Introdução à Genética
Guia Resumido de Organismos-modelo
Escherichia coli • Saccharomyces cerevisiae • Neurospora crassa • Arabidopsis thaliana • Caenorhabditis elegans • Drosophila melanogaster • Mus musculus
E ste guia resumido reúne em um local as principais características dos organismos-modelo relacionados à genética. Cada um dos sete organismos-modelo recebe sua própria extensão de duas páginas; o formato é consistente, possibilitando que os leitores comparem e contrastem as características dos organismos-modelo. Cada tratamento enfoca características especiais do organismo que o tornaram útil como um modelo; as técnicas especiais que foram desenvolvidas para o estudo do organismo; e as principais contribuições que os estudos do organismo realizaram para a nossa compreensão sobre a genética. Embora muitas diferenças estejam aparentes, as abordagens das análises de genética em geral são semelhantes, mas precisam ser adaptadas para levar em consideração o ciclo de vida individual, o nível de ploidia, tamanho e formato, e as propriedades genômicas, tais como a presença de plasmídios e transpósons naturais.
Os organismos-modelo sempre estiveram na vanguarda da genética.
Inicialmente, no desenvolvimento histórico de um organismo-modelo, um pesquisador seleciona o organismo em virtude de alguma característica que o torna particularmente apropriado para o estudo de um processo genético no qual o pesquisador está interessado. O conselho dos últimos cem anos foi: “escolha bem o seu organismo.” Por exemplo, os fungos ascomicetos, tais como Saccharomyces cerevisiae e Neurospora crassa, são muito apropriados para o estudo dos processos meióticos, tais como o crossing over, em virtude de sua característica única, o asco, manter unidos os produtos de uma única meiose.
Diferentes espécies tendem a demonstrar processos notavelmente
semelhantes, até mesmo entre os membros de grandes grupos, tais como os eucariotos. Portanto, podemos esperar razoavelmente que o que se aprende em uma espécie pode ser, no mínimo parcialmente, aplicado para outras. Em particular, os geneticistas mantêm os olhos abertos para novos achados de pesquisas que possam ser aplicáveis para a nossa própria espécie. Em comparação a outras espécies, os seres humanos são relativamente difíceis de estudar no nível genético e, assim, os avanços na genética humana devem muito a mais de um século de trabalhos com os organismos-modelo.
Todos os organismos-modelo apresentam muito mais do que uma
característica útil para os estudos genéticos e outros estudos biológicos. Portanto, após um organismo-modelo ter sido desenvolvido por algumas poucas pessoas com interesses específicos, ele em seguida atua como um núcleo para o desenvolvimento de uma comunidade de pesquisas – um grupo de pesquisadores com um interesse em diversas características de um organismo-modelo em particular. Existem comunidades de pesquisas organizadas para todos os organismos-modelo mencionados neste resumo. Seus integrantes estão regularmente em contato, compartilham suas linhagens mutantes e encontram-se no mínimo uma vez ao ano em conferências que podem atrair milhares de pessoas. Tais comunidades tornam possível a prestação de serviços importantes, como bases de dados de informações de pesquisas, técnicas, estoques genéticos, clones, bibliotecas de DNA e sequências genômicas.
Outra vantagem que pertencer a uma comunidade proporciona a um
pesquisador é poder desenvolver uma “percepção do organismo” (expressão da geneticista de milho vencedora de um Prêmio Nobel, Barbara McClintock). Essa ideia é difícil de transmitir, mas implica uma compreensão dos modos gerais de um organismo. Nenhum processo vivo ocorre isolado e, assim, conhecer os modos gerais de um organismo com frequência é benéfico para tentar compreender um processo e interpretá-lo em seu contexto adequado.
À medida que a base de dados em relação a cada organismo-modelo se
expande (o que atualmente está ocorrendo a passos largos em virtude da genômica), os geneticistas são cada vez mais capazes de adotar uma visão holística, englobando o funcionamento integrado de todas as partes da constituição do organismo. Desse modo, os organismos-modelo se tornam não apenas modelos para processos isolados, mas também modelos de processos biológicos integrados. Usa-se a expressão biologia de sistemas para descrever essa abordagem holística.
Escherichia coli
Organismo-chave para estudar:
• Transcrição, tradução, replicação, recombinação
• Mutação
• Regulação gênica
• Tecnologia do DNA recombinante.
“Estatística vital” genética
Tamanho do genoma: 4,6 Mb
Cromossomos: 1, circular
Número de genes: 4.000
Porcentagem com homólogos humanos: 8%
Tamanho médio dos genes: 1 kb, nenhum íntron
Transpósons: Linhagem-especí cos, aproximadamente
60 cópias por genoma
Genoma sequenciado em: 1997
A bactéria unicelular Escherichia coli é amplamente conhecida como patógeno causador de doenças, fonte de intoxicação alimentar e de doenças intestinais. Entretanto, sua reputação negativa não é merecida. Embora algumas linhagens de E. coli sejam prejudiciais, outras são residentes naturais e essenciais do intestino humano. Como organismos-modelo, as linhagens de E. coli desempenham um papel indispensável nas análises genéticas. Na década de 1940, diversos grupos começaram a investigar a genética de E. coli. Havia necessidade de um organismo simples, que pudesse ser cultivado de modo não dispendioso para produzir grandes quantidades de bactérias individuais, para que fosse possível encontrar e analisar eventos genéticos raros. Tendo em vista que E. coli pode ser obtida a partir do intestino humano e é pequena e fácil de cultivar, ela foi uma escolha natural. O trabalho com E. coli definiu o início da revelação da “caixa preta” na genética: por meio da seleção e da análise de mutantes, o funcionamento dos processos celulares pôde ser deduzido, ainda que uma célula individual fosse muito pequena para ser visualizada.
Genoma de E.coli. Micrografia eletrônica do genoma da bactéria E. coli, liberado da célula por meio de choque osmótico. (G. Murti/Science Source.)
Características especiais
Uma grande parte do sucesso da E. coli como organismo-modelo pode ser atribuída a duas estatísticas: seu tamanho celular de 1 μm e um tempo de geração de 20 minutos. (A replicação do cromossomo demora 40 minutos, mas múltiplas forquilhas de replicação possibilitam que a célula se divida em 20 minutos.) Consequentemente, esse procarioto pode crescer em números surpreendentes – uma característica que possibilita que os geneticistas identifiquem mutações e outros eventos genéticos raros, tais como recombinantes intragênicos. A E. coli também é notavelmente fácil de cultivar. Quando as células são semeadas em placas de meio com nutriente, cada célula se divide in situ e forma uma colônia visível. Alternativamente, grupos de células podem ser cultivados em cultura líquida sob agitação. Fenótipos tais como o tamanho da colônia, a resistência a fármacos, a capacidade de obter energia a partir de fontes de carbono em particular e a produção de corante colorido assumem o lugar dos fenótipos morfológicos da genética de eucariotos.
Colônias bacterianas. (Biophoto Associates/Science Source.)
Ciclo de vida
A Escherichia coli se reproduz assexuadamente por meio da ssão celular simples; seu genoma
haploide se replica e se divide com a célula em divisão. Na década de 1940, Joshua Lederberg e
Edward Tatum descobriram que E. coli também apresenta um tipo de ciclo sexuado, no qual
células de “sexos” geneticamente diferenciados se fundem e trocam seus genomas, de forma
parcial ou total, por vezes levando à recombinação (ver Capítulo 5). “Machos” conseguem
converter “fêmeas” em machos por meio da transmissão de um plasmídio em particular. Esse
plasmídio de DNA de 100 kb extragenômico circular, denominado F, determina um tipo de
“masculinidade”. As células F+ que atuam como “doadores” machos transmitem uma cópia do
plasmídio F para uma célula receptora. O plasmídio F consegue se integrar no cromossomo para
formar um tipo de célula Hfr, que transmite o cromossomo linearmente para receptores F–. Outros
plasmídios são observados em E. coli na natureza. Alguns carreiam genes cujas funções equipam
a célula para a vida em ambientes especí cos; os plasmídios R que carreiam genes de resistência
a fármacos são exemplos.
Duração do ciclo de vida: 20 minutos.
Geneticistas também têm se beneficiado de alguns elementos genéticos
únicos associados à E. coli. Plasmídios e fagos bacterianos são utilizados como vetores para clonar os genes de outros organismos em E. coli. Os elementos de transposição de E. coli são usados para romper genes em DNA eucariótico clonado. Esses elementos bacterianos são fundamentais na tecnologia do DNA recombinante.
