Introdução à Genética
Mapeamento de cromossomos de fagos por meio da utilização de cruzamentos de fagos
FIGURA 5.25 A infecção por um fago único redireciona o maquinário da célula para a produção da progênie de fagos, que são liberados na lise.
Mapeamento de cromossomos de fagos por meio da
utilização de cruzamentos de fagos
Dois genótipos de fagos podem ser cruzados em grande parte do mesmo modo que cruzamos organismos. Um cruzamento de fagos pode ser ilustrado por meio de um cruzamento de fagos T2 originalmente estudados por Alfred Hershey. Os genótipos das duas linhagens parentais no cruzamento de Hershey foram h— r+ × h+ r—. Os alelos correspondem aos fenótipos a seguir:
h— : consegue infectar duas linhagens diferentes de E. coli (as quais podemos denominar linhagens 1 e 2)
FIGURA 5.26 Por meio de infecção repetida e produção de progênie de fagos, um único fago produz uma área clara, ou placa, na camada opaca de células bacterianas. (D. Sue Katz, Rogers State University, Claremore, OK.)
h+ : consegue infectar apenas a linhagem 1 r— : lisa as células rapidamente, produzindo, assim, placas grandes r+: lisa as células lentamente, produzindo placas pequenas
Para realizar o cruzamento a linhagem 1 de E. coli é infectada com ambos os genótipos parentais do fago T2. Esse tipo de infecção é denominado
infecção mista ou infecção dupla (Figura 5.27). Após um período de incubação apropriado, o lisado de fagos (que contém os fagos da progênie) é analisado por meio da sua difusão sobre uma camada de bactérias composta por uma mistura das linhagens 1 e 2 de E. coli. Quatro tipos de
placas são distinguíveis em seguida (Figura 5.28). As placas grandes indicam lise rápida (r—) e as placas pequenas indicam lise lenta (r+). As placas de fagos com o alelo h— infectarão ambas os hospedeiros, formando uma placa clara, enquanto as placas de fagos com o alelo h+ infectarão apenas um hospedeiro, formando uma placa turva. Portanto, os quatro genótipos podem ser facilmente classificados como parentais (h— r+ e h+ r—) e recombinantes (h+ r+ e h— r—) e uma frequência de recombinantes pode ser calculada como segue:
Se presumirmos que os cromossomos recombinantes de fagos são lineares, então crossovers únicos produzem produtos recíprocos viáveis. Entretanto, os cruzamentos de fagos estão sujeitos a algumas complicações analíticas. Primeiramente, diversas rodadas de troca podem ocorrer no hospedeiro: um recombinante produzido logo após a infecção pode sofrer recombinação adicional na mesma célula ou em ciclos de infecção posteriores. Em segundo lugar, a recombinação pode ocorrer entre fagos geneticamente semelhantes, bem como entre tipos diferentes. Portanto, se considerarmos P1 e P2 uma referência aos genótipos parentais gerais, podem ocorrer cruzamentos de P 1 × P1 e P2 × P2, além de P1 × P2. Em virtude de ambos esses motivos, os recombinantes de cruzamentos de fagos são uma consequência de uma população de eventos, em vez de eventos definidos de troca de etapa única. Não obstante, se restante for constante, o cálculo da FR representa um índice válido da distância de mapa nos fagos.
FIGURA 5.27.
FIGURA 5.28 — Estes fenótipos de placas foram produzidos pela progênie do cruzamento h
r+ + — × h r. Quatro fenótipos de placas podem ser diferenciados, representando dois tipos parentais e dois recombinantes. (De G. S. Stent, Molecular Biology of Bacterial Viruses. Direitos autorais 1963 por W. H. Freeman and Company.)
Tendo em vista que números astronomicamente grandes de fagos podem
ser utilizados em análises de recombinação de fagos, podem ser detectados eventos de crossover muito raros. Na década de 1950, Seymour Benzer utilizou os referidos eventos de crossover raros para mapear os sítios mutantes no gene rII do fago T4, um gene que controla a lise. Em relação a diferentes alelos mutantes rII que surgem espontaneamente, o sítio mutante normalmente está em diferentes posições no gene. Portanto, quando dois mutantes rII diferentes são cruzados, podem ocorrer alguns crossovers raros entre os sítios mutantes, produzindo recombinantes do tipo selvagem, conforme demonstrado aqui:
Na medida em que a distância entre dois sítios mutantes aumenta, um referido evento de crossover é mais provável. Portanto, a frequência de recombinantes rII+ é uma medida dessa distância no gene. (O produto recíproco é um mutante duplo e indistinguível dos parentais.)
Benzer utilizou uma abordagem inteligente para detectar os muito raros
recombinantes rII+. Ele fez uso do fato de que os mutantes rII não infectarão uma linhagem de E. coli denominada K. Portanto, ele realizou o cruzamento rII × rII em outra linhagem e em seguida plaqueou o lisado de fagos em uma camada da linhagem K. Apenas os recombinantes rII+ formarão placas nessa camada. Esse modo de observar um evento genético raro (nesse caso, um recombinante) é um sistema seletivo: apenas o evento raro desejado consegue produzir um determinado desfecho visível. Contrariamente, uma triagem é um sistema no qual grandes números de indivíduos são analisados visualmente para buscar a “agulha em um palheiro” rara.