11.7 Fatores sigma alternativos regulam grandes conjuntos de genes

FIGURA 11.30 As interações de aminoácidos e bases determinam a especificidade e a afinidade das proteínas de ligação ao DNA. Estão demonstradas as sequências de aminoácidos das hélices de reconhecimento do repressor λ e das proteínas Cro. As interações dos resíduos de glutamina (Gln), serina (Ser) e alanina (Ala) do repressor λ e as bases no operador OR determinam a força da ligação. De modo semelhante, as interações dos resíduos de glutamina, serina, asparagina (Asn) e lisina (Lys) da proteína Cro medeiam a ligação ao operador O R3. Cada sequência de DNA demonstrada é aquela ligada por um monômero individual do respectivo repressor; ela tem metade do sítio operador ocupado pelo dímero do repressor. (Dados de M. Ptashne, A Genetic Switch: Phage I and Higher Organisms, 2nd ed.)

 

 

11.7 Fatores sigma alternativos regulam grandes

conjuntos de genes

Até agora, vimos como interruptores únicos podem controlar a expressão de óperons únicos ou de dois óperons que contêm tantos quanto um par de dúzias de genes. Algumas respostas fisiológicas às alterações no ambiente requerem a expressão coordenada de grandes conjuntos de genes não ligados localizados por todo o genoma para ocasionar alterações fisiológicas dramáticas e até mesmo morfológicas. As análises desses processos revelaram outro desvio na regulação gênica bacteriana: o controle de grandes números de genes por fatores sigma (σ) alternativos da RNA polimerase. Um referido exemplo, o processo da esporulação no Bacillus subtilis, foi analisado em grande detalhe nas últimas poucas décadas. Sob estresse, a bactéria forma esporos que são notavelmente resistentes ao calor e à dessecação.

Inicialmente no processo de esporulação, a bactéria se divide assimetricamente, gerando

dois componentes de tamanho desigual que apresentam destinos muito diferentes. O compartimento menor, o pró-esporo, desenvolve-se dentro do esporo. O compartimento maior, a célula-mãe, nutre o esporo em desenvolvimento e é lisado quando a morfogênese

do esporo está completa, para liberar o esporo (Figura 11.31 A). A dissecção genética desse processo envolveu o isolamento de muitos mutantes que não conseguem esporular. Investigações detalhadas levaram à caracterização de diversas proteínas reguladoras-chave que regulam diretamente programas de expressão gênica que são específicos do pré-esporo ou da célula-mãe. Quatro dessas proteínas são fatores σ alternativos.

Lembre que o início da transcrição em bactérias inclui a ligação da subunidade σ da RNA

polimerase às regiões —35 e —10 dos promotores dos genes. O fator σ se desassocia do complexo quando a transcrição tem início e é reciclado. No B. subtilis, dois fatores σ, σA e σH, são ativos em células vegetativas. Durante a esporulação, um diferente fator σ, σF, torna-se ativo no pró-esporo e ativa um grupo de mais de 40 genes. Um gene ativado por σF é uma proteína secretada que, por sua vez, aciona o processamento proteolítico do precursor inativo pró-σE, um fator σ distinto na célula-mãe. O fator σE é necessário para ativar conjuntos de genes na célula-mãe. Dois fatores σ adicionais, σK e σG, são subsequentemente

ativados na célula-mãe e no pró-esporo, respectivamente (Figura 11.31 A). A expressão de fatores σ distintos possibilita a transcrição coordenada de diferentes conjuntos de genes, ou regulons, por uma única RNA polimerase.

 

FIGURA 11.31 A esporulação no Bacillus subtilis é regulada por cascatas de fatores σ. A. Em células vegetativas, σA H F E e σ são ativos. No início da esporulação, σ é ativo no pró-esporo e σ é ativo na célula-mãe. Esses fatores σ em seguida são substituídos por σG K e σ, respectivamente. A célula-mãe finalmente é lisada e libera o esporo maduro. E F B. Os fatores σ e σ controlam os regulons de muitos genes (ybaN, e assim por diante, nesta ilustração). Estão demonstrados três exemplos do grande número de promotores regulados por cada fator σ. Cada fator σ apresenta uma sequência de ligação distinta e específica nas sequências —35 e — 10 dos promotores-alvo. (Dados de P. Eichenberger et al., J. Mol. Biol. 327, 2003, 945-972; e S. Wang et al., J. Mol. Biol. 358, 2006, 16-37.)