Análise genética
Mutantes espontâneos de E. coli demonstram uma diversidade de alterações no DNA, que variam desde simples substituições de bases até a inserção de elementos de transposição. O estudo de mutações espontâneas raras na E. coli é possível, uma vez que grandes populações podem ser triadas. Entretanto, mutágenos também são utilizados para aumentar as frequências de mutação.
Para a obtenção de fenótipos mutantes específicos que possam
representar defeitos em um processo sob estudo, devem ser planejadas triagens ou seleções. Por exemplo, mutações nutricionais e mutações que conferem resistência a fármacos ou fagos podem ser obtidas em placas suplementadas com substâncias químicas, fármacos ou fagos específicos. Mutações nulas de qualquer gene essencial resultarão em ausência de crescimento; essas mutações podem ser selecionadas por meio da adição de penicilina (um fármaco antibacteriano isolado a partir de um fungo), que mata as células em divisão, mas não os mutantes que não crescem. Em relação às mutações letais condicionais, pode ser utilizado o plaqueamento réplica: colônias que sofreram mutação em uma placa máster são transferidas por meio de uma almofada de feltro para outras placas e, em seguida, são submetidas a algum ambiente tóxico. As mutações que afetam a expressão de um gene de interesse específico podem ser triadas por meio de sua fusão com um gene repórter, tal como o lacZ, cujo produto proteico pode produzir um corante azul, ou o gene GFP, cujo produto fluoresce quando exposto à luz de um comprimento de onda em particular.
Após um conjunto de mutantes que afetam o processo de interesse ter
sido obtido, as mutações são distribuídas em seus genes por meio de recombinação e complementação. Esses genes são clonados e sequenciados para a obtenção de indicações da função. A mutagênese direcionada pode ser utilizada para adequar alterações induzidas por mutação a posições
proteicas específicas (ver Capítulo 14).
Em E. coli, são utilizados cruzamentos para mapear mutações e produzir
genótipos celulares específicos (ver Capítulo 5). Os recombinantes são produzidos por meio da mistura de células Hfr (que apresentam um plasmídio F integrado) e de células F–. Em geral, um doador Hfr transmite parte do genoma bacteriano, formando um merozigoto temporário, no qual ocorre recombinação. Cruzamentos de Hfr podem ser utilizados para realizar o mapeamento de acordo com o tempo de entrada de marcador ou por meio da frequência de recombinantes. Por meio da transferência de derivados F′ que carreiam genes doadores para F–, é possível produzir diploides parciais estáveis para estudar a interação gênica ou dominância.
Técnicas de modi cação genética
Mutagênese-padrão:
Substâncias químicas e radiação Mutações somáticas aleatórias
Transpósons Inserções somáticas aleatórias
Transgênese:
No plasmídio vetor Livre ou integrado
No fago vetor Livre ou integrado
Transformação Integrada
Nocautes gênicos direcionados:
Alelo nulo no vetor Substituição gênica por recombinação
Alelo modi cado no vetor Mutagênese sítio-dirigida por substituição
gênica
Engenharia genética
Transgênese. A E. coli desempenha um papel-chave na introdução de
transgenes em outros organismos (ver Capítulo 10). Ela é o organismopadrão utilizado para a clonagem de genes de qualquer organismo. Os plasmídios ou bacteriófagos de E. coli são utilizados como vetores, que carreiam a sequência de DNA a ser clonada. Esses vetores são introduzidos em uma célula bacteriana por meio de transformação, se for um plasmídio, ou por meio de transdução, se for um fago, dentro de cujo citoplasma eles se replicam. Os vetores são especialmente modificados para incluir sítios de clonagem únicos, que podem ser cortados por meio de uma diversidade de enzimas de restrição. Outros vetores “de transporte” são projetados para mover fragmentos de DNA de levedura (“a E. coli eucariótica”) para E. coli, em virtude da sua facilidade de manipulação genética, e, em seguida, de volta à levedura para avaliação fenotípica.
Um plasmídio projetado como um vetor para a clonagem de DNA. A inserção bem-sucedida de um gene exógeno no plasmídio é detectada por meio da inativação de qualquer gene de resistência a fármacos ( R R tet ou amp). Os sítios de restrição estão identificados.
Nocautes gênicos direcionados. Um conjunto completo de nocautes gênicos está sendo acumulado. Em um procedimento, um transpóson de resistência à canamicina é introduzido em um gene clonado in vitro (por meio da utilização de uma transposase). O construto é transformado nele, sendo as colônias resistentes nocautes produzidos por meio de recombinação homóloga.
Contribuições principais
Estudos pioneiros em relação à genética como um todo foram realizados em E. coli. Talvez o maior triunfo tenha sido a elucidação do código genético universal de 64 códons, mas essa conquista está muito longe de ser a única na lista de realizações atribuíveis a esse organismo. Outros fundamentos da genética que foram demonstrados pela primeira vez em E. coli incluem a
natureza espontânea da mutação (o teste de flutuação, Capítulo 16), os diversos tipos de alterações de bases que causam mutações e a replicação
semiconservativa do DNA (o experimento de Meselson e Stahl, Capítulo 7). Essa bactéria ajudou a abrir novas áreas da genética, tais como a regulação
gênica (o óperon lac, Capítulo 11) e a transposição do DNA (elementos IS,
Capítulo 15). Por último, mas não menos importante, a tecnologia do DNA recombinante foi inventada em E. coli e atualmente o organismo ainda desempenha um papel central nessa tecnologia.
Outras áreas de contribuição
• Metabolismo celular
• Supressores sem sentido
• Colinearidade de gene e polipeptídio • Óperon
• Resistência a fármacos baseada em plasmídios • Transporte ativo.
Saccharomyces cerevisiae
Organismo-chave para estudar:
• Genômica
• Biologia de sistemas
• Controle genético do ciclo celular
• Transdução de sinal
• Recombinação
• Tipo reprodutivo
• Herança mitocondrial
• Interação gênica; di-híbrido.
“Estatística vital” genética
Tamanho do genoma: 12 Mb
Cromossomos: n = 16
Número de genes: 6.000
Porcentagem com homólogos humanos: 25%
Tamanho médio dos genes: 1,5 kb, 0,03 íntron/gene
Transpósons: Pequena proporção do DNA
Genoma sequenciado em: 1996
O ascomiceto S. cerevisiae, conhecido como “levedura do pão”, “broto de levedura” ou simplesmente “levedura”, tem sido a base das indústrias panificadora e cervejeira desde a Antiguidade. Na natureza, provavelmente cresce sobre as superfícies das plantas, utilizando exsudatos como nutrientes, embora o seu nicho preciso ainda seja um mistério. Embora as linhagens de laboratório sejam principalmente haploides, as células na natureza podem ser diploides ou poliploides. Em aproximadamente 70 anos de pesquisas genéticas, a levedura se tornou “E. coli dos eucariotos”. Tendo em vista que ela é haploide e unicelular, e que forma colônias compactas em placas, ela pode ser tratada em grande parte do mesmo modo que uma bactéria. Entretanto, ela apresenta meiose, ciclo celular e mitocôndrias eucarióticas, características centrais da história de sucesso da levedura.
Células de levedura, Saccharomyces cerevisiae. (SciMAT/Science Source.)
Características especiais
Como um organismo-modelo, a levedura combina o melhor de dois mundos: ela apresenta uma grande parte da conveniência de uma bactéria, mas com as características-chave de um eucarioto. As células de levedura são pequenas (10 μm) e completam seu ciclo celular em apenas 90 minutos, o que possibilita que enormes quantidades sejam produzidas em um curto período. Assim como as bactérias, a levedura pode ser cultivada em grandes grupos em um meio líquido agitado continuamente. E, assim como as bactérias, a levedura produz colônias visíveis quando semeada em meio com ágar, pode ser triada em relação a mutações e plaqueada em réplica. De maneira eucariótica típica, a levedura apresenta um ciclo de divisão celular mitótica, sofre meiose e contém mitocôndrias que hospedam um pequeno genoma único. As células de levedura podem realizar respiração anaeróbica ao utilizar o ciclo de fermentação e, portanto, sem as mitocôndrias, o que possibilita que os mutantes mitocondriais sejam viáveis.
