Introdução à Genética
Análise de recombinação com a utilização de marcadores moleculares
Marcadores microssatélite. Um marcador microssatélite tem por base números variáveis de repetições em tandem de uma sequência ainda mais simples, em geral um pequeno número de nucleotídios, tal como um dinucleotídio. O tipo mais comum é uma repetição de CA e do seu complemento GT, como no exemplo a seguir:
5' C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A 3'
3' G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T 5'
Detecção de polimorfismos de comprimento de
sequência simples
Os polimorfismos de comprimento de sequência simples são detectados aproveitando-se da vantagem de que regiões homólogas que contêm números diferentes de repetições em tandem serão de diferentes comprimentos. Um procedimento comumente utilizado para revelar essas diferenças é utilizar as regiões
flanqueadoras como primers em uma análise de PCR (ver Capítulo 10). A PCR replica as sequências de DNA até que elas estejam disponíveis em quantidade suficiente para análises adicionais. Os diferentes comprimentos dos produtos amplificados pela PCR podem ser detectados por meio das diferentes mobilidades das sequências em um gel de eletroforese. No caso dos minissatélites, os padrões produzidos no gel por vezes são denominados impressões digitais do DNA. (Tais impressões digitais são altamente individualizadas e, portanto, apresentam grande
valor para a ciência forense, conforme detalhado no Capítulo 18.)
Análise de recombinação com a utilização de marcadores moleculares
Quando mapeamos a posição de um gene cujos fenótipos são determinados pela diferença de um único nucleotídio, estamos efetivamente mapeando um SNP. A mesma técnica utilizada para mapear os loci gênicos também pode ser utilizada para mapear os SNP que não determinam um fenótipo.
Suponha que um indivíduo apresente um par de bases GC, digamos, na posição
5.658 no DNA de um cromossomo e um AT na posição 5.658 no outro cromossomo. Um referido indivíduo é um heterozigoto molecular (“AT/GC”) em relação àquela posição do DNA. Esse fato é útil para o mapeamento, tendo em vista que um heterozigoto molecular (“AT/GC”) pode ser mapeado justamente do mesmo modo que um heterozigoto fenotípico A/a. O locus de um heterozigoto molecular pode ser inserido em um mapa cromossômico por meio da análise da frequência de recombinação exatamente do mesmo modo como é inserido o locus de alelos heterozigotos “fenotípicos”. Esse princípio é mantido ainda que a variação normalmente seja uma diferença silenciosa (talvez não em um gene).
Atuando como importantes “marcos” no mapa, os marcadores moleculares são
úteis para orientar o pesquisador em uma investigação para encontrar um gene de interesse. Para compreender esse ponto, considere os marcos reais: eles são de pouco interesse por si próprios, mas são muito úteis para lhe informar quão próximo você se encontra do seu destino. Em um exemplo genético específico, presumiremos que desejamos conhecer a posição no mapa de um gene de doença em camundongos, talvez como um modo de detectá-lo em sua sequência de DNA. Realizamos uma diversidade de cruzamentos. Em cada um dos casos, cruzamos um indivíduo portador do gene da doença com um indivíduo que carreia um de uma gama de diferentes marcadores moleculares, cujas posições no mapa já são conhecidas. Com a utilização da PCR, os genitores e a progênie são classificados em relação aos marcadores moleculares de posição no mapa conhecida e, em seguida, é realizada a análise de recombinação para verificar se o gene de interesse está ligado a qualquer um deles. O resultado desses cruzamentos pode revelar que o gene da doença está à distância de 2 u.m. de um desses marcadores, que denominaremos M. Portanto, o procedimento nos forneceu uma localização aproximada do gene da doença no cromossomo. A localização do gene da doença humana fibrose cística foi originalmente descoberta por meio da sua ligação com marcadores moleculares que se sabia estarem localizados no cromossomo 7. Essa descoberta levou ao isolamento e ao sequenciamento do gene, resultando na descoberta adicional de que ele codifica a proteína atualmente denominada reguladora de condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR; do inglês, cystic fibrosis transmembrane condutance regulator). O gene da doença de Huntington também foi localizado desse modo, levando à descoberta de que ele codifica uma proteína muscular denominada huntingtina.
O procedimento experimental em relação a um exemplo hipotético pode ser como
segue. Considere que A e a sejam os alelos do gene da doença e M1 e M2 sejam os alelos de um locus de marcador molecular específico. Presuma que o cruzamento é A/a · M1/M2 × a/a · M1/M1, um tipo de cruzamento-teste. A progênie seria classificada primeiramente em relação aos fenótipos A e a, e em seguida o DNA seria extraído de cada indivíduo e sequenciado, ou de outro modo avaliado, a fim de determinar os alelos moleculares. Presuma que obtemos os resultados a seguir:
A/a · M1/M1 49% A/a · M2/M1 1% a/a · M2/M1 49% a/a · M1/M1 1%
Esses resultados nos informam que o cruzamento-teste tem obrigatoriamente a conformação a seguir:
A M1/a M2 × a M1/a M1
e os dois genótipos da progênie à direita na lista têm de ser recombinantes, fornecendo uma distância de mapa de 2 u.m. entre o locus A/a e o locus molecular M1/M2. Portanto, agora sabemos a localização geral do gene no genoma e podemos estreitar ainda mais a sua localização com abordagens mais meticulosas. Além disso, diferentes marcadores moleculares podem ser mapeados entre si, criando-se um mapa que pode atuar como uma série de trampolins no caminho até algum gene com um fenótipo de interesse.
Embora o mapeamento de marcadores moleculares com a utilização do que
efetivamente são cruzamentos-teste seja o tipo mais simples de análise informativa, em muitas análises (tais como aquelas em seres humanos) os marcadores moleculares não podem ser mapeados com a utilização de um cruzamento-teste. Entretanto, tendo em vista que cada alelo molecular apresenta a sua própria assinatura, os produtos recombinantes e não recombinantes podem ser identificados a partir de qualquer meiose, até mesmo em cruzamentos que não são cruzamentos-
teste. Uma referida análise está diagramada na Figura 4.14.