 

Como esses fatores σ alternativos controlam diferentes aspectos do processo de

esporulação? As respostas se tornaram cristalinas com o advento de novas abordagens para a caracterização da expressão de todos os genes em um genoma (ver Seção 14.6). Atualmente, é possível monitorar a transcrição de cada gene de B. subtilis durante o crescimento vegetativo e a formação de esporos e em diferentes compartimentos do esporo. Diversas centenas de genes foram identificadas desse modo, os quais são transcricionalmente ativados ou reprimidos durante a formação dos esporos.

Como os diferentes conjuntos de genes são controlados por cada fator σ? Cada fator σ

apresenta diferentes propriedades de ligação sequência específica ao DNA. Os óperons ou genes individuais regulados por fatores σ específicos apresentam sequências caracterizadas nas regiões —35 e —10 de seus promotores que são ligadas por um fator σ e não por outros

(Figura 11.31 B). Por exemplo, σE se liga a no mínimo 121 promotores, dentro de 34 óperons e 87 genes individuais, para regular mais de 250 genes, e σF se liga a no mínimo 36 promotores para regular 48 genes.

 

CONCEITO-CHAVE A expressão sequencial de fatores σ alternativos que reconhecem sequências promotoras

alternativas proporciona a expressão coordenada de grandes números de óperons independentes e genes não

ligados durante o programa de desenvolvimento da esporulação.

 

Fatores σ alternativos também desempenham papéis importantes na virulência de

patógenos humanos. Por exemplo, bactérias do gênero Clostridium produzem toxinas potentes que são responsáveis por diversas doenças, tais como botulismo, tétano e gangrena. Recentemente descobriu-se que os genes de toxinas-chave de C. botulinum, C. tetani e C. perfringens são controlados por fatores σ alternativos correlatos, que reconhecem sequências semelhantes nas regiões —35 e —10 dos genes de toxina. A compreensão sobre os mecanismos de regulação dos genes de toxina pode levar a novos meios de prevenção de doenças e terapia.

 

RESUMO

A regulação gênica com frequência é mediada por proteínas que reagem a sinais ambientais por meio da elevação ou da redução das taxas de transcrição de genes específicos. A lógica dessa regulação é direta. Para que a regulação opere de modo adequado, as proteínas reguladoras apresentam sensores integrados que monitoram continuamente as condições celulares. As atividades dessas proteínas dependem então de condições ambientais apropriadas.

Em bactérias e seus vírus, o controle de diversos genes estruturais pode ser coordenado

pelo agrupamento dos genes em óperons no cromossomo, de modo que eles são transcritos em mRNA multigênicos. O controle coordenado simplifica a tarefa para as bactérias, tendo em vista que um grupo de sítios reguladores por óperon é suficiente para regular a expressão de todos os genes do óperon. Alternativamente, o controle coordenado também pode ser conquistado por meio de fatores σ discretos que regulam dúzias de promotores independentes simultaneamente.

No controle regulador negativo, uma proteína repressora bloqueia a transcrição por meio

da ligação ao DNA no sítio operador. O controle regulador negativo é exemplificado pelo sistema lac. A regulação negativa é um modo muito direto de o sistema lac desligar genes na ausência de açúcares apropriados no ambiente. No controle regulador positivo, são necessários fatores proteicos para ativar a transcrição. Alguns controles gênicos procarióticos, tais como aquele em relação à repressão catabólica, operam por meio do controle gênico positivo.

Muitas proteínas reguladoras são membros de famílias de proteínas que apresentam motifs

de ligação ao DNA muito semelhantes, tais como o domínio hélice-giro-hélice. Outras partes das proteínas, tais como seus domínios de interação proteína-proteína, tendem a ser menos semelhantes. A especificidade da regulação gênica depende de interações químicas das cadeias laterais dos aminoácidos com grupos químicos nas bases do DNA.

 

TERMOS-CHAVE

ação cis

adenosina monofosfato cíclico (cAMP)

antiterminalizador

atenuação

atenuador

ativador

ciclo lisogênico

ciclo lítico

controle negativo

controle positivo

diploide parcial

domínio de ligação ao DNA

efetor alostérico

genes controlados coordenadamente

indução

indutor

iniciador

interruptor genético

mutação constitutiva

operador

óperon

promotor

proteína ativadora de catabólito (CAP)

regulon

repressão catabólica

repressor

sequência líder

sítio alostérico

transatuante

transição alostérica

 