Análise genética
A realização de cruzamentos em levedura é consideravelmente direta. Linhagens de tipo reprodutivo oposto são simplesmente misturadas em um meio apropriado. Os diploides a/α resultantes são induzidos a sofrer meiose mediante a utilização de um meio de esporulação especial. Os investigadores podem isolar os ascósporos de uma tétrade única ao utilizar uma máquina denominada micromanipulador. Eles também têm a opção de sintetizar diploides a/a ou α/α para finalidades especiais ou criar diploides parciais por meio da utilização de plasmídios especialmente modificados.
Tendo em vista que está disponível uma enorme variedade de mutantes
de leveduras e construtos de DNA na comunidade científica, linhagens para finalidades especiais de triagens e seleções podem ser produzidas por meio do cruzamento de diversos tipos de leveduras. Além disso, novos alelos mutantes podem ser mapeados por meio do cruzamento com linhagens que contêm uma diversidade de marcadores fenotípicos ou de DNA de posição conhecida no mapa.
A disponibilidade de células haploides e diploides proporciona
flexibilidade para os estudos mutacionais. As células haploides são convenientes para as seleções ou triagens em grande escala, tendo em vista que os fenótipos mutantes são expressos diretamente. As células diploides são convenientes para obter mutações dominantes, abrigar mutações letais, realizar testes de complementação e explorar interações gênicas.
Ciclo de vida
A levedura é uma espécie unicelular com um ciclo de vida muito simples, composto pelas fases
sexuada e assexuada. A fase assexuada pode ser haploide ou diploide. Uma célula se divide
assexuadamente por meio de brotamento: uma célula-mãe emite um broto, para o qual é
transmitido um dos núcleos que resulta da mitose. Para a reprodução sexuada, existem dois tipos
reprodutivos, determinados pelos alelos MATα e MATa. Quando células haploides de diferentes
tipos reprodutivos se unem, elas formam uma célula diploide, que pode se dividir mitoticamente
ou sofrer divisão meiótica. O produto da meiose é uma tétrade não linear de quatro ascósporos.
Duração total do ciclo de vida: 90 minutos para completar o ciclo celular.
Técnicas de manipulação genética
Mutagênese-padrão:
Substâncias químicas e radiação Mutações somáticas aleatórias
Transpósons Inserções somáticas aleatórias
Transgênese:
Plasmídio integrativo Inserções por recombinação homóloga
Plasmídio replicativo Pode se replicar de modo autônomo
(origem de replicação 2μ ou ARS)
Cromossomo arti cial de levedura Replica e segrega como um cromossomo
Vetor de transporte Pode replicar em levedura ou E. coli
Nocautes gênicos direcionados:
Substituição de gene A recombinação homóloga substitui o
alelo do tipo selvagem por uma cópia nula
Engenharia genética
Transgênese. A levedura em brotamento proporciona mais oportunidades
para a manipulação genética do que qualquer outro eucarioto (ver Capítulo
10). O DNA exógeno é facilmente captado pelas células cujas paredes celulares foram parcialmente removidas por meio de digestão enzimática ou abrasão. Estão disponíveis diversos tipos de vetores. Para que um plasmídio se replique livre dos cromossomos, ele deve conter uma origem normal de replicação em levedura (ARS) ou uma origem de replicação de um plasmídio de 2 μm encontrado em determinados isolados de levedura. O vetor mais elaborado, o cromossomo artificial de levedura (YAC), é composto por um ARS, um centrômero de levedura e dois telômeros. Um YAC pode carrear grandes insertos transgênicos, que em seguida são herdados do mesmo modo que os cromossomos mendelianos. Os YAC têm sido vetores importantes na clonagem e no sequenciamento de genomas grandes, tais como o genoma humano.
Um vetor de levedura simples. Este tipo de vetor é denominado plasmídio integrativo de levedura (YIp).
Nocautes direcionados. A mutagênese de transpóson (marcação de transpóson) pode ser alcançada por meio da introdução do DNA de levedura em E. coli em um vetor de transporte; os transpósons bacterianos são integrados ao DNA da levedura, provocando nocaute (inativação) da função gênica. O vetor de transporte em seguida é transferido de volta para a levedura e os mutantes marcados substituem as cópias do tipo selvagem por meio de recombinação homóloga. Os nocautes gênicos também podem ser conquistados por meio da substituição dos alelos do tipo selvagem por uma cópia nula modificada, por meio de recombinação homóloga. Ao utilizar essas técnicas, pesquisadores construíram sistematicamente um conjunto completo de linhagens nocauteadas de levedura (cada uma carreando um nocaute diferente) para avaliar a função nula de cada gene no nível fenotípico.
Mutantes de ciclo celular. A. Mutantes que se alongam sem se dividir. B. Mutantes que param sem brotamento. (Cortesia de Susan L. Forsburg, the Salk Institute. “The Art and Design of Genetic Screens: Yeast”, Nature Reviews: Genetics 2, 2001, 659-668.)
Contribuições principais
Graças a uma combinação de genética adequada e bioquímica adequada, estudos em leveduras realizaram contribuições substanciais para a nossa compreensão sobre o controle genético dos processos celulares.
Ciclo celular. A identificação de genes de divisão celular por meio de seus mutantes sensíveis à temperatura (mutantes cdc) levou a um modelo poderoso para o controle genético da divisão celular. Os diferentes fenótipos Cdc revelam os componentes do maquinário necessário para a execução de etapas específicas na progressão do ciclo celular. Esse trabalho tem sido útil para a compreensão sobre os controles da divisão celular anormal que podem levar ao câncer humano.
Recombinação. Muitas das ideias-chave em relação aos atuais modelos moleculares de crossing over (tais como o modelo de quebra bifilamentar) têm por base a análise de tétrades da conversão gênica em leveduras (ver
Capítulo 4). A conversão gênica (proporções alélicas aberrantes, tais como 3:1) é consideravelmente comum nos genes de levedura, proporcionando um conjunto de dados adequadamente grande para a quantificação das características-chave desse processo.
Interações gênicas. A levedura liderou o caminho no estudo das interações gênicas. As técnicas da genética tradicional têm sido utilizadas para revelar padrões de epistasia e supressão, que sugerem interações gênicas (ver
Capítulo 6). O sistema de plasmídio di-híbrido para a observação das interações proteicas foi desenvolvido em levedura e gerou mapas de interação complexos, que representam o início da biologia de sistemas (ver
Capítulo 14). Letais sintéticos–mutantes duplos letais criados por meio do intercruzamento de dois mutantes únicos viáveis também são utilizados
para criar redes de interação (ver Capítulo 6).
Genética mitocondrial. Mutantes com mitocôndrias defeituosas são reconhecíveis como colônias muito pequenas, denominadas “petites”. A disponibilidade dessas petites e de outros mutantes mitocondriais possibilitou a primeira análise detalhada da estrutura e da função do genoma mitocondrial em qualquer organismo.
Genética do tipo reprodutivo. Os alelos MAT de leveduras foram os primeiros genes de tipos reprodutivos a ser caracterizados no nível molecular. Curiosamente, a levedura é submetida à alteração espontânea de um tipo reprodutivo para outro. Uma cópia “sobressalente” silenciosa do alelo MAT oposto, localizada em algum outro local no genoma, entra no locus do tipo reprodutivo, substituindo o alelo residente por meio de recombinação homóloga. A levedura proporcionou um dos modelos centrais para a transdução de sinais durante a detecção e a resposta aos hormônios reprodutivos do tipo reprodutivo oposto.
Outras áreas de contribuição
• Genética da alteração entre o crescimento semelhante à levedura e o
filamentoso
• Genética da senescência.
Neurospora crassa
Organismo-chave para estudar:
• Genética do metabolismo e da captação
• Genética do crossing over e da meiose
• Citogenética de fungos
• Crescimento polar
• Ritmos circadianos
• Interações do núcleo com as mitocôndrias.
“Estatística vital” genética
Tamanho do genoma: 43 Mb
Cromossomos: 7 autossomos (n = 7)
Número de genes: 10.000
Porcentagem com homólogos humanos: 6%
Tamanho médio dos genes: 1,7 kb, 1,7 íntron/gene
Transpósons: Raros
Genoma sequenciado em: 2003
O Neurospora crassa, fungo alaranjado do pão, foi um dos primeiros microrganismos eucarióticos a ser adotado pelos geneticistas como um organismo-modelo. Assim como a levedura, originalmente ele foi escolhido em virtude de sua haploidia, de seu ciclo de vida simples e rápido, e da facilidade com a qual ele pode ser cultivado. Particularmente significativo foi o fato de que ele cresce em um meio com um conjunto definido de nutrientes, tornando possível estudar o controle genético da química celular. Na natureza, ele é observado em muitas partes do mundo, crescendo sobre a vegetação morta. Em virtude da ativação dos seus ascósporos quiescentes pelo fogo, ele é mais facilmente coletado após queimadas – por exemplo, sob a casca de árvores queimadas e em campos de cultivos tais como os de cana-de-açúcar, que são queimados de modo rotineiro antes da coleta.
