Mapeamento de cromossomos bacterianos

O ciclo de conjugação de E. coli está resumido na Figura 5.15.

Mapeamento de cromossomos bacterianos

Mapeamento cromossômico geral por meio da utilização do tempo de entrada. Wollman e Jacob perceberam que seria fácil a construção de mapas de ligação a partir dos resultados de cruzamento interrompido por meio da utilização, como uma medida de “distância”, dos tempos nos quais os alelos doadores aparecem pela primeira vez após o cruzamento. As unidades de distância de mapa nesse caso são minutos. Portanto, se b+ começa a entrar na célula F— 10 minutos após a+ começar a entrar, a+ e b+ estão a uma distância de 10 unidades (ver mapa, anteriormente). Assim como os mapas eucarióticos com base em crossovers, esses mapas de ligação eram originalmente construções puramente genéticas. Na ocasião em que foram originalmente planejados, não havia um modo para testar a sua base física.

Mapeamento cromossômico detalhado por meio da utilização da frequência de recombinantes. Para que um exconjugante adquira genes doadores como uma característica permanente do seu genoma, o fragmento doador precisa se recombinar com o cromossomo receptor. Entretanto, observe que o mapeamento do tempo de entrada não tem por base a frequência de recombinantes. De fato, as unidades são minutos, não FR. Não obstante, a frequência de recombinantes pode ser utilizada para um tipo de mapeamento mais meticuloso em bactérias, um método para o qual nos voltamos agora.

FIGURA 5.13 A inserção de F cria uma célula Hfr. Os marcadores hipotéticos 1 e 2 estão demonstrados em F para ilustrar a direção da inserção. A origem (O) é o ponto de mobilização no qual ocorre a inserção dentro do cromossomo de E. coli; a região de pareamento é homóloga a uma região do cromossomo de E. coli; a a d são genes representativos no cromossomo de E. coli. As regiões de pareamento (hachuradas) são idênticas no plasmídio e no cromossomo. Elas são derivadas de elementos móveis

denominados sequências de inserção (ver Capítulo 15). Neste exemplo, a célula Hfr criada pela inserção de F transferiria os seus genes na ordem a, d, c, b.

FIGURA 5.14 Cada uma das cinco linhagens Hfr de E. coli demonstradas apresentam diferentes pontos de inserção do plasmídio F e orientações. Todas as linhagens apresentam a mesma ordem de genes no cromossomo de E. coli. A orientação do fator F determina qual gene entra na célula receptora primeiro. O gene mais próximo do término entra por último.

FIGURA 5.15 A conjugação pode ocorrer por meio da transferência parcial de um cromossomo que contém o fator F ou por meio da transferência de um plasmídio F que permanece uma entidade em separado.

FIGURA 5.16 Um crossover único entre o exogenoto e o endogenoto em um merozigoto levaria a um cromossomo linear e parcialmente diploide, que não sobreviveria.

Primeiramente, precisamos compreender algumas características

especiais do evento de recombinação em bactérias. Relembre que a recombinação não ocorre entre dois genomas integrais, como ocorre em eucariotos. Contrariamente, ele ocorre entre um genoma completo, da célula receptora F—, denominado endogenoto, e um genoma incompleto, derivado da célula doadora Hfr e denominado exogenoto. A célula nesse estágio apresenta duas cópias de um segmento de DNA: uma cópia é parte do endogenoto e a outra cópia é parte do exogenoto. Portanto, nesse estágio, a célula é uma diploide parcial, denominada merozigoto. A genética bacteriana é a genética do merozigoto. Um crossover único em um merozigoto quebraria o anel e, portanto, não produziria recombinantes

viáveis, conforme demonstrado na Figura 5.16. Para manter o círculo intacto, deve haver um número par de crossovers. Um número par de crossovers produz um cromossomo circular intacto e um fragmento. Embora os referidos eventos de recombinação sejam representados de modo resumido como crossovers duplos, o real mecanismo molecular é um pouco diferente, mais como uma invasão do endogenoto por uma seção interna do exogenoto. O outro produto do “crossover duplo”, o fragmento, em geral é perdido no crescimento celular subsequente. Portanto, apenas um dos produtos recíprocos da recombinação sobrevive. Portanto, outra característica única da recombinação bacteriana é que devemos nos esquecer dos produtos de troca recíproca na maior parte dos casos.

