Introdução à Genética
7.4 Visão geral da replicação do DNA
FIGURA 7.15 A DNA polimerase catalisa a reação de alongamento da cadeia. A energia para a reação advém da quebra da ligação fosfato de alta energia do substrato trifosfato.
7.4 Visão geral da replicação do DNA
Na medida em que a DNA pol III avança, a dupla-hélice é continuamente desenrolada à frente da enzima para expor comprimentos adicionais de filamentos de DNA simples que
atuarão como moldes (Figura 7.16). A DNA pol III atua como a forquilha de replicação, a zona na qual a dupla-hélice está desenrolando. Entretanto, tendo em vista que a DNA polimerase sempre adiciona nucleotídios na extremidade 3′ em crescimento, apenas um dos dois filamentos antiparalelos pode atuar como molde para a replicação na direção da forquilha de replicação. Em relação a esse filamento, a síntese pode ocorrer de modo contínuo e suave na direção da forquilha; o novo filamento no sentido líder, é denominado filamento contínuo (no sentido líder, leading).
A síntese do outro filamento também ocorre na extremidade em crescimento 3′, mas essa
síntese ocorre no sentido “errado”, tendo em vista que, em relação a esse filamento, o
sentido 5′ para 3′ da síntese está longe da forquilha de replicação (ver Figura 7.16). Conforme veremos, a natureza do maquinário de replicação requer que a síntese de ambos os filamentos ocorra na região da forquilha de replicação. Portanto, a síntese que se afasta da forquilha de crescimento não pode prosseguir por muito tempo. Ela tem de ocorrer em segmentos curtos: a polimerase sintetiza um segmento, em seguida se movimenta de volta para a extremidade 5′ do segmento, onde a forquilha em crescimento expôs o novo molde e inicia o processo novamente. Esses trechos curtos (1.000 a 2.000 nucleotídios) de DNA recém-sintetizado são denominados fragmentos de Okazaki.
FIGURA 7.16 A forquilha de replicação se movimenta na síntese de DNA na medida em que a dupla-hélice é continuamente desenrolada. A síntese do filamento contínuo (leading) pode prosseguir suavemente sem interrupções na direção do movimento da forquilha de replicação, mas a síntese do filamento descontínuo (lagging) deve prosseguir na direção oposta, para longe da forquilha de replicação.
Outro problema na replicação do DNA surge em virtude de a DNA polimerase conseguir
estender uma cadeia, mas não iniciar uma cadeia. Portanto, a síntese do filamento contínuo e de cada fragmento de Okazaki tem de ser iniciada por um primer, ou uma cadeia curta de nucleotídios, que se liga ao filamento-molde para formar um segmento de ácido nucleico
dúplex. O primer na replicação do DNA pode ser observado na Figura 7.17. Os primers são sintetizados por um conjunto de proteínas denominado primossomo, do qual um componente central é uma enzima denominada primase, um tipo de RNA polimerase. A primase sintetiza um trecho curto (aproximadamente 8 a 12 nucleotídios) de RNA complementar a uma região específica do cromossomo. No filamento contínuo, é necessário apenas um primer inicial, tendo em vista que, após a ação do primer inicial, o filamento de DNA em crescimento atua como primer para a adição contínua. Entretanto, no filamento descontínuo, cada fragmento de Okazaki necessita de seu próprio primer. A cadeia de RNA que compõe o primer em seguida é estendida como uma cadeia de DNA pela DNA pol III.
Uma DNA polimerase diferente, pol I, remove os primers de RNA com sua atividade de
exonuclease 5′ para 3′ e preenche as lacunas com sua atividade de polimerase 3′ para 5′. Conforme mencionado anteriormente, a pol I é a enzima originalmente purificada por Kornberg. Outra enzima, a DNA ligase, une a extremidade 3′ do DNA que preencheu a lacuna à extremidade 5′ do fragmento de Okazaki dowstream. O novo filamento assim formado é denominado filamento descontínuo (lagging). A DNA ligase une os fragmentos do DNA ao catalisar a formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 5′-fosfato de um fragmento e o grupo 3′-OH adjacente de outro fragmento.
Um marco da replicação do DNA é a sua precisão, também denominada fidelidade: em
geral, é inserido menos de um erro por 1010 nucleotídios. Parte do motivo da precisão da replicação do DNA é que ambas a DNA pol I e a DNA pol III possuem atividade de exonuclease 3′ para 5′, que atua como uma função de “revisão” por meio da excisão de bases incorretamente inseridas.
Em virtude da importância da revisão, veremos mais de perto como ela atua. Um par de
bases incorretamente pareado ocorre quando a atividade da polimerase 5′ para 3′ insere, por exemplo, uma A em vez de uma G para parear com uma C. A adição de uma base incorreta com frequência ocorre em virtude de um processo denominado tautomerização. Cada uma das bases no DNA pode se apresentar em uma de diversas formas, denominadas tautômeros, que são isômeros que diferem nas posições de seus átomos e nas ligações entre os átomos. As formas estão em equilíbrio. A forma ceto de cada base normalmente está presente no DNA, mas em casos raros, uma base pode ser alterada para a forma imino ou enol. As formas imino e enol podem parear com a base errada, formando um par errôneo
(Figura 7.18). Quando uma C é alterada para a sua forma rara imino, a polimerase adiciona
uma A em vez de uma G (Figura 7.19). Felizmente, tal erro normalmente é detectado e removido pela atividade de exonuclease 3′ para 5′. Após a remoção da base incorreta, a polimerase tem outra chance de adicionar a base G complementar correta.
Conforme seria esperado, linhagens mutantes sem uma exonuclease 3′ para 5′ funcional
apresentam uma taxa mais alta de mutação. Além disso, tendo em vista que a primase não apresenta uma função de revisão, o primer de RNA apresenta maior probabilidade de conter erros do que o DNA. A necessidade de manter a alta fidelidade da replicação é um motivo pelo qual os primers de RNA nas extremidades dos fragmentos de Okazaki precisam ser removidos e substituídos por DNA. Apenas após a remoção do primer de RNA a DNA pol I catalisa a síntese do DNA para substituir o primer. O assunto do reparo
do DNA será comentado em detalhes no Capítulo 16.
FIGURA 7.17 Etapas na síntese do filamento descontínuo (lagging). A síntese de DNA prossegue por meio da síntese contínua no filamento leading e da síntese descontínua no filamento lagging.
FIGURA 7.18 Pareamento de bases normal, em comparação com o de bases incorretamente pareadas. A. Pareamento entre as formas normais (ceto) das bases. B. Formas tautoméricas raras de bases resultam em pareamentos incorretos.
CONCEITO-CHAVE A replicação do DNA ocorre na forquilha de replicação, onde a dupla-hélice está desenrolando e
os dois lamentos estão se separando. A replicação do DNA prossegue continuamente na direção da forquilha de
replicação em deselicoidização no lamento contínuo. O DNA é sintetizado em segmentos curtos, na direção para