Neurospora crassa crescendo em cana-de-açúcar. (Cortesia de David Jacobson.)
Características especiais
Neurospora detém o recorde de velocidade dos fungos, tendo em vista que cada hifa cresce mais de 10 cm ao dia. Esse rápido crescimento, combinado com o seu ciclo de vida haploide e a capacidade de crescer em meio definido, tornou-o um organismo de escolha para o estudo da genética bioquímica da nutrição e da captação de nutrientes.
Outra característica única de Neurospora (e de fungos relacionados)
possibilita que geneticistas tracem as etapas de meioses únicas. Os quatro produtos haploides de uma meiose permanecem unidos em um saco, denominado asco. Cada um dos quatro produtos da meiose sofre a uma divisão mitótica adicional, resultando em uma óctade linear de oito
ascósporos (ver Capítulo 3). Essa característica torna o Neurospora um sistema ideal para o estudo de crossing over, conversão gênica, rearranjos cromossômicos, ausência de disjunção meiótica e controle genético da própria meiose. Os cromossomos, embora pequenos, são facilmente visíveis e, assim, os processos meióticos podem ser estudados nos níveis genético e cromossômico. Portanto, em Neurospora, foram realizados estudos fundamentais sobre os mecanismos subjacentes a esses processos (ver
Capítulo 4).
Análise genética
A análise genética é direta (ver Capítulo 3). Centros que mantêm estoques fornecem uma ampla diversidade de mutantes que afetam todos os aspectos da biologia do fungo. Os genes de Neurospora podem ser facilmente mapeados por meio de seu cruzamento com um banco de linhagens com loci mutantes ou alelos de RFLP conhecidos. Linhagens de tipo reprodutivo oposto são cruzadas simplesmente por meio do seu cultivo em conjunto. Um geneticista com uma agulha pode coletar um único ascósporo para estudo. Portanto, as análises nas quais são utilizados ascos completos ou ascósporos aleatórios são rápidas e diretas.
Ciclo de vida
N. crassa apresenta um ciclo de vida eucariótico haploide. Um esporo assexuado haploide
(denominado conídio) germina para produzir um tubo germinativo que se estende na sua ponta.
O crescimento progressivo da ponta e a rami cação produzem uma massa de lamentos
rami cados (denominados hifas), que forma uma colônia compacta no meio de crescimento.
Tendo em vista que as hifas não apresentam paredes transversais, uma colônia é essencialmente
uma célula que contém muitos núcleos haploides. A colônia brota e libera milhões de esporos
assexuados, que podem se dispersar no ar e repetir o ciclo assexuado.
No ciclo sexuado de N. crassa, existem dois tipos reprodutivos de aspecto idêntico, MAT-A e
MAT-a, que podem ser considerados “sexos” simples. Assim como em leveduras, os dois tipos
reprodutivos são determinados pelos dois alelos de um gene. Quando colônias de tipos
reprodutivos diferentes entram em contato, as suas paredes celulares e os seus núcleos se
fundem. Surgem muitos núcleos diploides temporários, cada um sofrendo meiose, produzindo
uma óctade de ascósporos. Os ascósporos germinam e produzem colônias exatamente como
aquelas produzidas pelos esporos assexuados.
Duração do ciclo de vida: 4 semanas para o ciclo sexuado.
Neurospora do tipo selvagem (esquerda) e mutante (direita) cultivados em uma placa de Petri. (Cortesia de Anthony Griffiths/Olivera Gavric.)
Tendo em vista que Neurospora é haploide, fenótipos mutantes recém-
obtidos são facilmente detectados com a utilização de diversos tipos de triagem e seleção. Um sistema favorito para o estudo do mecanismo de mutação é o gene ad-3, tendo em vista que mutantes do ad-3 são roxos e facilmente detectados.
Embora diploides vegetativos de Neurospora não sejam prontamente
obtidos, geneticistas são capazes de criar um “diploide mimético”, útil para testes de complementação e outras análises que requerem a presença de
duas cópias de um gene (ver Capítulo 6). A saber, a fusão de duas linhagens diferentes produz um heterocário, indivíduo que contém dois tipos nucleares diferentes em um citoplasma comum. Os heterocários também possibilitam a utilização de uma versão do teste de locus específico, um modo de recuperar mutações em um alelo recessivo específico. (As células de um heterocário +/m são plaqueadas e busca-se pelas colônias m/m.)
Técnicas de manipulação genética
Mutagênese-padrão:
Substâncias químicas e radiação Mutações somáticas aleatórias
Mutagênese de transpósons Não disponível
Transgênese:
Transformação mediada por plasmídio Inserção aleatória
Nocautes de gênicos direcionados:
RIP Mutações de GC → AT em segmentos
transgênicos duplicados antes de um
cruzamento
Repressão Inativação pós-transcricional somática de
transgenes
Engenharia genética
Transgênese. A primeira transformação eucariótica foi conquistada em Neurospora. Atualmente, Neurospora é facilmente transformado com a utilização de plasmídios bacterianos que carreiam o transgene desejado, mais um marcador selecionável, tal como a resistência à higromicina, para demonstrar que o plasmídio entrou. Nenhum plasmídio replica em Neurospora e, assim, um transgene é herdado apenas se estiver integrado a um cromossomo.
Nocautes direcionados. Em linhagens especiais de Neurospora, os transgenes com frequência integram-se por meio de recombinação homóloga. Portanto, uma linhagem transgênica normalmente apresenta o gene residente, mais o transgene homólogo, inserido em uma localização ectópica aleatória. Em virtude dessa duplicação de material, se a linhagem for cruzada, ela está sujeita a RIP, um processo genético que é único de Neurospora. RIP é um mecanismo pré-meiótico que introduz muitas transições de GC para AT em ambas as cópias duplicadas, rompendo efetivamente o gene. Portanto, RIP pode ser aproveitado como um modo conveniente para nocautear deliberadamente um gene específico.
Contribuições principais
George Beadle e Edward Tatum utilizaram Neurospora como organismo-modelo em seus estudos pioneiros sobre as relações entre genes e enzimas, nos quais foram capazes de determinar as etapas enzimáticas na síntese da
arginina (ver Capítulo 6). Seu trabalho com Neurospora estabeleceu o início da genética molecular. Seguiram-se muitos estudos comparáveis sobre a genética do metabolismo celular com a utilização de Neurospora.
Via de síntese do pigmento carotenoide laranja em Neurospora. (Cortesia de Anthony Griffiths.)
Têm sido realizados trabalhos pioneiros sobre a genética dos processos meióticos, tais como crossing over e disjunção, e sobre os ritmos de formação de conídios. Culturas em crescimento contínuo demonstram um ritmo diário de formação de conidiósporos. Os resultados de estudos pioneiros com a utilização de mutações que alteram esse ritmo contribuíram para um modelo geral em relação à genética dos ritmos circadianos.
O Neurospora atua como um modelo em relação à grande quantidade de
fungos filamentosos patogênicos que afetam cultivos e seres humanos, tendo em vista que esses fungos com frequência são difíceis de cultivar e manipular geneticamente. Ele é até mesmo utilizado como um sistema de teste eucariótico simples para substâncias mutagênicas e carcinogênicas no ambiente humano.
Tendo em vista que podem ser realizados cruzamentos com a utilização
de apenas uma genitora, o ciclo é conveniente para o estudo da genética mitocondrial e da interação de núcleo e mitocôndrias. Foi descoberta uma ampla variedade de plasmídios mitocondriais lineares e circulares em isolados naturais. Alguns deles são retroelementos que se acredita serem intermediários na evolução dos vírus.
Outras áreas de contribuição
• Diversidade e adaptação dos fungos • Citogenética (base cromossômica da genética) • Genes do tipo reprodutivo
• Genes de compatibilidade de heterocário (um modelo para o
reconhecimento genético próprio e não próprio).
Arabidopsis thaliana
Organismo-chave para estudar:
• Desenvolvimento
• Expressão e regulação gênica
• Genômica de plantas.
