Introdução à Genética
Reparo pós-replicação | Reparo de malpareamento
CONCEITO-CHAVE O reparo por excisão de nucleotídio é uma via versátil que reconhece e corrige as
lesões do DNA amplamente em virtude dos danos causados por UV e, ao fazer isso, alivia as
forquilhas de replicação e os complexos de transcrição parados. Pacientes com xeroderma
pigmentoso e síndrome de Cockayne são sensíveis à luz UV em virtude de mutações importantes em
proteínas de reparo por excisão de nucleotídio que reconhecem ou reparam as bases dani cadas.
Reparo pós-replicação | Reparo de malpareamento Você aprendeu na primeira metade deste capítulo que ocorrem muitos erros na replicação do DNA. De fato, a taxa de erro é de aproximadamente 10–5. A correção por meio da função de revisão 3′ para 5′ da polimerase replicativa reduz a taxa de erro para menos de 10–7. A principal via que corrige os erros replicativos remanescentes é denominada reparo de malpareamento. Essa via de reparo reduz a taxa de erro para menos de 10–9 ao reconhecer e reparar as bases malpareadas e as pequenas alças causadas pela inserção e pela deleção de nucleotídios (indels) no período da replicação. A partir desses valores, você pode verificar que as mutações que levam à perda da via de reparo de malpareamento poderiam aumentar a frequência de mutações em 100 vezes. De fato, a perda do reparo de malpareamento também está associada a formas hereditárias de câncer de cólon.
Os sistemas de reparo de malpareamento devem realizar no mínimo três
coisas:
1. Reconhecer pares de bases malpareados. 2. Determinar qual base é a incorreta no malpareamento. 3. Excisar a base incorreta e realizar a síntese de reparo.
FIGURA 16.22 A via de reparo por excisão de nucleotídio é ativada quando adutos volumosos ou múltiplas bases danificadas são reconhecidos em regiões não transcritas (GG-NER) ou transcritas (TC-NER) do genoma. Essas duas vias são iniciadas por diferentes eventos e complexos distintos, conforme demonstrado na primeira etapa. Ambos os complexos atuam para atrair o mesmo complexo TFIIH (Etapa 2). Os complexos de reconhecimento são removidos na Etapa 3 (não demonstrada). Nas etapas 4 a 6, um complexo multiproteico excisa diversas bases e as ressintetiza utilizando o filamento oposto como molde. Ver texto para detalhes.
A maior parte do que se sabe a respeito do reparo de malpareamento tem origem em décadas de análises genéticas e bioquímicas com a utilização da
bactéria-modelo E. coli (ver Organismo-modelo, E. coli, no Capítulo 5). Especialmente digna de nota foi a reconstituição do sistema de reparo de malpareamento em tubo de ensaio no laboratório de Paul Modrich. A conservação de muitas das proteínas de reparo de malpareamento, de bactérias e leveduras até seres humanos, indica que essa via é antiga e importante em todos os organismos vivos. Recentemente, o sistema de reparo de malpareamento humano também foi reconstituído em tubo de ensaio no laboratório de Modrich. A capacidade de estudar os detalhes da reação estimulará futuros estudos sobre a via humana. Entretanto, por enquanto enfocaremos o sistema muito bem-
caracterizado de E. coli (Figura 16.23).
A primeira etapa no reparo de malpareamento é o reconhecimento do dano no
DNA recém-replicado pela proteína MutS. A ligação dessa proteína às distorções na dupla-hélice de DNA causadas por bases incompatíveis inicia a via de reparo de malpareamento ao atrair três outras proteínas para o sítio da lesão (MutL, MutH e UvrD [não demonstrada]). A proteína-chave é MutH, que realiza a função crucial de cortar o filamento que contém a base incorreta. Sem essa capacidade de discriminação entre as bases corretas e incorretas, o sistema de reparo de malpareamento não poderia determinar qual base deve ser excisada para evitar o surgimento de uma mutação. Se, por exemplo, ocorre malpareamento entre G-T como um erro de replicação, como o sistema consegue determinar se G ou T está incorreta? Ambas são bases normais no DNA. Mas os erros de replicação produzem pareamentos errados no filamento recém-sintetizado e, assim, o sistema de reparo de malpareamento substitui a base naquele filamento.