PROBLEMAS RESOLVIDOS

Este conjunto de quatro problemas resolvidos, que são semelhantes ao Problema 10 nos Problemas básicos, ao fim deste capítulo, é desenhado para testar a compreensão sobre o modelo do óperon. Aqui, recebemos diversos diploides e nos é solicitado que determinemos se os produtos dos genes Z e Y são produzidos na presença ou na ausência de um indutor. Utilize uma tabela semelhante àquela no Problema 11 como base para as suas respostas, com a exceção de que os títulos das colunas serão como segue:

 

Gene Z Gene Y

 

Genótipo Nenhum indutor Indutor Nenhum indutor Indutor

 

PROBLEMA RESOLVIDO 1

 

I— P— OC Z+ Y+

I+ P+ O+ Z— Y—

 

Solução Um modo de abordar estes problemas é primeiramente considerar cada cromossomo em separado e em seguida construir um diagrama. A ilustração a seguir digrama este diploide:

 

O primeiro cromossomo é P— e, assim, a transcrição é bloqueada e nenhuma enzima Lac pode ser sintetizada a partir dele. O segundo cromossomo (P+) pode ser transcrito e, portanto, a transcrição é reprimível (O+). Entretanto, os genes estruturais ligados ao bom promotor são defeituosos; portanto, nenhum produto de Z ou produto de Y ativo pode ser produzido. Os símbolos a serem adicionados à sua tabela são “—, —, —, —”.

 

PROBLEMA RESOLVIDO 2

 

I+ P— O+ Z+ Y+

I— P+ O+ Z+ Y—

 

Solução

O primeiro cromossomo é P— e, assim, nenhuma enzima pode ser sintetizada a partir dele. O segundo cromossomo é O+ e, assim, a transcrição é reprimida pelo repressor fornecido a partir do primeiro cromossomo, que pode atuar em trans através do citoplasma. Entretanto, apenas o gene Z desse cromossomo está intacto. Portanto, na ausência de um indutor, nenhuma enzima é produzida; na presença de um indutor, apenas o produto do gene Z, a β-galactosidase, é produzida. Os símbolos a serem adicionados à tabela são “—, +, —, —,”.

PROBLEMA RESOLVIDO 3

 

 

I+ P+ OC Z— Y+

I+ P— O+ Z+ Y—

 

Solução

Tendo em vista que o segundo cromossomo é P—, precisamos considerar apenas o primeiro cromossomo. Esse cromossomo é OC e, assim, a enzima é produzida na ausência de um indutor, muito embora, em virtude da mutação Z—, apenas a permease ativa (Y) seja produzida. As entradas na tabela devem ser “—, —, +, +”.

PROBLEMA RESOLVIDO 4

 

IS P+ O+ Z+ Y—

I— P+ OC Z— Y+

 

Solução

Na ausência de um repressor IS, todos os operadores do tipo selvagem são desligados, tanto com um indutor quanto sem um indutor. Portanto, o primeiro cromossomo é incapaz de produzir qualquer enzima. Entretanto, o segundo cromossomo apresenta um operador alterado (OC) e pode produzir enzima tanto na ausência quanto na presença de um indutor. Apenas o gene Y é do tipo selvagem no cromossomo OC e, assim, apenas a permease é produzida constitutivamente. As entradas na tabela devem ser “—, —, +, +”.

 

PROBLEMAS

 

QUESTÕES SOBRE AS FIGURAS

1. Compare a estrutura de IPTG demonstrada na Figura 11.7 com a estrutura da

galactose demonstrada na Figura 11.5. Por que o IPTG se liga ao repressor Lac, mas

não é fragmentado pela β-galactosidase?

2. Observando a Figura 11.9, por que os diploides parciais eram essenciais para

estabelecer a natureza de ação trans do repressor Lac? Seria possível distinguir os

genes de ação cis dos genes de ação trans (transatuantes) em haploides?

3. Por que as mutações no promotor se agrupam nas posições —10 e —35, conforme

demonstrado na Figura 11.11? Qual interação de proteína-DNA é rompida por essas

mutações?

4. Observando a Figura 11.16, verifique a grande sobreposição entre o operador e a

região do óperon lac que é transcrita. Qual proteína se liga especificamente a essa

sequência sobreposta, e qual efeito ela apresenta sobre a transcrição?

5. Examinando a Figura 11.21, qual efeito você prevê que as mutações do trpA terão

sobre os níveis de triptofano?

6. Examinando a Figura 11.21, qual efeito você prevê que as mutações do trpA terão

sobre a expressão do mRNA do trp?

