Introdução à Genética
Método básico
Ao longo da última década, os avanços nas tecnologias genômicas catalisaram a aplicação
em ampla escala do mapeamento de associação. Em particular, o mapeamento de associação foi revolucionado por meio do desenvolvimento de mapas de SNP do genoma inteiro e das tecnologias de genotipagem de alta produção, que possibilitam a identificação de centenas de
milhares de SNP em dezenas de milhares de indivíduos (ver Capítulo 18). O mapeamento de associação atualmente é utilizado de modo rotineiro para realizar a varredura do genoma inteiro em relação aos genes que contribuem para a variação quantitativa. Esse tipo de estudo é conhecido como estudo de associação ampla do genoma (estudo de GWA ou GWAS). Uma vantagem importante dos estudos de GWA é que os genes candidatos não são necessários, uma vez que é realizada a varredura de todos os genes no genoma.
O mapeamento de associação oferece diversas vantagens sobre o mapeamento de QTL.
Primeiramente, tendo em vista que ele é realizado com populações de cruzamento aleatório, não há necessidade de realizar cruzamentos controlados ou de trabalhar com famílias humanas com relações de genitores e descendência conhecidas. Em segundo lugar, ele testa muitos alelos em um locus de uma vez. Nos estudos de mapeamento de QTL, existem dois genitores (tomates Beefmaster e Sungold no exemplo anterior) e, assim, apenas dois alelos estão sendo comparados. Com o mapeamento de associação, todos os alelos na população estão sendo analisados ao mesmo tempo. Finalmente, o mapeamento de associação pode levar à identificação direta dos genes no QTL sem a necessidade de estudos de mapeamento fino subsequentes. Isso é possível porque os SNP em qualquer gene que influencia o traço demonstrarão associações mais fortes com o traço do que os SNP em outros genes. Vejamos como isso funciona.
Método básico
Iniciaremos observando como a variação genética é padronizada no genoma em uma
população. No Capítulo 18, discutimos o desequilíbrio de ligação (LD) ou a associação não
aleatória de alelos em dois loci. A Figura 19.17 demonstra como o LD poderia aparecer entre uma amostra de cromossomos de 18 indivíduos diferentes. Os SNP (ou outros polimorfismos) que estão próximos entre si tendem a estar em forte desequilíbrio, enquanto aqueles que estão mais distantes estão em desequilíbrio fraco ou nenhum desequilíbrio. Os genomas também tendem a apresentar hotspots de recombinação, pontos nos quais o crossing over ocorre a uma alta frequência. Os hotspots rompem o desequilíbrio de ligação de tal modo que os SNP em qualquer lado do hotspot estão em equilíbrio entre si. Os SNP que não estão separados por um hotspot formam um bloco de haplótipo de SNPs fortemente correlacionados.
Suponha que o SNP8 na Figura 19.17 seja um SNP em um gene que causa uma diferença no
fenótipo, de tal modo que os indivíduos com o genótipo A/A apresentam um fenótipo diferente daqueles com A/G ou G/G. O SNP8 poderia afetar o fenótipo ao causar uma troca de aminoácido ou afetar a expressão gênica. O SNP8 ou quaisquer SNP que afetem diretamente um fenótipo são denominados SNP funcionais. Tendo em vista que o SNP8 está em um forte desequilíbrio com outros SNP no bloco (SNP 6, 7, 9 e 10), qualquer um desses outros SNP pode atuar como um substituto do SNP8 funcional. Os indivíduos que são T/T no SNP7 apresentarão o mesmo fenótipo daqueles que são A/A no SNP8, tendo em vista que o SNP7 e o SNP8 estão em LD. Quando os genótipos de SNP estão correlacionados (em desequilíbrio), o valor de traço estará então correlacionado. Por esse motivo, os estudos de GWA não precisam analisar os SNP funcionais reais, mas precisam apresentar os SNP em cada bloco de haplótipo.
