15.3 Elementos de transposição em eucariotos

CONCEITO-CHAVE Em procariotos, a transposição ocorre por meio de no mínimo duas vias

diferentes. Alguns elementos de transposição podem replicar uma cópia do elemento em um

sítio-alvo, deixando uma cópia para trás no sítio original. Em outros casos, a transposição

consiste na excisão direta do elemento e pela sua reinserção dentro em um novo sítio.

15.3 Elementos de transposição em eucariotos

Embora os elementos de transposição tenham sido primeiro descobertos em milho, os primeiros elementos eucarióticos a ser caracterizados no nível molecular foram isolados a partir de genes mutantes de levedura e Drosophila. Os elementos de transposição eucarióticos estão situados em duas classes: classe 1 de retrotranspósons e classe 2 de transpósons de DNA. A primeira classe a ser isolada, os retrotranspósons, absolutamente não se assemelha aos elementos IS procarióticos e aos elementos de transposição.

Classe 1 | Retrotranspósons

O laboratório de Gerry Fink estava entre os primeiros a utilizar levedura como um organismo-modelo para estudar a regulação gênica eucariótica. Durante anos, ele e seus colegas isolaram milhares de mutações no gene HIS4, que codifica uma das enzimas na via que leva à síntese do aminoácido histidina.

Eles isolaram mais de 1.500 mutantes espontâneos HIS4 e observaram

que dois deles apresentavam um fenótipo mutante instável. Os mutantes instáveis (denominados pseudorrevertentes) apresentavam 1.000 vezes mais probabilidade de reverterem para um fenótipo semelhante ao tipo selvagem do que os outros mutantes HIS4. Simbolicamente, dizemos que esses mutantes instáveis reverteram de His— para His+ (os tipos selvagens apresentam um sinal de mais sobrescrito, enquanto os mutantes apresentam um sinal de menos sobrescrito). Assim como os mutantes gal— de E. coli, observou-se que esses mutantes de levedura abrigam uma grande inserção de DNA no gene HIS4. Observou-se que a inserção é muito semelhante àquela de um grupo de elementos de transposição já caracterizados em leveduras, denominados elementos Ty. Existem, de fato, aproximadamente 35 cópias do elemento inserido, denominado Ty1, no genoma de levedura.

A clonagem dos elementos desses alelos mutantes levou à descoberta

surpreendente de que as inserções absolutamente não se assemelhavam aos elementos IS bacterianos ou transpósons. Em vez disso, elas se assemelhavam a uma classe bem-caracterizada de vírus de animais, denominados retrovírus. Um retrovírus é um vírus de RNA unifilamentar que emprega um DNA bifilamentar intermediário para replicação. O RNA é copiado em DNA pela enzima transcriptase reversa. O DNA bifilamentar é integrado aos cromossomos hospedeiros, a partir dos quais ele é transcrito para produzir o genoma de RNA viral e as proteínas que formam novas partículas virais. Quando integrada aos cromossomos hospedeiros como DNA bifilamentar, a cópia de DNA bifilamentar do genoma retroviral é denominada provírus. O ciclo de vida de um retrovírus típico está

demonstrado na Figura 15.11. Alguns retrovírus, tais como o vírus do tumor mamário de camundongos (MMTV) e o vírus do sarcoma de Rous (RSV), são responsáveis pela indução de tumores cancerosos. Em relação ao MMTV, isso ocorre quando ele se insere aleatoriamente no genoma próximo de um gene cuja expressão alterada leva ao câncer.

A Figura 15.12 demonstra a semelhança na estrutura e no conteúdo

gênico de um retrovírus e o elemento Ty1 isolado a partir dos mutantes HIS4. Ambos são flanqueados por sequências de longa repetição terminal (LTR) que apresentam diversas centenas de pares de bases de comprimento. Os retrovírus codificam no mínimo três proteínas que participam na replicação viral: os produtos dos genes gag, pol e env. A proteína codificada por gag apresenta um papel na maturação do genoma de RNA, pol codifica a importante transcriptase reversa e env codifica a proteína estrutural que circunda o vírus. Essa proteína é necessária para que o vírus saia da célula para infectar outras células. Curiosamente, os elementos Ty1 apresentam genes relacionados com gal e pol, mas não com env. Essas características levaram à hipótese de que, assim como os retrovírus, os elementos Ty1 são transcritos em RNA que são copiados em DNA bifilamentar pela transcriptase reversa. Entretanto, contrariamente aos retrovírus, os elementos Ty1 não conseguem deixar a célula, tendo em vista que não codificam env. Em vez disso, as cópias de DNA bifilamentar são inseridas de volta no genoma da mesma célula. Essas etapas estão

diagramadas na Figura 15.13.

FIGURA 15.11 O genoma de RNA do retrovírus sofre transcrição reversa em DNA bifilamentar dentro da célula hospedeira.

