.)
A timina não é reconhecida pela enzima uracila-DNA glicosilase e, assim, não é reparada. Portanto, as transições C → T geradas pela desaminação são observadas mais frequentemente nos sítios de 5-metilcitosina em virtude de escaparem a esse sistema de reparo. Uma consequência da frequente mutação da 5-metilcitosina em timina é que as regiões metiladas do genoma (que
normalmente são transcricionalmente inativas; ver Capítulo 12) são convertidas, ao longo do tempo evolutivo, em regiões ricas em AT. Contrariamente, as regiões codificadoras e reguladoras, que são menos metiladas, permanecem ricas em GC.