“Estatística vital” genética
Tamanho do genoma: 125 Mb
Cromossomos: Diploide, 5 autossomos (2n = 10)
Número de genes: 25.000
Porcentagem com homólogos humanos: 18%
Tamanho médio dos genes: 2 kb, 4 íntrons/gene
Transpósons: 10% do genoma
Genoma sequenciado em: 2000
A Arabidopsis thaliana, um membro da família Brassicaceae (repolho, couve) de plantas, chegou de modo relativamente tardio como um organismo-modelo genético. A maior parte dos trabalhos foi realizada nos últimos 20 anos. Ela não apresenta significância econômica: ela cresce de modo prolífico como uma erva daninha em muitas partes temperadas do mundo. Entretanto, em virtude do seu pequeno tamanho, do ciclo de vida curto, e do genoma pequeno, ela ultrapassou os modelos genéticos de plantas mais tradicionais, tais como o milho e o trigo, e se tornou o modelo dominante para a genética molecular vegetal.
Arabidopsis thaliana crescendo na natureza. As versões cultivadas em laboratório são menores. (Floral Images/Alamy.)
Características especiais
Em comparação a outras plantas, a Arabidopsis é pequena em relação ao seu tamanho físico e ao tamanho de seu genoma – características que são vantajosas para um organismo-modelo. A Arabidopsis cresce até uma altura inferior a 10 cm sob condições apropriadas; portanto, pode ser cultivada em grandes quantidades, possibilitando triagens de mutantes e análises de progênie em grande escala. O tamanho total de seu genoma de 125 Mb tornou o genoma relativamente fácil de sequenciar em comparação a outros genomas de organismos-modelo de plantas, tais como o genoma do milho (2.500 Mb) e o genoma do trigo (16.000 Mb).
Análise genética
A análise de mutações em Arabidopsis por meio de cruzamentos depende de tentativas e métodos verdadeiros – essencialmente aqueles utilizados por Mendel. Os estoques de plantas que carreiam mutações úteis e relevantes para o experimento são obtidos a partir de centros públicos. As linhagens podem ser cruzadas manualmente umas com as outras ou podem ser autofertilizadas. Embora as flores sejam pequenas, a polinização cruzada é facilmente realizada por meio da remoção das anteras que não se abriram (que por vezes são ingeridas pelo experimentador como um meio conveniente de descarte). Cada flor polinizada em seguida produz uma vagem longa, que contém um grande número de sementes. Essa abundante produção de descendência (milhares de sementes por planta) é uma vantagem para os geneticistas que procuram por mutantes raros ou outros eventos raros. Se uma planta carreia uma nova mutação recessiva na linhagem germinativa, a autofecundação possibilita que a progênie homozigota para a mutação recessiva seja recuperada nos descendentes imediatos da planta.
Ciclo de vida
A Arabidopsis apresenta o ciclo de vida familiar das plantas, com um estágio diploide dominante.
Uma planta contém diversas ores, cada qual produzindo muitas sementes. Assim como muitas
ervas daninhas anuais, o seu ciclo de vida é rápido: demora apenas aproximadamente 6 semanas
para que uma semente plantada produza uma nova colheita de sementes.
Duração total do ciclo de vida : 6 semanas.
Mutantes de Arabidopsis. (Esquerda) Flor de Arabidopsis do tipo selvagem. (Centro) Mutação agamous (ag), que resulta em flores apenas com pétalas e sépalas (nenhuma estrutura reprodutiva). (Direita) Um mutante duplo ap-1, cal, que produz uma flor que se assemelha a uma couve-flor. (Mutações semelhantes no repolho provavelmente são a causa das couves-flores reais.) (George Haughn.)
Técnicas de modi cação genética
Mutagênese-padrão:
Substâncias químicas e radiação Mutações nas linhagens germinativas ou
somáticas aleatórias
O próprio T-DNA ou transpósons Inserções aleatórias marcadas
Transgênese:
O T-DNA carreia o transgene Inserção aleatória
Nocautes gênicos direcionados:
Mutagênese mediada por T-DNA ou Inserção aleatória; nocautes de
transpóson mutagênese selecionados com PCR
RNAi Simula o nocaute direcionado
Engenharia genética
Transgênese. A T-DNA de Agrobacterium é um vetor conveniente para a
introdução de transgenes (ver Capítulo 10). O construto vetor-transgene se insere aleatoriamente no genoma. A transgênese oferece um modo efetivo para estudar a regulação gênica. O transgene é unido a um gene repórter, tal como GUS, que produz um corante azul em quaisquer posições na planta na qual o gene estiver ativo.
Nocautes direcionados. Tendo em vista que a recombinação homóloga é rara em Arabidopsis, genes específicos não podem ser facilmente nocauteados por meio da substituição homóloga com um transgene. Portanto, em Arabidopsis, os genes são nocauteados por meio da inserção aleatória de um T-DNA vetor ou transpóson (são utilizados transpósons de milho, tais como Ac-Ds), e em seguida nocautes gênicos específicos são selecionados por meio da aplicação da análise por PCR ao DNA de grandes conjuntos de plantas. A PCR utiliza uma sequência no T-DNA ou no transpóson como um primer e uma sequência no gene de interesse como o outro primer. Portanto, a PCR amplifica apenas as cópias do gene de interesse que carreiam uma inserção. A subdivisão do conjunto e a repetição do processo levam à planta específica que carreia o nocaute. Alternativamente, RNAi pode ser utilizado para inativar um gene específico.
Estão disponíveis grandes coleções de mutantes de inserção de T-DNA;
elas apresentam as sequências flanqueadoras das plantas listadas em bases de dados públicas; assim, se você estiver interessado em um gene específico, poderá verificar se a coleção contém uma planta que apresenta uma inserção naquele gene. Uma característica conveniente de populações nocaute em plantas é que elas podem ser mantidas facilmente e de modo não dispendioso como coleções de sementes durante muitos anos, talvez mesmo décadas. Essa característica não é possível em relação à maior parte das populações de modelos animais. O verme Caenorhabditis elegans pode ser preservado congelado, mas a mosca-das-frutas (Drosophila melanogaster) não pode ser congelada e reavivada. Portanto, linhagens de mutantes de mosca-das-frutas devem ser mantidas vivas.
Contribuições principais
Como o primeiro genoma de planta a ser sequenciado, Arabidopsis proporcionou um importante modelo em relação à arquitetura e à evolução do genoma de plantas. Além disso, estudos conduzidos em Arabidopsis deram contribuições-chave para a nossa compreensão sobre o controle genético do desenvolvimento das plantas. Geneticistas isolaram mutações homeóticas que afetam o desenvolvimento das flores, por exemplo. Nesses mutantes, um tipo de parte floral é substituído por outro. A integração da ação desses mutantes levou a um modelo sofisticado de determinação do verticilo das flores com base nos padrões sobrepostos de expressão de genes reguladores no meristema da flor. Arabidopsis também contribuiu amplamente para a base genética da fisiologia vegetal, da regulação gênica e da interação das plantas com o ambiente (incluindo a genética da resistência a doenças). Tendo em vista que Arabidopsis é uma planta natural de distribuição mundial, ela apresenta um grande potencial para o estudo da diversificação e da adaptação evolutiva.
O estabelecimento do destino do verticilo. A. Padrões de expressão gênica correspondentes aos diferentes destinos do verticilo. Do mais externo para o mais interno, os destinos são sépala (se), pétala (pe), estame (st) e carpelo (ca). B. As regiões sombreadas dos diagramas transversais da flor em desenvolvimento indicam os padrões de expressão gênica em relação aos genes das classes A, B e C.
Outras áreas de contribuição
• Resposta ao estresse ambiental
• Sistemas de controle hormonal.
Caenorhabditis elegans
Organismo-chave para estudar:
• Desenvolvimento
• Comportamento
• Nervos e músculos
• Envelhecimento.
“Estatística vital” genética
Tamanho do genoma: 97 Mb
Cromossomos: 5 autossomos (2n = 10), cromossomo X
Número de genes: 19.000
Porcentagem com homólogos humanos: 25%
Tamanho médio dos genes: 5 kb, 5 éxons/gene
Transpósons: Diversos tipos, ativos em algumas
linhagens
Genoma sequenciado em: 1998
O Caenorhabditis elegans pode não parecer grande coisa sob um microscópio e, de fato, esse nematódeo (geo-helminto), de 1 mm de comprimento e que habita o solo, é um animal relativamente simples. Mas tal simplicidade é parte do que torna o C. elegans um bom organismo-modelo. Seu tamanho pequeno, o crescimento rápido, a capacidade de autofecundação, a transparência e a baixa quantidade de células no corpo tornaram-no uma escolha ideal para o estudo da genética do desenvolvimento eucariótico.