FIGURA 15.12 Comparação estrutural de um retrovírus com retrotranspósons observados em genomas eucarióticos. A. Um retrovírus, vírus da leucemia murina Moloney (MoMLV), de camundongos. B. Um retrotranspóson, Ty1, em levedura. C. Um retrotranspóson, copia, em Drosophila. D. Um elemento longo intercalado (LINE) em seres humanos. Abreviações: LTR = Longa repetição terminal; ORF = Matriz de leitura aberta.

Em 1985, David Garfinkel, Jef Boeke e Gerald Fink demonstraram que,

assim como os retrovírus, os elementos Ty de fato são transpostos por meio

de um RNA intermediário. A Figura 15.14 diagrama o desenho experimental desenvolvido por eles. Eles iniciaram com a alteração de um elemento Ty1 de levedura, clonado em um plasmídio. Primeiramente, perto de uma extremidade de um elemento, eles inseriram um promotor que pode ser ativado pela adição de galactose ao meio. Em segundo lugar, eles introduziram um íntron de outro gene de levedura na região codificadora do transpóson Ty.

A adição de galactose aumenta muito a frequência de transposição do

elemento Ty alterado. Esse aumento na frequência sugere a participação de RNA, tendo em vista que a galactose estimula a transcrição do DNA Ty em RNA, com início no promotor sensível à galactose. O resultado experimental-chave, entretanto, é o destino do DNA Ty transposto. Os pesquisadores observaram que o íntron havia sido removido do DNA Ty transposto. Tendo em vista que os íntrons são recompostos apenas no

período do processamento de RNA (ver Capítulo 8), o DNA Ty transposto deve ter sido copiado a partir de um RNA intermediário. A conclusão foi que o RNA é transcrito a partir do elemento Ty original e recomposto. O mRNA recomposto sofre transcrição reversa de volta ao DNA bifilamentar, que em seguida é integrado ao cromossomo de levedura. Os elementos de transposição que empregam a transcriptase reversa para transpor por meio de um RNA intermediário são denominados retrotranspósons. Eles também são conhecidos como elementos de transposição da classe 1. Retrotranspósons tais como Ty1, que apresentam longas repetições terminais em suas extremidades, são denominados retrotranspósons LTR e o mecanismo que eles utilizam para a transposição é denominado “cópia e colagem”, o que os diferencia do mecanismo de corte e colagem que caracteriza a maior parte dos elementos de transposição de DNA.

FIGURA 15.13 Um transcrito de RNA do retrotranspóson sofre transcrição reversa em DNA, por meio de uma transcriptase reversa codificada pelo retrotranspóson. A cópia de DNA é inserida em um novo local no genoma.

Também foi demonstrado que diversas mutações espontâneas isoladas ao

longo dos anos em Drosophila também contêm inserções de retrotranspósons. Os elementos tipo copia de Drosophila são estruturalmente semelhantes aos elementos Ty1 e aparecem em 10 a 100

posições no genoma de Drosophila (ver Figura 15.12 C). Determinadas mutações clássicas de Drosophila resultam da inserção de tipo copia de outros elementos. Por exemplo, a mutação white-apricot (wa) para cor de olho é causada pela inserção de um elemento da família copia no locus white. A inserção de retrotranspósons LTR em genes de plantas (incluindo o milho) também demonstrou contribuir para mutações espontâneas nesse reino.

FIGURA 15.14 Um elemento Ty é alterado por meio da adição de um íntron e um promotor que pode ser ativado pela adição de galactose. A sequência do íntron é removida antes da transcrição reversa.

Antes de deixarmos os retrotranspósons (retornaremos a eles

posteriormente neste capítulo), existe uma questão que precisa ser respondida. Relembre que o primeiro retrotranspóson LTR foi descoberto em uma linhagem His— instável de levedura que com frequência revertia para His+. Entretanto, acabamos de ver que os retrotranspósons LTR, contrariamente à maior parte dos elementos de transposição de DNA, não são excisados quando transpostos. O que, então, é responsável pelo aumento de aproximadamente 1.000 vezes na frequência de reversão desse alelo quando comparado a outros alelos His—? A resposta está demonstrada

na Figura 15.15, a qual demonstra que o elemento Ty1 no alelo His— está localizado na região promotora do gene His, onde ele impede a transcrição gênica. Contrariamente, os revertentes contêm uma única cópia do LTR, denominada LTR solo. Essa inserção muito menor não interfere na transcrição do gene His. O LTR solo é produto da recombinação entre LTR

idênticos, que resulta na deleção do restante do elemento (ver Capítulos 4 e

16 para mais sobre recombinação). Os LTR solo são uma característica muito comum nos genomas de virtualmente todos os eucariotos, indicando a importância desse processo. O genoma de levedura sequenciado contém mais de cinco vezes mais LTR solo do que elementos Ty1 completos.