 

PROBLEMAS BÁSICOS

7. Qual das moléculas a seguir é um indutor do óperon lac:

a. Galactose

b. Glicose

c. Alolactose

d. Isotiocianato

e. cAMP

f. Lactose

8. Explique por que os alelos I— no sistema lac normalmente são recessivos aos alelos I+

e por que os alelos I+ são recessivos aos alelos IS.

9. O que queremos dizer quando falamos que as mutações OC no sistema lac são de ação

cis?

10. Os símbolos a, b e c na tabela a seguir representam os genes do sistema lac de E. coli

em relação ao repressor (I), à região operadora (O) e à β-galactosidase (Z), embora

não necessariamente nessa ordem. Além disso, a ordem na qual os símbolos estão

escritos nos genótipos não é necessariamente a sequência real no óperon lac. Atividade (+) ou inatividade (—) do gene Z

 

Genótipo Indutor ausente Indutor presente

 

a— b+ c+ + +

a+ b+ c— + +

 

a+ b— c— — —

 

a+ b— c+/a— b+ c— + +

 

a+ b+ c+/a— b— c— — +

 

a+ b+ c—/a— b— c+ — +

 

a— b+ c+/a+ b— c— + +

 

a. Qual símbolo (a, b ou c) representa cada um dos genes lac I, O e Z?

b. Na tabela, um sinal de menos sobrescrito em um símbolo de gene indica

meramente um mutante, mas alguns comportamentos mutantes nesse sistema recebem

designações de mutantes especiais. Com a utilização dos símbolos gênicos

convencionais em relação ao óperon lac, designe cada genótipo na tabela. 11. O mapa do óperon lac é:

 

POZY

 

A região promotora (P) é o local de início da transcrição por meio da ligação da

molécula de RNA polimerase antes da real produção de mRNA. Promotores alterados

por mutação (P—) aparentemente não conseguem ligar a molécula de RNA

polimerase. Podem ser feitas determinadas previsões a respeito do efeito das mutações

P—. Utilize as suas previsões e o seu conhecimento sobre o sistema lactose para

completar a tabela a seguir. Insira um “+” onde uma enzima é produzida e um “—”

onde nenhuma enzima é produzida. A primeira foi realizada como um exemplo. 12. Explique as diferenças fundamentais entre o controle negativo e o controle positivo da

transcrição em procariotos. Cite dois exemplos de cada mecanismo de controle. 13. Mutantes que são lacY— retêm a capacidade de sintetizar β-galactosidase. Entretanto,

embora o gene lacI ainda esteja intacto, a β-galactosidade deixou de ser induzida pela

adição de lactose ao meio. Explique.

14. Quais são as analogias entre os mecanismos que controlam o óperon lac e aqueles que

controlam os interruptores genéticos do fago λ?

15. Compare o arranjo dos sítios de ação cis nas regiões de controle do óperon lac e do

fago λ.

16. Qual proteína reguladora induz os genes da fase lítica do ciclo de vida do fago λ?

a. cI

b. Cro

c. Repressor Lac

d. Lactose

17. Preveja o efeito de uma mutação que elimine a atividade de ligação ao DNA da

proteína σE na formação de esporos no Bacillus subtilis.

 

PROBLEMAS DESAFIADORES

18. Uma mutação interessante em lacI resulta em repressores com aumento de 110 vezes

de ligação a ambos o DNA operador e não operador. Esses repressores demonstram

uma curva de indução “reversa”, que possibilita a síntese de β-galactosidase na

ausência de um indutor (IPTG), mas que reprime parcialmente a expressão de β-

galactosidase na presença de IPTG. Como você pode explicar isso? (Observe que,

quando o IPTG se liga a um repressor, ele não destrói completamente a afinidade pelo

operador, mas em vez disso, reduz a afinidade em 110 vezes. Adicionalmente, na

medida em que as células se dividem e novos operadores são produzidos pela síntese

de filamentos-filhos, o repressor deve encontrar os novos operadores por meio da

busca ao longo do DNA, ligando-se rapidamente a sequências não operadoras e se

dissociando delas.)

19. Determinadas mutações lacI eliminam a ligação do operador ao repressor Lac, mas

não afetam a agregação de subunidades para a produção de um tetrâmero, a forma

ativa do repressor. Essas mutações são parcialmente dominantes em relação ao tipo

selvagem. Você pode explicar o fenótipo I— parcialmente dominante dos

heterodiploides I—/I+?