CONCEITO-CHAVE A recombinação durante a conjugação resulta de um evento semelhante a

um crossover duplo, que dá origem a recombinantes recíprocos, dos quais apenas um

sobrevive.

Com essa compreensão, podemos examinar o mapeamento de

recombinação. Suponha que desejamos calcular as distâncias de mapa que separam três loci próximos: met, arg e leu. Para examinar a recombinação desses genes, precisamos de “tri-híbridos”, exconjugantes que receberam todos os três marcadores doadores. Presuma que um experimento de cruzamento interrompido tenha demonstrado que a ordem é met, arg, leu, com met transferido primeiro e leu por último. Para obter um tri-híbrido, precisamos do merozigoto diagramado aqui:

Para obter esse merozigoto, primeiramente devemos selecionar exconjugantes estáveis que contenham o último alelo doador, o qual, nesse caso, é leu+. Por quê? Em exconjugantes leu+, sabemos que todos os três marcadores foram transferidos para o receptor, tendo em vista que leu é o último alelo doador. Também sabemos que no mínimo o marcador leu+ foi integrado ao endogenoto. Desejamos saber com que frequência os outros dois marcadores também foram integrados, de modo que possamos determinar o número de eventos de recombinação nos quais arg+ ou met+ tenha sido omitido em virtude de crossover duplo.

Agora o objetivo é contar as frequências de crossovers em locais

diferentes. Observe que agora temos uma situação diferente da análise de conjugação interrompida. No mapeamento por meio de conjugação interrompida, medimos o tempo de entrada de loci individuais; para ser herdado de modo estável, cada marcador tem de se recombinar com o cromossomo do receptor por meio de um crossover duplo que o abranja. Entretanto, na análise da frequência de recombinantes, selecionamos especificamente tri-híbridos como um ponto de partida e agora precisamos considerar as diversas combinações possíveis dos três alelos doadores que podem ser inseridos por meio de crossover duplo nos diversos intervalos. Sabemos que leu+ necessariamente penetrou e se inseriu pois o selecionamos, mas os recombinantes leu+ que selecionamos podem ou não ter incorporado os outros marcadores doadores, dependendo de onde ocorreu o crossover duplo. Portanto, o procedimento é primeiramente selecionar exconjugantes leu+ e em seguida isolar e testar uma amostra grande deles, para verificar quais dos outros marcadores foram integrados.

Vejamos um exemplo. No cruzamento Hfr leu+ arg+ met+ strs × F— met—

arg— leu— strr, selecionaríamos os recombinantes leu+ e em seguida os examinaríamos em relação aos alelos arg+ e met+, denominados

marcadores não selecionados. A Figura 5.17 ilustra os tipos de eventos de crossover duplo esperados. Um crossover necessariamente ocorreu no lado esquerdo do marcador leu e o outro obrigatoriamente ocorreu no lado direito. Presumiremos que os exconjugantes leu+ sejam dos tipos e das frequências a seguir:

leu+ arg— met— 4%

leu+ arg+ met— 9%

leu+ arg+ met+ 87%

Os crossovers duplos necessários para produzir esses genótipos estão

demonstrados na Figura 5.17. Os primeiros dois tipos são a chave, tendo em vista que necessitam de um crossover entre leu e arg no primeiro caso e entre arg e met no segundo. Portanto, as frequências relativas desses tipos correspondem aos tamanhos dessas duas regiões entre os genes. Concluiríamos que a região de leu a arg tem 4 u.m. e que a região de arg a met tem 9. u.m.

FIGURA 5.17 O diagrama demonstra como genes podem ser mapeados por meio de recombinação em E. coli. Em exconjugantes, a seleção é realizada em relação a merozigotos que contenham o marcador + leu, que é doado tardiamente. Os marcadores iniciais ( + + arg e met) podem ou não ser inseridos, dependendo do sítio onde ocorre a recombinação entre o fragmento Hfr e o cromossomo F —. As frequências dos eventos diagramados nas partes a e b são utilizadas para obter os tamanhos relativos das regiões de leu a arg e arg a met. Observe que, em cada caso, apenas o DNA inserido no cromossomo F— sobrevive; o outro fragmento é perdido.

Em um cruzamento tal como o descrito há pouco, um tipo de possíveis

recombinantes de genótipo leu+ arg— met+ requer quatro crossovers em vez

de dois (ver parte inferior da Figura 5.17). Esses recombinantes raramente são recuperados, tendo em vista que a sua frequência é muito baixa em comparação àquela dos outros tipos de recombinantes.