Introdução à Genética
A reação da cadeia de polimerase amplifica regiões selecionadas do DNA in vitro
CONCEITO-CHAVE O DNA genômico pode ser utilizado diretamente para a clonagem de genes.
Como primeira etapa, as enzimas de restrição cortam o DNA em fragmentos de tamanho
manuseável, e muitas delas geram extremidades coesivas uni lamentares adequadas para a
produção do DNA recombinante.
A reação da cadeia de polimerase amplifica regiões
selecionadas do DNA in vitro
Se nos esforçássemos para clonar o gene da insulina humana hoje, armados com a sequência genômica humana, o conhecimento do gene e das sequências flanqueadoras nos possibilitaria utilizar um método mais direto. Atualmente, podemos simplesmente amplificar o gene in vitro por meio da utilização da reação da cadeia de polimerase (PCR). A estratégia básica da
PCR está resumida na Figura 10.3. O processo utiliza múltiplas cópias de um par de primers de DNA curtos quimicamente sintetizados, com comprimento de aproximadamente 20 bases, desenhados de modo que cada primer se ligue a uma extremidade do gene ou da região a ser amplificada. Os dois primers se ligam a filamentos de DNA opostos que circundam a sequência-alvo, com suas extremidades 3′ apontando uma em direção à outra. As DNA polimerases adicionam bases às extremidades 3′ desses primers e copiam a sequência-alvo. A repetição do processo de polimerização produz um número exponencialmente crescente de moléculas de DNA bifilamentares. Os detalhes são como segue.
Iniciamos com uma solução que contém a fonte de DNA, os primers, os
quatro desoxirribonucleotídios trifosfato (necessários para a síntese de
DNA; ver Figura 7.15) e uma DNA polimerase tolerante ao calor. O DNA-alvo é desnaturado pelo calor (95°C), resultando em moléculas de DNA unifilamentares. Quando a solução é resfriada (entre 50 e 65°C), os primers hibridizam (ou pareiam) com suas sequências complementares nas moléculas de DNA unifilamentares. Após a temperatura ser elevada até 72°C, a DNA polimerase termoestável replica os segmentos unifilamentares de DNA que se estendem a partir de um primer. A DNA polimerase Taq, da bactéria Thermus aquaticus, é uma enzima comumente utilizada. (Para sobreviver no calor extremo das fontes hidrotermais, essa bactéria desenvolveu proteínas que são extremamente resistentes ao calor. Portanto, sua DNA polimerase sobrevive a altas temperaturas necessárias para desnaturar a dupla-hélice de DNA, que desnaturariam e inativariam a DNA polimerase da maior parte das outras espécies.) Novos filamentos complementares são sintetizados assim como na replicação normal do DNA nas células, formando duas moléculas bifilamentares de DNA idênticas à molécula bifilamentar parental. Um ciclo é composto por essas três etapas, levando a uma replicação única do segmento entre os dois primers.
FIGURA 10.3 A reação da cadeia de polimerase copia rapidamente uma sequência de DNA-alvo. A. DNA bifilamentar que contém a sequência-alvo. B. Dois primers escolhidos ou sintetizados apresentam sequências complementares aos sítios de ligação do primer nas extremidades 3′ do gene-alvo nos dois filamentos. Os filamentos são separados por meio de aquecimento, em seguida são resfriados para possibilitar que os dois primers pareiem com os sítios de ligação de primers. Em conjunto, os primers assim flanqueiam a sequência-alvo. C. Após a elevação da temperatura, a polimerase Taq em seguida sintetiza o primeiro conjunto de filamentos complementares por meio da adição dos quatro nucleotídios trifosfato que também estão na mistura da reação. Estes dois primeiros filamentos são de comprimento variável, tendo em vista que não apresentam um sinal de parada comum. Eles se estendem além das extremidades da sequência-alvo, conforme delineado pelos sítios de ligação de primers. D. Os dois duplexes são novamente aquecidos, expondo quatro sítios de ligação. Após o resfriamento, os dois primers pareiam novamente com seus respectivos filamentos nas extremidades 3′ da região-alvo. E. Após a elevação da temperatura, a polimerase Taq sintetiza quatro filamentos complementares. Embora os filamentos-molde neste estágio sejam de comprimento variável, dois dos quatro filamentos recém-sintetizados a partir deles apresentam precisamente o comprimento da sequência-alvo desejada. Esse comprimento preciso é conquistado em virtude de cada um desses filamentos ter início no sítio de ligação do primer, em uma extremidade da sequência-alvo, e prosseguir até sair do molde, na outra extremidade da sequência. F. O processo é repetido por muitos ciclos, a cada vez criando mais moléculas bifilamentares de DNA idênticas à sequência-alvo.
Após a replicação do segmento entre os dois primers ser concluída, os
dois novos duplexes são desnaturados pelo calor mais uma vez, para gerar moldes unifilamentares, e um segundo ciclo de replicação é realizado por meio da redução da temperatura na presença de todos os componentes necessários para que a polimerização produza quatro duplexes idênticos. Ciclos repetidos de desnaturação, pareamento e síntese resultam em um aumento exponencial no número de segmentos replicados. Tendo em vista que um ciclo típico dura 5 minutos, a amplificação até um bilhão de vezes pode ser prontamente realizada em 2,5 h. Conforme você verá posteriormente nesta seção, os produtos da PCR podem ser adicionalmente amplificados por meio de sua clonagem em células bacterianas.
A PCR é uma técnica poderosa que é utilizada rotineiramente para isolar
genes específicos ou fragmentos de DNA quando existe um conhecimento anterior a respeito da sequência a ser amplificada. De fato, se todas as sequências correspondentes aos primers estiverem presentes apenas uma vez no genoma e estiverem suficientemente próximas, o único segmento de DNA que pode ser amplificado é aquele entre os dois primers. A PCR é uma técnica muito sensível, com diversas aplicações em biologia. Ela pode amplificar sequências-alvo que estão presentes em números de cópias extremamente baixos em uma amostra, desde que sejam utilizados primers específicos para essa sequência rara. Por exemplo, investigadores criminais podem amplificar segmentos de DNA humano a partir das poucas células foliculares que circundam um único fio de cabelo retirado. Se os investigadores optarem por realizar isso, eles podem amplificar o gene da insulina a partir dessa amostra de DNA utilizando a sua localização precisa no cromossomo 11 para desenhar primers flanqueadores para a PCR direta.