Como o reparo de malpareamento distingue o filamento recém-sintetizado do
antigo? Relembre do Capítulo 12 que as bases citosina com frequência são metiladas em eucariotos e que essa marca epigenética é propagada do filamento parental para o filho logo após a replicação. O DNA de E. coli também é metilado, mas os grupos metil relevantes para o reparo de malpareamento são adicionados às bases adenina. Para distinguir o filamento-molde antigo do filamento recém-sintetizado, o sistema de reparo bacteriano se aproveita de um atraso na metilação da sequência a seguir:
5′-G-A-T-C-3′
3′-C-T-A-G-5′
A enzima responsável pela metilação é a adenina metilase, que cria a 6-metiladenina em cada filamento. Entretanto, a adenina metilase necessita de diversos minutos para reconhecer e modificar os trechos de GATC recém-sintetizados. Nesse intervalo, a proteína MutH corta o sítio de metilação no filamento que contém A ainda não metilada. Esse sítio pode estar a diversas centenas de pares de bases de distância da base erroneamente pareada. Após o corte no sítio, a proteína UrvD se liga ao corte e utiliza a sua atividade de helicase para desenrolar o DNA. Uma proteína de ligação a filamento único protetora reveste o filamento parental desenrolado, enquanto a parte do novo filamento entre o pareamento errado e o corte é excisada.
FIGURA 16.23 Modelo em relação ao reparo de malpareamento em E. coli. O DNA é metilado (Me) no resíduo A na sequência GATC. A replicação do DNA produz um dúplex hemimetilado que existe até que a metilase consiga modificar o filamento recém-sintetizado. O sistema de reparo de malpareamento realiza quaisquer correções necessárias com base na sequência observada no filamento metilado (modelo original). MutS, MutH e MutL são proteínas.
Muitas das proteínas no reparo de malpareamento de E. coli são conservadas
no reparo de malpareamento humano. No entanto, como os eucariotos reconhecem e reparam apenas o filamento recém-sintetizado ainda é desconhecido. O problema causa perplexidade nos organismos sem a maior parte da metilação do DNA, ou completamente desprovidos dela, tais como leveduras, Drosophila e C. elegans. Um modelo popular propõe que a discriminação tenha por base o reconhecimento de extremidades livres 3′ que caracterizam os filamentos de replicação contínua e descontínua recém-sintetizados.
Um alvo importante do sistema de malpareamento humano são as curtas
sequências repetidas, que podem ser expandidas ou deletadas na replicação pelo
mecanismo de malpareamento descrito anteriormente (ver Figura 16.8). Mutações em alguns dos componentes dessa via demonstraram ser responsáveis por diversas doenças humanas, especialmente cânceres. Existem milhares de repetições curtas (microssatélites) localizadas por todo o genoma humano (ver
Capítulo 4). Embora a maior parte delas esteja localizada em regiões não codificadoras (tendo em vista que a maior parte do genoma é não codificador), algumas estão localizadas em genes críticos para o crescimento e o desenvolvimento normais.
Portanto, pode-se prever que defeitos na via de reparo de malpareamento
humana tenham como consequência doenças muito graves. Essa previsão comprovou ser verdadeira, e um caso pontual é a síndrome denominada câncer colorretal não polipose hereditário (HNPCC), a qual, apesar de sua denominação, não é propriamente um câncer, mas aumenta o risco de câncer. Uma das predisposições hereditárias ao câncer mais comuns, a doença afeta uma em 200 pessoas no mundo ocidental. Estudos demonstraram que o HNPCC resulta da perda do sistema de reparo de malpareamento, em grande parte em virtude de mutações herdadas em genes que codificam as contrapartes (e