Fotomicrografia e desenho de um Caenorhabditis elegans adulto. (De J. E. Sulston e H. R. Horvitz, Developmental Biology, 56, 1977, 111.)
Características especiais
Os geneticistas conseguem enxergar através do C. elegans. Contrariamente a outros organismos-modelo multicelulares, tais como a mosca-das-frutas e Arabidopsis, esse pequeno nematódeo é transparente, o que o torna eficiente para triar grandes populações em relação a mutações interessantes que afetam praticamente qualquer aspecto da anatomia ou do comportamento. A transparência também o torna apropriado para estudos do desenvolvimento: os pesquisadores conseguem observar diretamente todos os estágios do desenvolvimento ao simplesmente olhar os nematódeos sob um microscópio óptico. Os resultados de tais estudos demonstraram que o desenvolvimento do C. elegans é firmemente programado e que cada nematódeo apresenta um número de células surpreendentemente pequeno e consistente (959 nos hermafroditas e 1.031 nos machos). De fato, biólogos rastrearam os destinos de células específicas na medida em que o nematódeo se desenvolve e determinaram o padrão exato de divisão celular que leva a cada órgão adulto. Esse esforço produziu um heredograma de
linhagem em relação a todas as células adultas (ver Capítulo 13).
Uma representação simbólica das linhagens de 11 células. Uma célula que é submetida à morte celular programada é indicada por um X azul no final da ramificação de uma linhagem.
Ciclo de vida
C. elegans é único entre os principais animais-modelo, pois um dos dois sexos é hermafrodita
(XX). O outro é masculino (XO). Os dois sexos podem ser distinguidos pelo tamanho maior dos
hermafroditas e por diferenças nos seus órgãos sexuais. Os hermafroditas produzem ovócitos e
espermatozoides e, assim, podem se autofecundar. A progênie de um hermafrodita
autofecundado também é hermafrodita, exceto quando uma rara não disjunção origina um
macho XO. Se hermafroditas e machos forem misturados, os sexos copulam e muitos dos zigotos
resultantes terão sido fertilizados pelo espermatozoide ameboide dos machos. A fertilização e a
produção do embrião ocorrem dentro do hermafrodita, que, em seguida, deposita os ovos. Os
ovos nalizam o seu desenvolvimento externamente.
Duração total do ciclo de vida : 3 dias e
Análise genética
Tendo em vista que esses nematódeos são pequenos e se reproduzem rapidamente e de modo prolífico (a autofecundação produz aproximadamente uma progênie de 300 organismos e o cruzamento produz aproximadamente 1.000), originam progênie grande, que pode ser triada em relação a eventos genéticos raros. Além disso, tendo em vista que o hermafroditismo no C. elegans torna a autofecundação possível, os nematódeos com mutações homozigotas recessivas podem ser rapidamente isolados por meio de autofecundação da progênie tratada. Contrariamente, outros modelos animais, tais como moscas-das-frutas ou camundongos, requerem o cruzamento entre irmãos e demoram mais gerações para isolar mutações recessivas.
Técnicas de modi cação genética
Mutagênese-padrão:
Substâncias químicas (EMS) e radiação Mutações aleatórias na linhagem
germinativa
Transpósons Inserções aleatórias na linhagem
germinativa
Transgênese:
Injeção de transgene na gônada Transgene não integrado; integração
ocasional
Nocautes gênicos direcionados:
Mutagênese mediada por transpóson Nocautes selecionados com PCR
RNAi Simula o nocaute direcionado
Ablação a laser Nocaute de uma célula Engenharia genética
Transgênese. A introdução de transgenes na linhagem germinativa é possibilitada por meio de uma propriedade especial das gônadas do C. elegans, que são sinciciais, o que significa que existem muitos núcleos em um citoplasma comum. Os núcleos não se tornam incorporados nas células até a meiose, quando a formação de ovócitos individuais ou espermatozoides tem início. Portanto, uma solução de DNA que contém o transgene injetado na gônada de um hermafrodita expõe mais de 100 núcleos precursores de células germinativas ao transgene. Ao acaso, alguns
desses núcleos incorporarão o DNA (ver Capítulo 10).
Os transgenes se recombinam para formar arranjos em tandem de
multicópias. Em um ovócito, os arranjos não se integram em um cromossomo, mas os transgenes dos arranjos ainda são expressos. Portanto, o gene carreado em um clone de DNA do tipo selvagem pode ser identificado por meio da sua introdução em uma linhagem receptora recessiva específica (complementação funcional). Em alguns casos, porém não em todos, os arranjos transgênicos são transmitidos para a progênie. Para aumentar a chance de herança, os vermes são expostos à radiação ionizante, que pode induzir a integração de um arranjo em uma posição cromossômica ectópica e, nesse sítio, o arranjo é transmitido de modo confiável para a progênie.
Nocautes direcionados. Em linhagens com transpósons ativos, os próprios transpósons se tornam agentes de mutação por meio da inserção em locais aleatórios no genoma, nocauteando os genes interrompidos. Se pudermos identificar organismos com inserções em um gene de interesse específico, podemos isolar um nocaute gênico direcionado. Insertos em genes específicos podem ser detectados por meio da utilização da PCR se um primer de PCR tiver por base a sequência do transpóson e outro tiver por base a sequência do gene de interesse. Alternativamente, RNAi pode ser utilizado para anular a função de genes específicos. Como uma alternativa para a mutação, células individuais podem ser mortas por um feixe de laser para a observação do efeito sobre a função ou o desenvolvimento do verme (ablação a laser).
Criação de transgenes de C. elegans. A. Método de injeção. B. Arranjos extracromossômicos e integrados.
Contribuições principais
O C. elegans se tornou um organismo-modelo favorito para o estudo de diversos aspectos do desenvolvimento, em virtude de seu tamanho pequeno e número invariável de células. Um exemplo é a morte celular programada, um aspecto crucial do desenvolvimento normal. Algumas células são geneticamente programadas para morrer no período do desenvolvimento (um processo denominado apoptose). Os resultados dos estudos de C. elegans contribuíram para um modelo geral útil em relação à apoptose, que sabidamente também é uma característica do desenvolvimento humano.
Outro sistema-modelo é o desenvolvimento da vulva, a abertura do trato
reprodutivo para o exterior. Hermafroditas com vulvas defeituosas ainda produzem progênie, que em triagens são facilmente visíveis agrupadas dentro do corpo. Os resultados de estudos de hermafroditas sem vulvas ou com muitas revelaram como as células que apresentam um início completamente equivalente podem se tornar diferenciadas em diferentes
tipos celulares (ver Capítulo 13).
Produção da vulva de C. elegans. A. O tecido definitivo diferenciado. B. Método de diferenciação. As células têm um início completamente equivalente. Uma célula-âncora por trás das células equivalentes envia um sinal para as células mais próximas, que formam a vulva. A célula vulvar primária em seguida envia um sinal lateral para suas vizinhas, evitando que elas se tornem células primárias, mesmo que também tenham recebido o sinal da célula-âncora.
O comportamento também tem sido assunto de dissecção genética. C. elegans oferece uma vantagem, pois nematódeos com comportamento defeituoso ainda conseguem sobreviver e se reproduzir. Os sistemas nervoso e muscular do verme foram geneticamente dissecados, possibilitando que os comportamentos fossem ligados a genes específicos.
Outra área de contribuição
• Sinalização célula–célula.
Drosophila melanogaster
Organismo-chave para estudar:
• Genética da transmissão
• Citogenética
• Desenvolvimento
• Genética de populações
• Evolução.
“Estatística vital” genética
Tamanho do genoma: 180 Mb
Cromossomos: Diploide, 3 autossomos, X e Y (2n = 8)
Número de genes: 13.000
Porcentagem com homólogos humanos: Aproximadamente 50%
Tamanho médio dos genes: 3 kb, 4 éxons/gene
Transpósons: Elementos P, entre outros
Genoma sequenciado em: 2000
A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster (livremente traduzida como “apreciadora parda de néctar”), foi um dos primeiros organismos-modelo a ser utilizado em genética. Ela foi escolhida, em parte, por ser facilmente obtida em frutas maduras, apresentar um ciclo de vida curto do tipo diploide e ser simples de criar e cruzar em potes ou frascos contendo uma camada de alimento. A análise genética inicial demonstrou que os seus mecanismos de herança apresentam fortes semelhanças com aqueles de outros eucariotos, destacando o seu papel como um organismo-modelo. A sua popularidade como organismo-modelo entrou em declínio durante os anos em que E. coli, leveduras e outros microrganismos estavam sendo desenvolvidos como ferramentas moleculares. Entretanto, a Drosophila vivenciou um renascimento em virtude de ser muito adequada para o estudo da base genética do desenvolvimento, uma das questões centrais da biologia. A importância da Drosophila como um modelo para a genética humana é demonstrada pela descoberta de que aproximadamente 60% dos genes considerados causadores de doenças em humanos, bem como 70% dos genes de câncer, apresentam correspondentes na Drosophila.