Para conduzir um estudo de GWA em relação a uma condição de doença em seres humanos,
podemos analisar 2.000 indivíduos com um distúrbio, tal como o diabetes melito com início em adultos ou tipo 2. Também poderíamos selecionar outros 2.000 indivíduos de controle que não apresentam esse distúrbio. Cada um dos 4.000 participantes doaria sangue, a partir do qual o seu DNA seria extraído. As amostras de DNA seriam genotipadas em relação a um conjunto de 300.000 SNP que estão distribuídos por todo o genoma. Desejamos um número de SNP suficiente, de tal modo que cada um dos blocos de haplótipo no genoma seja marcado por um
ou mais SNP (ver Figura 19.17). O conjunto de dados resultante seria enorme – composto por 300.000 genótipos em 4.000 indivíduos – um total de 1,2 bilhão de pontos de dados. Uma
pequena parte de tal conjunto de dados está demonstrada na Tabela 19.8.
Após a montagem dos dados, o pesquisador realiza um teste estatístico em cada SNP para
determinar se um de seus alelos está mais frequentemente associado ao diabetes do que o esperado ao acaso. No caso de um traço categórico, tal como ser “afetado” ou “não afetado”
pelo diabetes, podem ser utilizados testes estatísticos semelhantes ao teste do χ² (ver Capítulo
3). Um teste estatístico é realizado em separado em cada SNP e os valores P são inseridos em um gráfico ao longo do cromossomo. A hipótese nula é que o SNP não está associado ao traço. Se o valor P em relação a um SNP for inferior a 0,05, então a evidência em relação à hipótese nula é fraca e favoreceremos a hipótese alternativa de que os diferentes genótipos no SNP estão associados a diferentes fenótipos do traço. O mapeamento de associação realmente não comprova que um gene ou um SNP em um gene afete um traço. Ele apenas fornece evidências estatísticas em relação a uma associação entre o SNP e o traço. A comprovação requer a caracterização molecular do gene e de seus diferentes alelos.
FIGURA 19.17 (Parte superior) Diagrama da distribuição de SNP e haplótipos em relação a um segmento cromossômico de 18 indivíduos. Os haplótipos com frequência ocorrem em blocos (regiões de recombinação mais baixa), separados uns dos outros por hotspots de recombinação (diferentes cores indicam os blocos de haplótipos). (A coluna de S e D à direta são para o Problema 19.4.) O SNP8 (negrito) controla uma diferença nos valores de traço. (Parte inferior) Você consegue dizer se dois SNP demonstram desequilíbrio ao observar a cor do quadrado onde as linhas dos marcadores apresentam intersecção. Em um bloco de haplótipo, os SNP demonstram forte desequilíbrio. Os SNP em diferentes blocos de haplótipos demonstram desequilíbrio fraco ou nenhum desequilíbrio. (Dados de David Altshuler et al., Science 322, 2008, 881-888.)
A Figura 19.18 A demonstra os resultados de um estudo de mapeamento de associação em
relação ao tamanho corporal em cães. Cada ponto inserido em gráfico ao longo dos cromossomos (eixo x) representa o valor P (eixo y) em relação a um teste de associação entre o tamanho corporal e um SNP. Os valores P são inseridos em gráfico com a utilização de uma escala inversa, de tal modo que quanto mais alto no eixo x, menor o valor. No cromossomo 15, existe um aglomerado de SNP acima da linha do limiar, indicando que a hipótese nula de nenhuma associação pode ser rejeitada em relação a esses SNP, em favor da hipótese alternativa de que um gene que afeta o tamanho corporal em cães está localizado nessa posição. O pico forte no cromossomo 15 envolve SNP no gene do fator de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1), um gene que codifica um hormônio envolvido no crescimento juvenil em mamíferos. Esse gene é o principal contribuinte para a diferença no tamanho entre raças pequenas e grandes
de cães (Figura 19.18 B).
Tabela 19.8 Parte de um conjunto de dados simulados para um experimento de mapeamento de associação.
Indivíduo SNP1 SNP2 SNP3 Diabetes Altura (cm)
tipo 2
1 C/C A/G T/T sim 173
2 C/C A/A C/C sim 170
3 C/G G/G T/T não 183
4 C/G G/G C/T não 180
5 C/C G/G C/T não 173
6 G/G A/G C/T sim 178
7 G/G A/G C/T não 163
8 C/G G/G C/T não 168
9 C/G A/G C/T sim 165
10 G/G A/A C/C sim 157