20. Você está examinando a regulação do óperon da lactose na bactéria Escherichia coli.

Você isola sete novas linhagens mutantes independentes que não apresentam os

produtos de todos os três genes estruturais. Você suspeita que algumas dessas

mutações são lacIS e que outras mutações são alterações que evitam a ligação da RNA

polimerase à região promotora. Com a utilização de quaisquer genótipos haploides e

diploides parciais que você considere necessários, descreva um conjunto de genótipos

que permitirá que você diferencie entre as classes lacI e lacP de mutações não

indutíveis.

21. Você está estudando as propriedades de um novo tipo de mutação reguladora do

óperon da lactose. Essa mutação, denominada S, leva à repressão completa dos genes

lacZ, lacY e lacA, independentemente da presença da lactose. Os resultados dos

estudos dessa mutação em diploides parciais demonstram que essa mutação é

completamente dominante sobre o tipo selvagem. Quando você trata bactérias da

linhagem mutante S com um mutágeno e seleciona bactérias mutantes que conseguem

expressar as enzimas codificadas pelos genes lacZ, lacY e lacA na presença da lactose,

algumas mutações mapeiam na região do operador lac e outras para o gene repressor

do lac. Com base no seu conhecimento sobre o óperon da lactose, forneça uma

explicação genética molecular para todas essas propriedades da mutação S. Inclua

uma explicação sobre a natureza constitutiva das “mutações reversas”. 22. O óperon trp na E. coli codifica enzimas essenciais para a biossíntese do triptofano. O

mecanismo geral para o controle do óperon trp é semelhante àquele observado com o

óperon lac: quando o repressor se liga ao operador, a transcrição é evitada; quando o

repressor não se liga (ao operador), a transcrição prossegue. A regulação do óperon

trp difere da regulação do óperon lac da seguinte maneira: as enzimas codificadas

pelo óperon trp não são sintetizadas quando o triptofano está presente, mas sim ___________________

ausente. No óperon trp, o repressor apresenta dois sítios de ligação: um para o DNA e

o outro para a molécula efetora, o triptofano. O repressor trp deve primeiramente se

ligar a uma molécula de triptofano antes que possa efetivamente se ligar ao operador

trp.

a. Desenhe um mapa do óperon do triptofano, indicando o promotor (P), o operador

(O) e o primeiro gene estrutural do óperon do triptofano (trpA). No seu desenho,

indique onde no DNA a proteína repressora se liga quando está ligada ao triptofano.

b. O gene trpR codifica o repressor; trpO é o operador; trpA codifica a enzima

triptofano sintetase. Um repressor trpR— não consegue se ligar ao triptofano, um

operador trpO— não consegue se ligar ao repressor, e a enzima codificada por um gene

mutante trpA— é completamente inativa. Você espera encontrar uma triptofano

sintetase ativa em cada uma das linhagens mutantes a seguir quando as células são

cultivadas na presença de triptofano? Na sua ausência?

(1) R+ O+ A+ (tipo selvagem)

(2) R— O+ A+/R+ O+ A—

(3) R+ O— A+/R+ O+ A—

23. É medida a atividade da enzima β-galactosidase produzida por células do tipo

selvagem cultivadas em meio suplementado com diferentes fontes de carbono. Em

unidades relativas, são observados os níveis de atividade a seguir:

 

Glicose Lactose Lactose + glicose

 

0 100 1

 

Preveja os níveis relativos de atividade da β-galactosidase em células cultivadas sob

condições semelhantes quando as células são lacI—, lacIS, lacO+ e crp—. 24. Observa-se que um bacteriófago λ é capaz de lisogenizar sua E. coli hospedeira a

30°C, mas não a 42°C. Quais genes podem ser mutantes nesse fago? 25. O que aconteceria com a capacidade do bacteriófago λ de lisar uma célula hospedeira

se ela adquirisse uma mutação no sítio de ligação OR em relação à proteína Cro? Por

quê?

26. Contraste os efeitos das mutações nos genes que codificam os fatores σ de

esporulação específica com as mutações nas regiões —35 e —10 dos promotores de

genes em seus regulons.

a. As mutações funcionais nos genes do fator σ ou nos promotores individuais

apresentariam o maior efeito sobre a esporulação?

b. Com base nas sequências demonstradas na Figura 11.30 B, você esperaria que

todas as mutações de ponto nas regiões —35 ou —10 afetassem a expressão gênica?

1 F. Jacob, The Statue Within: An Autobiography, 1988.

2 H. F. Judson, The Eight Day of Creation: Makers of the Revolution in Biology, 1979.

3 F. Jacob e J. Monod, Cold Spring Harbor Quant. Symp. Biol. 26, 1963, 393.

 

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