Cromossomos politênicos. (William M. Gelbart, Harvard University.)
Características especiais
Drosophila entrou em voga como um organismo experimental no início do século 20, em virtude de características comuns à maior parte dos organismos-modelo. Ela é pequena (3 mm de comprimento), simples de criar (originalmente, em garrafas de leite), de reprodução rápida (apenas 12 dias do ovo ao adulto) e de fácil obtenção (apenas deixe alguma fruta apodrecendo). Ela comprovou reunir facilmente uma grande variedade de alelos mutantes interessantes, que foram utilizados para determinar as regras básicas da genética da transmissão. Os primeiros pesquisadores também se aproveitaram de uma característica única da mosca-das-frutas:
os cromossomos politênicos (ver Capítulo 17). Nas glândulas salivares e em outros determinados tecidos, esses “cromossomos gigantes” são produzidos por múltiplas rodadas de replicação do DNA sem segregação cromossômica. Cada cromossomo politênico demonstra um padrão de bandeamento único, que proporciona aos geneticistas pontos de referência que podem ser utilizados para correlacionar mapas com base na recombinação com cromossomos reais. O impulso proporcionado por esses avanços iniciais, juntamente com a grande quantidade de conhecimento acumulado a respeito do organismo, tornou a Drosophila um modelo genético atraente.
Análise genética
Cruzamentos em Drosophila podem ser realizados de modo consideravelmente fácil. Os genitores podem ser selvagens, estoques mutantes obtidos de centros de estoques ou novas linhagens mutantes.
Dois mutantes morfológicos de Drosophila, com o tipo selvagem para a comparação.
Ciclo de vida
A Drosophila apresenta um ciclo de vida diploide curto, que a torna adequada para a análise
genética. Após a eclosão do ovo, a mosca se desenvolve durante diversos estágios de larva e um
estágio de pupa antes de surgir como adulta, que logo se torna sexualmente madura. O sexo é
determinado pelos cromossomos sexuais X e Y (XX é fêmea, XY é macho), muito embora,
contrariamente aos seres humanos, o número de cromossomos X em relação ao número de
autossomos determine o sexo (ver Capítulo 2).
Duração total do ciclo de vida: 12 dias do ovo ao adulto.
Para realizar um cruzamento, machos e fêmeas são colocados em
conjunto em um frasco e as fêmeas botam ovos no alimento semissólido que recobre o fundo do frasco. Após surgir das pupas, a progênie pode ser anestesiada para possibilitar a contagem dos membros de classes fenotípicas e para distinguir os machos e as fêmeas (por meio de seus padrões de listras abdominais diferentes). Entretanto, tendo em vista que a progênie feminina permanece virgem durante poucas horas após seu surgimento das pupas, ela deve ser isolada imediatamente se for ser utilizada em cruzamentos controlados. Os cruzamentos destinados à construção de combinações genéticas específicas devem ser cuidadosamente planejados, tendo em vista que o crossing over não ocorre em machos de Drosophila. Portanto, em machos, os alelos ligados não se recombinarão para ajudar na criação de novas combinações.
Para a obtenção de novas mutações recessivas, programas de cruzamento
especiais (dos quais o protótipo é o teste CIB de Muller) proporcionam sistemas de triagem convenientes. Nesses testes, moscas mutagenizadas são cruzadas com um estoque que apresenta um cromossomo balanceador (ver
Capítulo 17). As mutações recessivas são finalmente trazidas à homozigose por autocruzamento durante uma ou duas gerações, iniciando com moscas individuais da F1.
Técnicas de modi cação genética
Mutagênese-padrão:
Substâncias químicas (EMS) e radiação Mutações aleatórias nas linhagens
germinativa e somática
Transgênese:
Mediada por elemento P Inserção aleatória
Nocautes gênicos direcionados:
Substituição induzida O alelo ectópico nulo sai e se recombina
com o alelo do tipo selvagem
RNAi Mimetiza o nocaute direcionado
Engenharia genética
Transgênese. A construção de moscas transgênicas requer o auxílio de um transpóson de Drosophila denominado elemento P. Geneticistas constroem um vetor que carreia um transgene flanqueado por repetições do elemento P. O transgene vetor, em seguida, é injetado em um zigoto juntamente com um plasmídio auxiliar que contém uma transposase. A transposase possibilita que o transgene salte aleatoriamente para o genoma nas células
germinativas do embrião (ver Capítulo 15).
Nocautes direcionados. Os nocautes de genes-alvo podem ser conquistados, primeiramente, com a introdução de um alelo nulo de modo transgênico em uma posição ectópica e, em segundo lugar, com a indução de enzimas especiais que causam a excisão do alelo nulo. O fragmento excisado (que é linear) em seguida encontra e substitui a cópia endógena por meio do crossing over homólogo. Entretanto, nocautes funcionais podem ser produzidos de modo mais eficiente por RNAi.
Contribuições principais Uma grande parte do desenvolvimento inicial da teoria cromossômica da hereditariedade teve por base os resultados de estudos com Drosophila. Geneticistas que trabalham com a Drosophila fizeram avanços-chave no desenvolvimento de técnicas para o mapeamento gênico, na compreensão da origem e da natureza da mutação gênica, e na documentação da natureza
e do comportamento dos rearranjos cromossômicos (ver Capítulo 4).
Os segmentos torácico e abdominal normais de Drosophila.
Suas descobertas abriram as portas para outros estudos pioneiros:
• Estudos iniciais sobre a cinética da indução de mutação e a estimativa das
taxas de mutação foram realizados com a utilização da Drosophila. O
teste de CIB de Muller e testes semelhantes proporcionaram métodos de
triagem convenientes em relação às mutações recessivas
• Rearranjos cromossômicos que movem os genes adjacentes à
heterocromatina foram utilizados para descobrir e estudar a variegação
por efeito de posição
• Na última parte do século 20, após a identificação de determinadas
classes de mutações-chave, tais como as mutações homeóticas e de efeito
materno, a Drosophila assumiu um papel central na genética do
desenvolvimento, um papel que continua atualmente (ver Capítulo 13).
As mutações de efeito materno que afetam o desenvolvimento de
embriões, por exemplo, têm sido cruciais na elucidação da determinação
genética do plano corporal de Drosophila; essas mutações são
identificadas pela triagem de fenótipos do desenvolvimento anormais nos
embriões de uma fêmea específica. Técnicas tais como rastreamento de
captura de acentuador possibilitaram a descoberta de novas regiões
reguladoras no genoma que afetam o desenvolvimento. Por meio desses
métodos e de outros, biólogos que trabalham com Drosophila fizeram
avanços importantes na compreensão sobre a determinação da
segmentação e dos eixos corporais. Alguns dos genes-chave descobertos,
tais como os genes homeóticos, apresentam ampla relevância nos animais
em geral.
Fotomicrografias demonstrando gradientes de determinantes do plano corporal. A. O mRNA do gene bcd está demonstrado localizado na ponta anterior (à esquerda) do embrião. B. O mRNA do gene nos está localizado posteriormente (ponta à direita do embrião). A distribuição das proteínas codificadas por estes e outros genes determina o eixo corporal. (A. Cortesia de Ruth Lehman; B. Cortesia de James Langeland.)
Outras áreas de contribuição
• Genética de populações
• Genética evolutiva
• Genética comportamental.
Mus musculus
Organismo-chave para estudar:
• Doenças humanas
• Mutações
• Desenvolvimento
• Cor da pelagem
• Imunologia.
