Introdução à Genética
Utilização de clonagem posicional para identificar o gene de uma doença humana
em computador (ver Capítulo 14). A partir da análise da sequência desses genes da “vizinhança”, são escolhidos os candidatos mais prováveis que possam representar o gene que está sendo buscado.
A seguir, discutiremos brevemente como a clonagem posicional foi
utilizada antes da disponibilidade da sequência genômica humana para isolar o gene responsável pela devastadora doença humana fibrose cística (o gene da FC). Embora essa técnica não seja mais necessária para a identificação de genes humanos, ela ainda é utilizada para identificar genes específicos em organismos nos quais uma sequência genômica ainda deva ser determinada.
Utilização de clonagem posicional para identificar o gene de
uma doença humana
Seguiremos os métodos utilizados para identificar a sequência genômica do gene da fibrose cística. Nenhum defeito bioquímico primário era conhecido na ocasião em que o gene foi isolado e, assim, tratava-se muito mais um gene em busca de uma função.
Triagens genéticas dependentes do mapeamento gênico podem ser
utilizadas para dissecar qualquer processo biológico. Entretanto, triagens genéticas não podem ser utilizadas em seres humanos, tendo em vista que não podemos criar intencionalmente mutantes humanos. Em vez disso, são realizadas análises de heredogramas de grandes famílias com o traço da
doença (ver Capítulo 2), quando as referidas informações estão disponíveis, para determinar a posição do defeito genético que causa uma doença tal como a fibrose cística. Observa-se que membros de uma família que têm a doença apresentam um ou mais marcadores moleculares (anormalidades cromossômicas, traços ligados de localização conhecida, SNP e assim por diante) em comum, que não são observados em outras famílias (ver uma
discussão sobre os marcadores moleculares no Capítulo 4). A ligação a marcadores moleculares em famílias com FC localizou o gene da FC no braço longo do cromossomo 7, entre as bandas 7q22 e 7q31.1. Acreditava-se que o gene da FC estivesse nessa região, mas entre esses marcadores há 1,5 centimorgan (unidades de mapa) de cromossomo, um vasto terreno inexplorado de mais de 1 milhão de bases. Para chegar mais perto, era necessário gerar mais marcadores moleculares nessa região. O método geral
para isolamento de marcadores moleculares (descrito no Capítulo 4) é identificar uma região do DNA que seja polimórfica em indivíduos ou populações que diferem em relação ao traço de interesse. Ao encontrar marcadores moleculares adicionais ligados ao gene da FC, os geneticistas estreitaram a região que contém o gene da FC para aproximadamente 500 kbp, ainda uma distância considerável.
Foi criado um mapa físico dessa região inteira; ou seja, um conjunto
aleatório de clones dessa região foi posicionado na ordem correta. Isso foi parcialmente realizado por meio da utilização de uma técnica denominada
caminhada cromossômica (chromosome walk) (Figura 10.19). A ideia básica é utilizar a sequência do marcador próximo como uma sonda para identificar um segundo conjunto de clones que se sobrepõe ao clone do marcador que contém o marco, mas que se estende para fora a partir dele em uma de duas direções (em direção ao alvo ou para longe do alvo). Fragmentos terminais dos novos conjuntos de clones podem ser utilizados como sondas para a identificação de um terceiro conjunto de clones sobrepostos a partir da biblioteca genômica. Desse modo tedioso, geneticistas identificaram o clone que contém os marcadores moleculares que estão mais firmemente ligados ao traço da FC e sequenciaram aquele clone. Com a sequência em mãos, a caçada por quaisquer genes ao longo desse trecho de DNA, que contivessem os genes e as sequências não codificadoras, pôde ser iniciada.