“Estatística vital” genética
Tamanho do genoma: 2.600 Mb
Cromossomos: 19 autossomos, X e Y (2n = 40)
Número de genes: 30.000
Porcentagem com homólogos humanos: 99%
Tamanho médio dos genes: 40 kb, 8,3 éxons/gene
Transpósons: Fonte de 38% do genoma
Genoma sequenciado em: 2002
Tendo em vista que os seres humanos e a maior parte dos animais domesticados são mamíferos, a genética dos mamíferos é de grande interesse. Entretanto, os mamíferos não são ideais para a genética: eles são de tamanho relativamente grande em comparação aos outros organismos-modelo; ocupam, por isso, instalações grandes e dispendiosas; seus ciclos de vida são longos; e seus genomas são grandes e complexos. Entretanto, em comparação aos outros mamíferos, os camundongos (Mus musculus) são relativamente pequenos, apresentam ciclos de vida curtos e são facilmente obtidos, o que os torna uma excelente escolha para um modelo em mamíferos. Além disso, os camundongos tiveram uma vantagem na genética, tendo em vista que “apreciadores” de camundongos já haviam desenvolvido muitas linhagens interessantes e diferentes desses animais, que proporcionaram uma fonte de variantes para a análise genética. Pesquisas sobre a genética mendeliana de camundongos começaram no início do século 20.
Camundongo adulto e sua ninhada. (Anthony Griffiths.)
Características especiais
Os camundongos não são exatamente humanos pequenos e peludos, mas a sua constituição genética é notavelmente semelhante à nossa. Entre os organismos-modelo, o camundongo é aquele cujo genoma se assemelha de modo mais próximo ao genoma humano. O genoma do camundongo é aproximadamente 14% menor do que o dos seres humanos (o genoma humano tem 3.000 Mb), mas apresenta aproximadamente o mesmo número de genes (as estimativas atuais são de um pouco menos de 30.000). Surpreendentemente, 99% dos genes do camundongo aparentam apresentar homólogos em seres humanos. Além disso, uma grande proporção do genoma é sintênica com o dos seres humanos; ou seja, existem grandes blocos que contêm os mesmos genes nas mesmas posições relativas (ver
Capítulo 14). Tais semelhanças genéticas são a chave para o sucesso do camundongo como um organismo-modelo; elas possibilitam que os camundongos sejam tratados como “substitutos” para seus correspondentes humanos de muitas maneiras. Os possíveis mutágenos e carcinógenos suspeitos de causar danos para os seres humanos, por exemplo, são testados em camundongos, e modelos em camundongos são essenciais no estudo de uma ampla variedade de doenças genéticas humanas.
Um mapa de sintenia entre camundongo-ser humano de 12 cromossomos do genoma humano. A codificação colorida é utilizada para ilustrar as correspondências regionais de cada bloco do genoma humano com as seções correspondentes do genoma do camundongo. Cada cor representa um cromossomo diferente de camundongo.
Análise genética Camundongos mutantes e do “tipo selvagem” (mesmo que não verdadeiramente retirados do ambiente selvagem) são fáceis de ser obtidos: eles podem ser solicitados de grandes centros de estoques, que fornecem camundongos adequados para cruzamentos e diversos outros tipos de experimentos. Muitas dessas linhagens são derivadas de camundongos criados nos séculos passados. Os cruzamentos controlados podem ser realizados simplesmente por meio do pareamento de um macho com uma fêmea não prenhe. Na maior parte dos casos, os genótipos parentais podem ser fornecidos pelo macho ou pela fêmea.
Ciclo de vida
Camundongos apresentam um ciclo de vida diploide familiar, com um sistema de determinação
sexual XY semelhante àquele dos seres humanos. As ninhadas têm de 5 a 10 lhotes; entretanto,
a fecundidade das fêmeas declina após aproximadamente 9 meses e, assim, elas raramente têm
mais de cinco ninhadas.
Duração total do ciclo de vida: 10 semanas desde o nascimento até parir os lhotes, na maior
parte das linhagens de laboratório.
A maior parte das estimativas-padrão das taxas de mutação em
mamíferos (incluindo seres humanos) tem por base medições em camundongos. Na verdade, os camundongos proporcionam o teste final dos agentes suspeitos de causar mutações em seres humanos. As taxas de mutação na linhagem germinativa são medidas com a utilização do teste locus específico: indução de mutagênese nas gônadas +/+, cruzamento com m/m (m é uma mutação recessiva conhecida no locus em estudo), e procura por progênie m*/m (m* é uma nova mutação). O procedimento é repetido em sete loci de amostra. A medida das taxas de mutação somática utiliza uma configuração semelhante, mas o mutágeno é injetado no feto. Camundongos têm sido utilizados extensivamente para estudar o tipo de mutação somática que dá origem ao câncer.
Técnicas de modi cação genética
Mutagênese-padrão:
Substâncias químicas e radiação Mutações nas linhagens germinativa e
somática
Transgênese:
Injeção de transgene no zigoto Inserção aleatória e homóloga
Captação de transgene por células-tronco Inserção aleatória e homóloga
Nocautes gênicos direcionados:
Captação de transgene nulo por células- Seleção das células-tronco de nocaute
tronco direcionado
Engenharia genética
Transgênese. A criação de camundongos transgênicos é direta, mas requer
a cuidadosa manipulação de um zigoto (ver Capítulo 10). Primeiramente, o DNA genômico do camundongo é clonado em E. coli com a utilização de vetores bacterianos ou fagos. Em seguida, o DNA é injetado em um zigoto, onde ele se integra em locais ectópicos (aleatórios) no genoma ou, menos comumente, no locus normal. A atividade da proteína transgênica pode ser monitorada por meio da fusão do transgene com um gene repórter, tal como GFP, antes que o gene seja injetado. Com a utilização de um método semelhante, as células somáticas de camundongos também podem ser modificadas por meio da inserção de um transgene: fragmentos específicos de DNA são inseridos em células somáticas individuais e essas células, por sua vez, são inseridas nos embriões de camundongos.
Produção de um camundongo transgênico. O transgene, um gene do hormônio de crescimento de rato, unido a um promotor de camundongo, é injetado em um zigoto de camundongo homozigoto para nanismo (lit/lit). (Foto: R. L. Brinster, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania.)
Nocautes direcionados. Nocautes de genes específicos para a dissecção genética podem ser obtidos por meio da introdução de um transgene que contenha um alelo defeituoso e dois marcadores de resistência a fármacos
em uma célula-tronco embrionária do tipo selvagem (ver Capítulo 10). Os marcadores são utilizados para selecionar células transformantes específicas nas quais o alelo defeituoso tenha substituído o alelo do tipo selvagem homólogo. As células transgênicas em seguida são introduzidas em embriões de camundongo. Um método semelhante pode ser utilizado para substituir os alelos do tipo selvagem por um transgene funcional (terapia gênica).
Produção de um nocaute gênico. R Um gene de resistência a fármacos ( neo) é inserido no transgene, tanto para atuar como um marcador quanto para romper o gene, produzindo um nocaute. (O gene tk é um segundo marcador.) O construto transgênico em seguida é injetado em células embrionárias de camundongo.
Contribuições principais
Inicialmente na carreira do camundongo como um organismo-modelo, geneticistas utilizavam os camundongos para elucidar os genes que controlam a cor e o padrão da pelagem, fornecendo um modelo em relação a todos os mamíferos que contêm pelos, incluindo gatos, cães, cavalos e
gado (ver Capítulo 6). Mais recentemente, estudos da genética de camundongo realizaram uma diversidade de contribuições com impacto direto na saúde humana:
• Uma grande proporção de doenças genéticas humanas apresenta um
correspondente em camundongos – denominado um “camundongo-
modelo” – útil para estudos experimentais
• Os camundongos atuam como modelos em relação aos mecanismos de
mutações em mamíferos
Estudos sobre os mecanismos genéticos do câncer são realizados em
•
camundongos
• Muitos possíveis carcinógenos são testados em camundongos • Camundongos têm sido modelos importantes para o estudo da genética do
desenvolvimento em mamíferos (ver Capítulo 13). Por exemplo, eles
proporcionam um sistema-modelo para o estudo de genes que afetam as
fendas labial e palatina, um distúrbio comum do desenvolvimento
humano
• Linhagens celulares híbridas, resultantes da fusão dos genomas de
camundongos e seres humanos, desempenharam um papel importante na
atribuição de genes humanos a cromossomos humanos específicos. Existe
uma tendência dos cromossomos humanos de serem perdidos dos
referidos híbridos e, assim, a perda de cromossomos específicos pode ser
correlacionada à perda de alelos humanos específicos.
Outras áreas de contribuição
• Genética do comportamento
• Genética quantitativa
• Os genes do sistema imune.
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